趙曉菊 張奕婷 劉 佳 劉 洋 唐中華*

（1. 大慶師范學(xué)院生物工程學(xué)院，大慶 163712；2. 東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，哈爾濱 150040）

目前，全球20%的灌溉土地受到土壤鹽漬化的影響且范圍不斷擴(kuò)大，嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境［1］，鹽脅迫除了影響植物生長(zhǎng)發(fā)育外，對(duì)細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等細(xì)胞成分及次生代謝物的影響是及其復(fù)雜的［2］。一氧化氮（nitric oxide，NO）作為植物體內(nèi)一種信號(hào)分子，在種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育和衰老等過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用，尤其是在逆境響應(yīng)方面是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，已有研究顯示低濃度的NO 通過(guò)調(diào)節(jié)代謝過(guò)程提高植物耐鹽性，但其調(diào)控機(jī)理尚不清晰［3-5］。藥用植物長(zhǎng)春花（Catharanthus roseus）因具有抗癌活性的生物堿（terpenoid indole alkaloids，TIAs）類，作為T(mén)IAs調(diào)控研究的模式植物而受到廣泛關(guān)注［6～8］，其次生代謝產(chǎn)物除TIAs外還含有大量的酚類化合物［9～10］，酚類物質(zhì)的積累，可能影響包括TIAs 在內(nèi)的其他次生代謝途徑［11］。外源施加氮素和鹽脅迫下長(zhǎng)春花體內(nèi)TIAs 含量均有提升［12～13］，對(duì)于同樣條件下酚類化合物種類和含量變化鮮有報(bào)道，因此，對(duì)長(zhǎng)春花酚類化合物代謝調(diào)控研究具有理論和實(shí)踐意義。

酚類是苯環(huán)上至少含有一個(gè)酚羥基有機(jī)化合物的統(tǒng)稱，在植物中含量極低但功效顯著，具有顯著的抗氧化活性［14］。根據(jù)酚類的化學(xué)結(jié)構(gòu)主要分成3 類：①C6C1 碳骨架化合物，例如苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸和水楊酸（SA）；②C6C3 碳骨架化合物，如對(duì)香豆酸、肉桂酸和阿魏酸；③C6C3C6 碳骨架化合物（黃酮類和異黃酮類化合物），如花青素、黃酮和黃酮醇等［11］。植物中酚類化合物有多種合成途徑，主要有莽草酸途徑和乙酸—丙二酸途徑兩種，高等植物大多通過(guò)莽草酸途徑將初生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為次生物質(zhì)［15］，苯丙氨酸作為莽草酸途徑的樞紐物質(zhì)，是大多數(shù)酚類化合物及其聚合物的合成前體［16］。

酚類化合物作為一種植物次生代謝產(chǎn)物，種類繁多，對(duì)外界環(huán)境響應(yīng)變化迅速，代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，調(diào)控過(guò)程受到多種因素影響。目前，從代謝組水平進(jìn)行測(cè)定和分析是研究酚類化合物重要且有效的手段。近年來(lái)，鹽脅迫下酚類代謝物響應(yīng)和調(diào)控在花生［17］、草莓［18］、鼠尾草［19］等經(jīng)濟(jì)作物中相繼開(kāi)展研究。在對(duì)長(zhǎng)春花的研究中，有從代謝組和轉(zhuǎn)錄組水平聯(lián)合分析乙烯和茉莉酸介導(dǎo)調(diào)控酚類代謝機(jī)制進(jìn)行了探討［20］，對(duì)酚類化合物受光調(diào)控在光形態(tài)建成過(guò)程中發(fā)揮作用展開(kāi)研究［21］。前期對(duì)外源NO 參與鹽脅迫下長(zhǎng)春花種子萌發(fā)和生理代謝研究表明，鹽脅迫抑制長(zhǎng)春花種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，0.1 mmol˙L-1SNP 有效緩解鹽脅迫對(duì)長(zhǎng)春花種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，大于0.5 mmol˙L-1SNP加重鹽脅迫傷害［22］，結(jié)合形態(tài)表型差異觀察，本研究針對(duì)梯度濃度外源NO 供體SNP 處理鹽脅迫下長(zhǎng)春花植株不同部位，利用靶向代謝組學(xué)方法，采用高效液相色譜—四級(jí)桿—飛行時(shí)間質(zhì)譜（LCESI-QTOF/MS）聯(lián)用技術(shù)，綜合分析酚類物質(zhì)的組成和差異性變化，揭示NO 和鹽脅迫下酚類物質(zhì)代謝的響應(yīng)，為酚類代謝調(diào)控和外源NO 提高植株耐鹽機(jī)理研究提供參考，并對(duì)鹽堿地開(kāi)發(fā)利用具有實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

