張福臻 劉方惠 陳鑫欣 孫 靜 葛榮朝

（河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050024）

類受體蛋白激酶（Receptor-1ike protein kinas?es，RLKs）是在植物中發(fā)現(xiàn)的一類激酶，它與動(dòng)物中的受體蛋白激酶結(jié)構(gòu)相似［1～2］，能夠感知細(xì)胞傳導(dǎo)的信號(hào)，然后激活下游信號(hào)通路，起到信息傳遞的功能。自Walker 和Zhang 于1990 年首次從玉米中克隆獲得編碼類受體蛋白激酶的ZmPK1 基因至今［3］，越來越多的RLKs 被發(fā)現(xiàn)，它們結(jié)構(gòu)相似、功能各異。類受體蛋白激酶結(jié)構(gòu)一般包括胞外結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶域三部分。胞外結(jié)構(gòu)域識(shí)別信號(hào)分子，胞內(nèi)激酶域被激活后可催化下游分子從而完成信號(hào)的傳導(dǎo)。胞內(nèi)激酶域主要有絲氨酸/蘇氨酸激酶、酪氨酸激酶和組氨酸激酶等，胞外受體結(jié)構(gòu)域卻有很大的差異，因其結(jié)構(gòu)的不同RLKs 又分為很多亞家族：富含亮氨酸重復(fù)序列（Leucine-rich repeat，LRR）型、類表皮生長因子（Epidermal growth factor like）型、類凝集素（Lectinlike receptor kinases，LecRLK）型、類腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor）型、S-結(jié)構(gòu)域型（S-domain）和富含脯氨酸的類伸展素受體蛋白激酶（PERKs）等［4～6］。此外，缺少胞外受體結(jié)構(gòu)域的類受體蛋白激酶稱為類受體細(xì)胞質(zhì)激酶（Receptor-like cyto?plasmic kinases，RLCKs）［7～8］，缺乏胞內(nèi)激酶域的稱為類受體蛋白（Receptor-like proteins，RLPs）［9］。

LRR-RLKs 在植物基因組中是RLKs 的亞家族，其中擬南芥中已經(jīng)鑒別出200 多個(gè)成員，水稻中鑒別出300多個(gè)成員［10～12］。LRR-RLKs結(jié)構(gòu)的胞外LRR 序列是由亮氨酸和疏水性殘基組成的一個(gè)含24 個(gè)堿基的保守區(qū)域，它是具有β-折疊和α-螺旋構(gòu)成的“環(huán)”狀結(jié)構(gòu)。每個(gè)LRR-RLKs 結(jié)構(gòu)都有一個(gè)或多個(gè)不等的LRR，并且胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)也有所差異，這就決定了其功能的多樣性［4，13］。

分布廣泛的LRR-RLKs 在植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，可以通過多種信號(hào)途徑來參與植物的生長發(fā)育、抵御非生物脅迫等一系列生命活動(dòng)［14～24］。水稻抗白葉枯病基因Xa21、番茄抗病基因Cf9 和Cf2 均屬于LRR-RLKs，Xa21 蛋白有23 個(gè)LRR 單元，Cf9 蛋白有28 個(gè)LRR 單元，Cf2 蛋白有多達(dá)38 個(gè)LRR 單元［25～26］。Park 等發(fā)現(xiàn)LRRRLKs 基因OsGIRL1 對(duì)鹽脅迫和熱激反應(yīng)敏感，在伽瑪射線和滲透壓脅迫處理時(shí)其表達(dá)量明顯上升，且響應(yīng)各種激素SA、ABA 和JA 的處理［27］。盡管參與的分子機(jī)制仍是未知，但許多被研究的LRR-RLKs 基因在植物中響應(yīng)非生物脅迫的效果非常明顯［28］。

