謝艷秋 任常軍 王雄 相淑雯 王小星 郝玲

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院兒科，河北石家莊 050030；2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒內(nèi)科，廣東廣州 510623）

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis, NEC）是新生兒期常見的嚴(yán)重胃腸道疾病，多見于早產(chǎn)兒和低出生體重（LBW）兒[1]，臨床以腹脹、嘔吐、便血為主要表現(xiàn)，腹部X 線檢查以腸壁囊樣積氣為特征。NEC 發(fā)生率與新生兒出生體重呈反比[1]，且與出生時胎齡呈負(fù)相關(guān)[2]。有研究表明我國LBW 兒（出生體重＜2 500 g）和極低出生體重（VLBW）兒（出生體重＜1 500 g）的發(fā)生率分別為2.50% 和4.53%，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期NEC 患兒分別占51.1%、30.3%和18.6%，Ⅱ、Ⅲ期NEC 患兒病死率為41.7%[3]。從臨床的角度來看，NEC 的早期表現(xiàn)如反應(yīng)差、精神萎靡、嗜睡、體溫不穩(wěn)定、喂養(yǎng)不耐受等很難與早產(chǎn)兒常見的新生兒敗血癥等其他疾病和情況區(qū)分開來[4]。影像學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)腸壁積氣、腸壁增寬、門靜脈積氣、氣腹，甚至腸穿孔等改變時，其疾病狀態(tài)已非常危重[2]。非特異性生物標(biāo)志物如血小板計數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)、白細(xì)胞介素6、C 反應(yīng)蛋白、降鈣素原等對NEC 的識別缺乏特異性與敏感性[5]，因此早期鑒別特異性腸道生物標(biāo)志物對降低新生兒，尤其是早產(chǎn)兒和LBW 兒的病死率有著非常重要的臨床意義。

糞便鈣衛(wèi)蛋白（fecal calprotectin, FC）是S100蛋白家族中1 個36 kDa 的鈣鋅結(jié)合胞漿蛋白，是由活化或受損的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞及單核細(xì)胞等釋放的蛋白質(zhì)，與中性粒細(xì)胞遷徙至胃腸道有關(guān)，占粒細(xì)胞胞漿蛋白的半數(shù)以上，具有直接的抗菌作用[6]，對代謝降解具有抵抗力，其在糞便中的濃度大約是血漿的6 倍[6]，很容易在糞便中找到[7-8]。因此FC 作為一種檢測簡單、可重復(fù)性高的非侵入性的檢測指標(biāo)，具有更高的靈敏度和特異度。現(xiàn)FC 已作為篩查、診斷和檢測成人或兒童腸道炎癥性疾病的有用指標(biāo)之一[9-10]，目前國內(nèi)外已有多篇文獻(xiàn)對FC 診斷NEC 的價值進(jìn)行了探討，但研究結(jié)果尚不一致，對其診斷價值仍存爭議[11]。為克服單一研究樣本量小、檢驗(yàn)效能低的缺點(diǎn)，本研究通過Meta 分析方法進(jìn)行定量綜合評價FC 對NEC 的診斷價值，為臨床應(yīng)用提供一定依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索

檢索Cochrane Library、Embase、Web of Science、PubMed、維普期刊數(shù)據(jù)庫、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫。中文檢索詞：新生兒、早產(chǎn)兒、低出生體重兒、壞死性小腸結(jié)腸炎、糞便鈣衛(wèi)蛋白；英文檢索詞：“Infant”“Newborn”“Neonates”“Infant”“Premature”“Low-Birth-Weight Infant”“Enterocolitis”“Necrotizing”“Necrotizing Enterocolitis”“Leukocyte L1 Antigen Complex”“Calprotectin”。將檢索時間設(shè)定為從建庫開始至2020 年5 月。為檢索更加全面，必要時進(jìn)行文獻(xiàn)追蹤。

1.2 文獻(xiàn)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）研究目的為評價或探討FC對NEC 的診斷效能的中英文文獻(xiàn)；（2）研究對象為新生兒（年齡＜28 d）；（3）回顧性或前瞻性研究；（4）在研究中明確提出NEC 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并有正常新生兒或非NEC 新生兒作為對照的診斷對比資料；（5）能從原始文獻(xiàn)中獲得FC 診斷NEC 的真陽性值（TP）、真陰性值（TN）、假陽性值 （FP）、假陰性值（FN）等診斷參數(shù)；（6）當(dāng)作者與內(nèi)容均相似時，選取數(shù)據(jù)最全面的1 篇文獻(xiàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）研究對象為非新生兒；（2）非診斷性試驗(yàn)研究；（3）樣本量不足；（4）不能提取所需要數(shù)據(jù)及信息的研究。

1.3 文獻(xiàn)篩選

兩名調(diào)查人員獨(dú)立評審和評估每項(xiàng)研究，意見矛盾時，另增一位研究者進(jìn)行評估。首先篩選標(biāo)題和摘要，以確定潛在的合格研究，然后分析全文進(jìn)行進(jìn)一步評估。如果存在不確定的問題，通過Email 與文章的作者確認(rèn)。文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果見圖1。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

1.4 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)提取

從納入分析的15 篇文獻(xiàn)中，提取了文獻(xiàn)作者、發(fā)表時間、所在國家、病例與對照組例數(shù)、出生體重、胎齡、平均年齡、性別等一般情況，還有FC 檢測方法及檢測界值，以及TN、TP、FN、FP等診斷參數(shù)信息。