選取顆粒飽滿的長(zhǎng)春花種子（粉紅花）用10%的NaClO 消毒后播種于濕潤(rùn)環(huán)境中，待長(zhǎng)出真葉后移栽至裝有蛭石的育苗盆中，定期澆灌1/2 的Hogland’s 營(yíng)養(yǎng)液（pH=6.0），放置人工氣候箱中培養(yǎng)，光照時(shí)間（日/夜12 h/12 h），溫度（日/夜25℃/18℃），濕度為60%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)相同的長(zhǎng)春花幼苗，按試驗(yàn)編號(hào)0#、1#、2#、3#、4#、5#，依次為：CK、ST（50 mmol·L-1NaCl）、ST+50 μmol·L-1SNP、ST+75 μmol·L-1SNP、ST+100 μmol·L-1SNP、ST+125 μmol·L-1SNP，每隔3 d 澆灌處理1 次，連續(xù)3 次。于40 d 后分別取不同處理下長(zhǎng)春花植株的根、莖、葉和花，-70℃冰凍保存待測(cè)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理與提取

長(zhǎng)春花不同部位組織樣品，加冷凍鋼珠在30 Hz下研磨（MM400，Retsch）1 min。稱取50 mg 的粉末，1 mL 70%甲醇（含0.1 mg·L-1利多卡因作為內(nèi)標(biāo)）4℃提取過(guò)夜，期間渦旋3 次。提取后，10 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，用微孔濾膜（SCAA-104，0.22 μm pore size；ANPEL）過(guò)濾，保存在進(jìn)樣瓶中用于色譜質(zhì)譜分析。

1.3.2 LC-MS分析［23］

色譜條件：流動(dòng)相A 為水（含0.04%的乙酸），流動(dòng)相B 為乙腈（0.04%的乙酸）；梯度洗脫程序?yàn)椋?～20 min，5%B～95%B；20～22.1 min：95%B～5%B；22.1～28 min：5%B～5%B；流速為0.5 mL·min-1；柱溫保持40℃；進(jìn)樣量為5 μL。分離的樣品接著進(jìn)入ESI-QTOF/MS（Agilent 6520 QTOF/MS）進(jìn)行質(zhì)譜分析。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)時(shí)的參數(shù)設(shè)置為：氮?dú)猓?0 psi；干燥器，10 L·min-1，350℃；毛細(xì)管電壓，3500 V；碎裂電壓，135 V。掃描范圍為50～1 000 m·Z-1。ESI正離子模式下進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品3 次重復(fù)，得到絕對(duì)峰面積（peak ar?ea）數(shù)據(jù)歸一化處理后，對(duì)樣品進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），采用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和顯著性分析，應(yīng)用HemI 軟件和GraphPad Prism 5.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO處理鹽脅迫下長(zhǎng)春花中酚類化合物種類

針對(duì)長(zhǎng)春花根、莖、花和葉不同部位組織材料，結(jié)合總離子流色譜圖，檢出L-苯丙氨酸（L-Phe?nylalanine）和18種酚類物質(zhì)，其中，C6C1結(jié)構(gòu)酚類化合物5 種，C6C3 結(jié)構(gòu)酚類化合物5 種，C6C3C6結(jié)構(gòu)酚類化合物8種，具體種類和化學(xué)結(jié)構(gòu)式詳見(jiàn)圖1和表1。

2.2 NO處理鹽脅迫下長(zhǎng)春花中酚類化合物響應(yīng)

對(duì)上述鑒定的酚類化合物和L-苯丙氨酸進(jìn)行PCA 分析，借以反映在不同處理下長(zhǎng)春花根、莖、花、葉4個(gè)部位整體變化水平。

通過(guò)對(duì)酚類主成分Q 值的分析可以看出，鹽脅迫及施加外源NO 對(duì)長(zhǎng)春花根、花和葉酚類物質(zhì)無(wú)顯著變化，但在長(zhǎng)春花莖中酚類物質(zhì)變化規(guī)律明顯，即50 mmol˙L-1NaCl 脅迫（1#）下明顯高于對(duì)照組（0#），隨著在鹽脅迫中加入50、75、100、125μmol˙L-1SNP（2#、3#、4#、5#），酚類物質(zhì)隨總SNP濃度的增大而上升，但相對(duì)總含量仍低于對(duì)照和鹽脅迫下。