AtRPK1 是擬南芥中受干旱、高鹽及低溫誘導(dǎo)的富亮氨酸類受體蛋白激酶，在擬南芥對(duì)ABA 的早期識(shí)別中發(fā)揮重要作用。在發(fā)芽、生長和氣孔關(guān)閉期間，AtRPK1 基因的抑制表達(dá)將降低植物對(duì)脫 落 酸 識(shí) 別 的 敏 感 性［29～30］。水 稻 基 因OsRPK1（Os07g0602700）與擬南芥AtRPK1 基因高度同源，AtRPK1、OsRPK1基因過表達(dá)擬南芥與對(duì)照相比表現(xiàn)出對(duì)NaCl、ABA 的耐受性明顯降低。AtRPK1-RNAi 擬南芥比對(duì)照對(duì)NaCl、ABA 的耐受性明顯提高［31］。

OsRPK2（Os03g0756200）基因與OsRPK1 的跨膜域和激酶結(jié)構(gòu)域高度同源，編碼蛋白質(zhì)具有相似的結(jié)構(gòu)。OsRPK1 編碼1 084 個(gè)氨基酸在胞外有較復(fù)雜的受體結(jié)構(gòu)域，有15 個(gè)明顯的LRR 結(jié)構(gòu)。而OsRPK2 基因編碼的蛋白質(zhì)有1 049 個(gè)氨基酸，具有12 個(gè)LRR 結(jié)構(gòu)。為研究OsRPK2 基因?qū)χ参锟鼓婀δ艿挠绊?，本文主要?duì)OsRPK2基因過表達(dá)擬南芥純合體在不同逆境條件如鹽、干旱和ABA脅迫下的萌發(fā)率、幼苗根長、生理指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)，對(duì)其下游基因進(jìn)行篩選，以期揭示該基因的抗逆相關(guān)功能及其內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試水稻種子為日本晴（Oryza sativa L. cv.Nipponbare），擬南芥為哥倫比亞野生型，真核表達(dá)載體pCAMBIA1300、大腸桿菌E.coli DH5α、根癌農(nóng)桿菌GV3101均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 OsRPK2的擴(kuò)增與載體構(gòu)建

根據(jù)對(duì)其編碼序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)OsRPK2（Os03g0756200）基因并無內(nèi)含子序列。因此，采用CTAB 法提取水稻基因組DNA，用基因特異引物FP：GTCTAGACGTCGCCTCTCCACCTAC（酶切位點(diǎn)XbaⅠ）和RP：CGGTACCGCAGATATGGAAAGTT?GGCTCATTG（酶切位點(diǎn)KpnⅠ）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 體 系20 μL，含2×Prime STAR GC Buffer 10 μL、2.5mmol·L-1dNTPs 2 μL、200 ng·μL-1DNA模板2 μL、10 μmol·L-1引物各1 μL、2.5 U·μL-1PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.2 μL 和ddH2O 3.8 μL。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收、連接到T 載體（pEasy-Blunt Simple Cloning Kit，TransGen Biotech），轉(zhuǎn)入大腸桿菌，提取質(zhì)粒，用XbaⅠ/KpnⅠ雙酶切鑒定，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

提取p1300 和測(cè)序正確的pMD18-T-OsRPK2質(zhì)粒，分別用XbaⅠ/KpnⅠ雙酶切，將目的條帶電泳、切膠回收、連接，得到p1300：35S：OsRPK2，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，然后提取質(zhì)粒，XbaⅠ/KpnⅠ雙酶切鑒定陽性克隆。將鑒定正確的重組載體p1300：35S：OsRPK2轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101。

1.3 擬南芥的轉(zhuǎn)化及篩選

培養(yǎng)含有重組載體p1300：35S：OsRPK2 的農(nóng)桿菌GV3101，利用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，收獲種子后利用含25 μg·mL-1潮霉素的MS 培養(yǎng)基逐代篩選，直至獲得OsRPK2過表達(dá)擬南芥純合體植株。

1.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗逆性檢測(cè)