表1 長(zhǎng)春花中酚類化合物的名稱和結(jié)構(gòu)類型Table 1 The Compound name and types of phenolic compounds in C.roseus

從圖3A 長(zhǎng)春花根部酚類化合物聚類分析可以看出，正常對(duì)照與鹽脅迫歸為一類，而鹽脅迫基礎(chǔ)上施加SNP 歸為一類，由此說(shuō)明外源NO 對(duì)鹽脅迫下根部酚類化合物的積累有顯著影響。根部富集C6C1 類化合物主要包括丁香酸、沒(méi)食子酸和香草酸等，C6C3 類有對(duì)羥基苯甲酸和肉桂酸等，所以，從整體上看，根部酚類物質(zhì)積累以小分子酚酸類化合物為主。隨外源SNP 濃度增加（50～125μmol˙L-1），肉桂酸和沒(méi)食子酸相對(duì)含量下降，對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸和香草酸相對(duì)含量上升。C6C3C6 類槲皮素在鹽脅迫和施加外源SNP 后均呈下降趨勢(shì)，根中的槲皮素可能在NO 對(duì)鹽脅迫的緩解效應(yīng)中發(fā)揮一定作用。

莖和根中酚類化合物聚類分析表現(xiàn)一致（見(jiàn)圖3A～B），即對(duì)照和鹽脅迫歸一類，施加SNP 歸一類。莖中酚類化合物積累以小分子酚酸類化合物為主，如丁香酸、原兒茶酸、綠原酸等，也包含C3C6C3 類化合物柚皮素和染料木素。這些化合物在鹽脅迫下施加低濃度NO（ST+50 μmol·L-1SNP，2#）積累顯著，且隨著NO 濃度增大呈下降趨勢(shì)。在鹽脅迫下莖中積累山奈酚、槲皮苷和木犀草苷C3C6C3黃酮類化合物，對(duì)抵御鹽脅迫起到一定作用（見(jiàn)圖3B）。

葉片中富集的酚類化合物有原兒茶酸、綠原酸、楊梅苷、蘆丁等，這些化合物在鹽脅迫下施加高濃度NO（ST+125 μmol·L-1SNP，5#）處理下，相對(duì)含量呈下降趨勢(shì)。在鹽脅迫下，葉片中阿魏酸和對(duì)香豆酸含量顯著增加，可能與葉片中酚類對(duì)鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)（見(jiàn)圖3C）。

花中主要積累C3C6C3類化合物，如木犀草苷和槲皮苷，在高濃度NO（ST+125 μmol·L-1SNP，5#）處理下含量增加明顯（見(jiàn)圖3D）。結(jié)合本試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)花的形態(tài)學(xué)變化初步觀察，鹽脅迫下花盤(pán)直徑較正常對(duì)照小，鹽脅迫會(huì)造成長(zhǎng)春花的顏色變淺，試驗(yàn)選取的粉紅色長(zhǎng)春花有變?yōu)榉郯咨ǎ谕庠碨NP作用下更偏向白色。ST+75μmol·L-1SNP（3#）處理下，長(zhǎng)春花植株未開(kāi)花，在其葉片中出現(xiàn)了開(kāi)花植株葉片中沒(méi)有的丁香酸和香草酸，在未開(kāi)花植株的根、莖、葉中綠原酸相對(duì)含量最高，Lavee 等報(bào)道了橄欖樹(shù)結(jié)果的枝條在開(kāi)花誘導(dǎo)期綠原酸水平較高，而沒(méi)有結(jié)果的枝條綠原酸含量較低［24］，酚類不僅影響花的顏色，與植物開(kāi)花關(guān)系密切。

2.3 L-苯丙氨酸在長(zhǎng)春花不同器官中的分布

本試驗(yàn)中，在莖（見(jiàn)圖4B）和葉（見(jiàn)圖4C）中酚類化合物合成前體L-苯丙氨酸的相對(duì)含量大于根（見(jiàn)圖4A）和花（見(jiàn)圖4D）中含量。而莖中L-苯丙氨酸的相對(duì)含量在鹽脅迫下（1#）高于對(duì)照組（0#），且隨外源NO濃度增高而下降（見(jiàn)圖4），這與莖中的酚類相對(duì)總含量隨NO 濃度增高而上升一致（見(jiàn)圖2）。鹽脅迫條件下，莖中酚類化合物和合成前體L-苯丙氨酸相對(duì)含量均增加，間接證明脅迫條件下，作為防御物質(zhì)的酚類化合物生成主要依靠其合成前體L-苯丙氨酸的增加來(lái)促進(jìn)。