取3 個(gè)35S：OsRPK2 轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體株系和野生型擬南芥種子進(jìn)行萌發(fā)率檢測(cè)。種子經(jīng)4℃春化3 d 后消毒，用竹簽輕輕點(diǎn)播于含有10%PEG6000、2 μmol·L-1ABA 和120 mmol·L-1Na?Cl的MS培養(yǎng)基，以空白MS培養(yǎng)基作對(duì)照組，光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。檢測(cè)不同脅迫條件下種子萌發(fā)情況。

另外，選取35S：OsRPK2 轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體不同株系和野生型擬南芥種子鋪在MS 培養(yǎng)基，22℃光照培養(yǎng)箱中垂直培養(yǎng)。培養(yǎng)4 d 至完全萌發(fā)，再分別將生長狀態(tài)一致的幼苗移至含有10%PEG6000、2 μmol·L-1ABA 或150 mmol·L-1Na?Cl的MS培養(yǎng)基中，以空白MS培養(yǎng)基作對(duì)照組，豎直培養(yǎng)5 d，測(cè)量根長生長情況。

為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥成株的抗逆性，選取種子鋪于MS 培養(yǎng)基上，22℃光照培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)10 d，移栽至蛭石營養(yǎng)土中，苗室光照培養(yǎng)（16 h光照/8 h 黑暗），Hogland 營養(yǎng)液澆灌，培養(yǎng)2 周，蓮座葉片全長出即將抽薹時(shí)進(jìn)行整株脅迫處理。2 周不澆水作為干旱處理，澆灌200 mmol·L-1NaCl 作為鹽處理，脅迫處理12 d 后觀察擬南芥植株生長狀況。

1.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的生理檢測(cè)

1.5.1 葉綠素含量的測(cè)定

挑選MS 培養(yǎng)基上生長10 d 且長勢(shì)一致的擬南芥幼苗移栽入營養(yǎng)土中，正常光照培養(yǎng)約2 周后，分別用清水和200 mmol·L-1NaCl 溶液進(jìn)行澆灌，每4 d 澆灌1 次。10 d 后取地上部分進(jìn)行葉綠素含量測(cè)定［32］。取其主葉約0.1g，剪成約1cm 片段，置于離心管中，加入5 mL 80%丙酮，避光處理過夜（12 h 以上），用紫外可見分光光度計(jì)（PGEN?ERAL UV-1800S）測(cè)定663 nm 和645 nm 下的光密度值。以80%丙酮為空白對(duì)照，重復(fù)3次。

葉綠素a濃度（Ca），葉綠素b濃度（Cb）及葉綠素總的含量濃度計(jì)算公式如下：

葉綠素a濃度（mg·L-1）：Ca=12.7A663-2.69A645

葉綠素b濃度（mg·L-1）：Cb=22.9A645-4.68A663

葉綠素總的含量（mg·g-1）=（Ca+Cb）×提取液體積×稀釋倍數(shù)/樣品鮮重

1.5.2 丙二醛含量的測(cè)定

取轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體與野生型擬南芥幼苗，分別用清水和200 mmol·L-1NaCl 溶液進(jìn)行澆灌，第5 天時(shí)取材。稱重?cái)M南芥葉片，加入5 mL 10%三氯乙酸研磨成勻漿，勻漿液以4000 r·min-1離心10 min。吸取上清2 mL（對(duì)照取2 mL 蒸餾水），加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，混勻后于沸水浴中反應(yīng)15 min，迅速冷卻后再離心。取上清液測(cè)定532、600 和450 nm 波長下的吸光值。重復(fù)3次，代入以下計(jì)算公式：

式中：V為研磨液的體積，W為樣品鮮重［33］。

1.5.3 脯氨酸含量的檢測(cè)

取脯氨酸各濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液各2 mL，分別加2 mL 冰乙酸，3 mL 2.5%茚三酮溶液于試管中，沸水浴15 min，冷卻后于波長520 nm 測(cè)定其OD值，以O(shè)D 值為縱坐標(biāo)，脯氨酸濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定轉(zhuǎn)基因擬南芥脯氨酸含量，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品測(cè)定液中脯氨酸的含量，按下面公式計(jì)算樣品中脯氨酸含量：

式中：X為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的脯氨酸對(duì)應(yīng)濃度（μg·mL-1）［34］。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)，結(jié)果用軟件Statistica 6.0 進(jìn)行t 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

1.6 OsRPK2基因的過量表達(dá)對(duì)下游基因的影響

根據(jù)對(duì)擬南芥抗逆信號(hào)傳導(dǎo)通路的遺傳分析，選出了位于CDPK、MAPK、SOS 等信號(hào)通路下游 的 7 個(gè) 基 因 P5CS1（AT2G39800）、ADH1（AT1G77120）、FRY（AT2G37678）、SAD1（AT5G4887 0）、SOS3（AT5G24270）、RD29B（AT5G52300）、ESK（AT1G73140）［35］。剪取3個(gè)35S：OsRPK2擬南芥株系和野生型擬南芥的葉片，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以β-Actin 基因作為內(nèi)參，調(diào)整模板濃度，進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)，每個(gè)基因進(jìn)行3 次重復(fù)，qRT-PCR相關(guān)基因序列引物見表1。

表1 qRT-PCR引物堿基序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 OsRPK2基因的克隆及過表達(dá)載體的構(gòu)建

提取水稻日本晴幼苗葉片總DNA，用高保真Primer Star 酶 進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增 獲 得3 350 bp 的OsRPK2 基因全長序列（見圖1A），將目的片段回收、連接到pMD18-T 載體（見圖1B）。對(duì)測(cè)序正確的pMD18-T-OsRPK2 用XbaⅠ/KpnⅠ酶切獲得Os?RPK2 片段，連接獲得表達(dá)載體p1300：35S：Os?RPK2（見圖1C），將重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌備用。

2.2 OsRPK2轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得和鑒定

對(duì)野生型擬南芥和35S：OsRPK2 擬南芥3 個(gè)純合體株系OX L1、OX L2、OX L3 提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果表明3個(gè)株系均成功轉(zhuǎn)入了外源基因OsRPK2（見圖2A）。另外，提取野生型擬南芥和35S：OsRPK2 擬南芥3 個(gè)株系的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，RT-PCR 鑒定結(jié)果表明，Os?RPK2在3個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥中均成功實(shí)現(xiàn)過量表達(dá)（見圖2B）。

2.3 35S：OsRPK2轉(zhuǎn)基因株系的抗逆性分析

2.3.1 35S：OsRPK2轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)過程中的抗逆性

對(duì)野生型擬南芥和35S：OsRPK2轉(zhuǎn)基因擬南芥3個(gè)純合體株系種子萌發(fā)過程中的抗逆性檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照MS培養(yǎng)基上35S：OsRPK2轉(zhuǎn)基因擬南芥3 個(gè)株系和野生型擬南芥種子萌發(fā)率沒有明顯差異。在含有10%PEG6000 的MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，野生型擬南芥種子萌發(fā)率為97%，過表達(dá)擬南芥種子萌發(fā)率平均為66.4%，其中株系OX L1 的萌發(fā)率僅為54%，35S：OsRPK擬南芥株系的種子萌發(fā)率明顯低于野生型擬南芥。在含有2μmol·L-1ABA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，過表達(dá)擬南芥種子萌發(fā)率平均為69.8%，明顯低于野生型擬南芥。在含有120 mmol·L-1NaCl 的MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 后，3 個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的種子萌發(fā)率平均為74%，也明顯低于野生型擬南芥。通過對(duì)不同處理?xiàng)l件下的種子萌發(fā)率數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明，在受到PEG、ABA或NaCl脅迫后，OsRPK2過表達(dá)擬南芥株系的種子抗逆性均顯著低于野生型擬南芥（見圖3～4）。由此可見，OsRPK2 基因的過量表達(dá)會(huì)造成擬南芥植株表現(xiàn)出對(duì)各種非生物脅迫更加敏感的表型。