圖5 展示長(zhǎng)春花不同部位L-苯丙氨酸相對(duì)總含量情況，可以看出在鹽脅迫下施加50 μmol·L-1SNP（2#）處理下相對(duì)總含量最高，隨著NO 濃度增加而下降。從酚類化合物和其前體L-苯丙氨酸相對(duì)含量來(lái)看，莖和葉中較高，同時(shí)酚類物質(zhì)種類也較多，長(zhǎng)春花莖和葉適合作為研究酚類化合物的選取材料。

3 討論

本試驗(yàn)檢測(cè)出長(zhǎng)春花不同部位18種酚類化合物，其中C6C1 類5 種，C6C3 類5 種，C6C3C6 類8種，與前人對(duì)長(zhǎng)春花酚類化合物綜述和研究相比較［11，20］，與本文檢測(cè)主要酚類物質(zhì)相似，主要相同的有C6C1 類的香草酸、丁香酸、沒(méi)食子酸；C6C3類的綠原酸、阿魏酸、肉桂酸、對(duì)香豆酸；C6C3C6類中的木犀草苷、柚皮素、楊梅苷、槲皮素和山柰酚。本試驗(yàn)鑒定的酚類種類少于報(bào)道數(shù)量，主要由于本試驗(yàn)采用針對(duì)少數(shù)已知代謝物定性和定量的靶向分析技術(shù)，另外酚類化合物不僅在不同品種間存在差異，在不同植物組織之間代謝物含量也存在較大差異，代謝物對(duì)外界條件響應(yīng)迅速，脅迫處理?xiàng)l件和時(shí)間的不同也是造成差異的原因。

運(yùn)用PCA 方法，脅迫條件下長(zhǎng)春花根、葉和花中酚類相對(duì)總含量差異并不顯著，而莖中酚類化合物相對(duì)總含量在鹽脅迫顯著提升，莖是植物地下根部與葉片和花的連接部分，其中酚類物質(zhì)大量積累，不僅提高植株整體酚類化合物來(lái)抵御不良環(huán)境侵害，也便于向根、葉等部位進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。逆境脅迫下酚類物質(zhì)的積極響應(yīng)是植物一種防御功能，鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致酚類合成途徑中相應(yīng)基因水平上調(diào)，對(duì)鹽敏感品種上調(diào)幅度更大［25］，NO 信號(hào)對(duì)酚類代謝物緩解脅迫傷害中起到一定作用［26］。

長(zhǎng)春花在鹽和SNP 協(xié)同處理下，地下根部和地上莖部中聚類分析相似，正常對(duì)照和鹽脅迫歸為一類，施加SNP 歸為一類。SNP 作為外源NO 供體，其溶液釋放NO 速度通常在6 h內(nèi)完成，從根際澆灌處理可誘導(dǎo)植物組織內(nèi)源NO 的積累［27］，根和莖中酚類物質(zhì)以小分子酚酸為主，對(duì)鹽脅迫和施加SNP響應(yīng)更為敏感。

苯丙氨酸被認(rèn)為是植物酚類化合物代謝中的共同前體，通常用酚類化合物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶（PLA）來(lái)間接反映酚類物質(zhì)生成的速率［28］。在番茄（Solanum lycopersicum）［29～30］、白楊（Populus tremula）［31］等植物中，常利用綜合組學(xué)的方法對(duì)苯丙氨酸通路展開(kāi)研究。本試驗(yàn)莖中L-苯丙氨酸相對(duì)含量隨著SNP 濃度的增大呈下降趨勢(shì)，與莖中酚類相對(duì)總含量趨勢(shì)相反，間接證明苯丙氨酸是酚類合成的前體。

4 結(jié)論

在鹽脅迫和外源NO 雙重作用下，長(zhǎng)春花不同部位酚類代謝物的響應(yīng)和積累不同，根和莖中以小分子酚酸類為主，花和葉中C3C6C3類為主。從聚類分析上看，根和莖對(duì)鹽脅迫及NO 處理響應(yīng)敏感，莖和葉中酚類物質(zhì)種類和相對(duì)含量較高，適合作為代謝組分析材料。目前雖然對(duì)植物酚類物質(zhì)代謝途徑已取得較大進(jìn)展，在不同處理?xiàng)l件和植物不同部位酚類代謝合成、轉(zhuǎn)運(yùn)途徑網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，需要進(jìn)一步結(jié)合多組學(xué)分析方法，從多層次和多因素相互作用的全局角度進(jìn)行整合研究，揭示和構(gòu)建酚類代謝過(guò)程。