2.3.2 35S：OsRPK2轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的抗逆性

對(duì)野生型擬南芥和35S：OsRPK2轉(zhuǎn)基因擬南芥3 個(gè)株系的幼苗在含有10%PEG6000、2 μmol·L-1ABA 和150 mmol·L-1NaCl 的MS 培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，OsRPK2 過表達(dá)和野生型擬南芥在脅迫條件下根的生長均會(huì)受到抑制，不同脅迫條件對(duì)擬南芥的影響程度也表現(xiàn)不同。通過對(duì)各種脅迫對(duì)根生長造成的抑制情況進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，Os?RPK2 轉(zhuǎn)基因擬南芥根生長長度都要較野生型短，兩者根長長度表現(xiàn)出顯著差異（見圖5～6）。因此，OsRPK2 基因的過量表達(dá)會(huì)使得擬南芥植株在根的生長發(fā)育方面表現(xiàn)出對(duì)各種非生物脅迫更加敏感的表型。

2.3.3 35S：OsRPK2過表達(dá)擬南芥成株的抗逆性檢測(cè)

對(duì)野生型擬南芥和35S：OsRPK2 過表達(dá)擬南芥3個(gè)純合體株系進(jìn)行不同條件下的鹽、旱脅迫處理。在干旱處理12 d 后，過表達(dá)擬南芥幼苗的蓮座葉邊緣出現(xiàn)明顯的干黃，葉片萎蔫較嚴(yán)重，而野生型的葉片還較碧綠，而且過表達(dá)植株植株較矮，整體長勢(shì)明顯弱于野生型擬南芥。經(jīng)過200 mmol·L-1NaCl鹽脅迫12 d處理后，過表達(dá)擬南芥植株的葉片萎蔫程度較野生型更嚴(yán)重，株型較野生型矮小，幼嫩莖尖部位出現(xiàn)萎蔫，開花結(jié)果時(shí)間也較野生型擬南芥提前（見圖7）。由此可見，OsRPK2 基因的過量表達(dá)也會(huì)造成擬南芥成株對(duì)鹽、旱脅迫更加敏感。

2.3.4 35S：OsRPK2轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽脅迫后的生理指標(biāo)檢測(cè)

對(duì)生長狀況一致的野生型擬南芥和3 個(gè)35S：OsRPK2 過表達(dá)擬南芥株系鹽脅迫處理后進(jìn)行葉綠素、丙二醛以及脯氨酸含量的測(cè)定。葉綠素含量測(cè)定結(jié)果表明，脅迫后OsRPK2過表達(dá)擬南芥株系的葉綠素含量明顯低于野生型擬南芥（見圖8A）。丙二醛含量測(cè)定結(jié)果表明，在脅迫處理后OsRPK2 過表達(dá)擬南芥株系的丙二醛的增加量明顯大于野生型擬南芥（見圖8B），說明轉(zhuǎn)基因擬南芥植株所受損傷要比野生型擬南芥植株所受損傷更加嚴(yán)重。脯氨酸檢測(cè)結(jié)果表明，鹽脅迫后Os?RPK2 過表達(dá)擬南芥株系的脯氨酸上升量明顯低于野生型擬南芥（見圖8C）。

2.4 OsRPK2基因的過量表達(dá)對(duì)下游基因的影響

為研究OsRPK2 基因在敏鹽機(jī)制中所起的作用，選取了擬南芥中已知與植物耐鹽密切相關(guān)的7個(gè)基因ESK、SAD、RD29B、SOS3、ADH1、P5CS1 和FRY 基因進(jìn)行qRT-PCR 分析。檢測(cè)結(jié)果表明，Os?RPK2 過表達(dá)擬南芥植株與野生型擬南芥相比，SAD、SOS3 和FRY 基因的表達(dá)都明顯受到抑制，ESK、RD29B、ADH1 和P5CS1 基因的表達(dá)沒有明顯變化（見圖9）。

3 討論

植物體類受體蛋白激酶廣泛參與了植物體的抗逆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和病原反應(yīng)等途徑，對(duì)植物的抗逆性具有重要意義。類受體激酶的表達(dá)量上升往往會(huì)提高植物體的抗逆性，如擬南芥中類受體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因GsRLCK 的過量表達(dá)提高了 轉(zhuǎn) 基 因 植 株 對(duì) 鹽、干 旱 和ABA 的 耐 受 性［36］；PnLRR-RLK27 的過量表達(dá)提高了擬南芥對(duì)鹽、干旱、H2O2和ABA 的耐受性［37］；Soo 等從辣椒中分離獲得的CAMRP 基因的表達(dá)使擬南芥提高了耐鹽性和抗病性［38］。AtRPK1 是Hong 等在1997 年從擬南芥中克隆到的受逆境脅迫誘導(dǎo)的富含亮氨酸重復(fù)序列類受體蛋白激酶基因，在脫落酸、脫水、高鹽和低溫等脅迫環(huán)境下轉(zhuǎn)錄水平明顯增加［39］。OsRPK1 是水稻中與AtRPK1 高度同源的類受體蛋白激酶基因，抗逆性檢測(cè)表明，AtRPK1、OsRPK1基因的過量表達(dá)均造成了擬南芥的耐鹽性明顯下降，抗旱性顯著增強(qiáng)［31］。

OsRPK2 與OsRPK1 基因高度同源，本文利用OsRPK2 基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，篩選獲得純合體種子，對(duì)其在逆境脅迫條件下的萌發(fā)率進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，無論是在鹽、脫落酸還是PEG 的脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥在種子萌發(fā)率方面比野生型擬南芥均有明顯降低，OsRPK2 過表達(dá)擬南芥表現(xiàn)出了對(duì)非生物脅迫更加敏感的表型。在幼苗和成株階段進(jìn)行脅迫處理后，OsRPK2 過表達(dá)擬南芥在根長生長和成株生長狀況方面均表現(xiàn)出比野生型擬南芥更敏感的特征。

為探究OsRPK2 過量表達(dá)擬南芥抗逆性改變的生理機(jī)制，我們對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥進(jìn)行鹽脅迫處理后，分析檢測(cè)了葉綠素、丙二醛和脯氨酸的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥中葉綠素含量下降更為明顯，脯氨酸上升量較野生型擬南芥較小，丙二醛含量上升更為明顯。葉綠素含量的顯著下降、丙二醛積累量的增多說明轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫后所受損傷比野生型擬南芥植株更嚴(yán)重。脯氨酸含量的下降則直接導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥抵御滲透脅迫能力的降低。

FRY1 和SAD1 位于CDPK 蛋白激酶抗逆信號(hào)傳導(dǎo)通路［40～41］。SOS3 屬于SOS 信號(hào)通路，主要調(diào)控細(xì)胞離子平衡，與SOS2 形成蛋白激酶復(fù)合體，激活SOS1（質(zhì)膜上的Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），增加胞內(nèi)Na+的外排［42］。本研究通過熒光定量PCR 檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsRPK2 的過量表達(dá)使SAD、SOS3 和FRY 基因表達(dá)明顯受到抑制。因此OsRPK2 的過表達(dá)可能造成擬南芥CDPK 和SOS 抗逆信號(hào)傳導(dǎo)通路的信號(hào)傳遞受抑，造成轉(zhuǎn)基因植株對(duì)逆境脅迫的抗逆性下降。

總之，本部分實(shí)驗(yàn)確定OsRPK2基因在擬南芥中的過表達(dá)會(huì)造成植物體對(duì)高鹽、干旱等非生物脅迫更加敏感，對(duì)逆境信號(hào)的傳導(dǎo)能力降低，至于該基因的過量表達(dá)是否全面影響了CDPK 蛋白激酶和SOS 信號(hào)通路向下傳導(dǎo)抗逆信號(hào)，還有待進(jìn)一步的深入研究加以確認(rèn)。