1.5 納入文獻(xiàn)質(zhì)量評價

進(jìn)入Meta 分析的研究質(zhì)量評價采用quality assessment of diagnostic accuracy studies （QUADAS）標(biāo)準(zhǔn)評價[12]。該標(biāo)準(zhǔn)總共包含14 個問題，對每條問題作出“是”“否”或“不清楚”的判斷，由2名研究者分別進(jìn)行評估，有分歧時討論決定。滿足“是”的＜10 項(xiàng)則為低質(zhì)量，10～11 項(xiàng)為中等質(zhì)量，12～14 項(xiàng)為高質(zhì)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

首先進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)，繪制受試者工作特征（ROC）曲線，并計算靈敏度對數(shù)與（1-特異度）對數(shù)的Spearman 相關(guān)系數(shù)及P值，來評價是否具有閾值效應(yīng)。根據(jù)MetaDisc 1.4 軟件計算所得I2來評估納入文獻(xiàn)的異質(zhì)性大小，I2≥50%，表明有顯著異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行統(tǒng)計分析，否則使用固定效應(yīng)模型。應(yīng)用 MetaDisc 1.4 軟件進(jìn)行Meta 分析。應(yīng)用Stata 15.0 軟件進(jìn)行敏感性分析及發(fā)表性偏倚檢驗(yàn)；繪制 Fagan 圖以估計測試后概率；進(jìn)行亞組分析并用Meta 回歸對異質(zhì)性的可能來源進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 檢索結(jié)果

通過檢索共獲得304 篇文獻(xiàn)。根據(jù)圖1 的篩選流程初步篩出28 篇文獻(xiàn)，進(jìn)一步評估全文，排除與納入標(biāo)準(zhǔn)不符、非診斷性試驗(yàn)的文獻(xiàn)11 篇，排除結(jié)局指標(biāo)不一致、內(nèi)容不符的文獻(xiàn)2 篇，最終納入15 篇，其中中文文獻(xiàn)5 篇，英文文獻(xiàn)10 篇。所有研究均采集了21 組數(shù)據(jù)，合計1 719 例新生兒，其中NEC 組560 例，對照組1 159 例。納入文獻(xiàn)基本特征見表1。

表1 納入文獻(xiàn)基本特征

2.2 納入研究的質(zhì)量評價

對納入文獻(xiàn)逐一進(jìn)行質(zhì)量評價。3篇文獻(xiàn)[20-21,23]納入人群為VLBW 兒，12 篇文獻(xiàn)[14,16-18,20-27]納入人群為早產(chǎn)兒，有發(fā)生疾病譜偏倚的可能。所有文獻(xiàn)選擇研究對象的標(biāo)準(zhǔn)是明確的。只有6 篇文獻(xiàn)[13-15,18,22-23]提供了診斷NEC 及標(biāo)本檢測的具體時間，發(fā)生疾病進(jìn)展偏倚的可能性較大。所有文獻(xiàn)病例組和對照組均接受了金標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，表明無發(fā)生參照偏倚的可能。所有文獻(xiàn)均接受了相同的金標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，表明無多重參照偏倚發(fā)生的可能，且金標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)均獨(dú)立于待評價試驗(yàn)，發(fā)生金標(biāo)準(zhǔn)偏倚的可能性較小。12 篇文獻(xiàn)[13-20,22-24,27]未清楚描述待評價試驗(yàn)的結(jié)果判讀是否是在不知曉金標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)結(jié)果的情況下進(jìn)行，提示對診斷性試驗(yàn)判讀偏倚是否會發(fā)生描述不清楚。7 篇文獻(xiàn)[16-18,24-27]不清楚金標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)的結(jié)果判讀是否是在不知曉待評價試驗(yàn)結(jié)果的情況下進(jìn)行。僅有1 篇文獻(xiàn)[21]報告了難以解釋的試驗(yàn)結(jié)果，2 篇文獻(xiàn)[25-26]對退出研究的病例進(jìn)行解釋。納入文獻(xiàn)中，低質(zhì)量文獻(xiàn)有4篇[18-19,22,27]，高質(zhì)量文獻(xiàn)有2 篇[25-26]，其余均為中等質(zhì)量。

2.3 異質(zhì)性檢驗(yàn)

繪制了FC 診斷NEC 的綜合受試者工作特征（summary receiver operating characteristic, SROC）曲線（圖2），曲線下面積（AUC）為0.9131，Q*指數(shù)為0.8456，說明FC 對于NEC 的診斷具有較高的價值；且未發(fā)現(xiàn)呈“肩臂狀”點(diǎn)分布，進(jìn)一步計算靈敏度對數(shù)與（1-特異度）對數(shù)的Spearman相關(guān)系數(shù)為-0.374，靈敏度和1-特異度呈負(fù)相關(guān)，P=0.095，均提示不存在閾值效應(yīng)。根據(jù)異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)各研究結(jié)果間的診斷比值比（DOR）（χ2=40.16，P=0.0048，I2=50.2%），存在顯著的異質(zhì)性，因此采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析。

2.4 合并效應(yīng)量的Meta 分析

圖3 所示為FC 診斷NEC 的特異度、靈敏度的森林圖，F(xiàn)C 診斷新生兒NEC 的特異度、靈敏度分別為0.80（95%CI：0.78～0.82）、0.86（95%CI：0.83～0.89）；圖4～5 所示為似然比和DOR 的森林圖，陰性似然比（NLR）、陽性似然比（PLR）、DOR分別為0.19（95%CI：0.14～0.26）、4.71（95%CI：3.57～6.23）、29.56（95%CI：17.98～48.61）。 說明FC 對于NEC 的診斷具有較高的價值。

圖2 FC 診斷 NEC 的 SROC 曲線

圖3 FC 診斷NEC 的匯總特異度（上）及靈敏度（下）分析

圖4 FC 診斷NEC 的匯總陰性似然比（上）及陽性似然比（下）分析

2.5 異質(zhì)性探索及亞組分析

診斷性Meta 分析異質(zhì)性來源于閾值效應(yīng)、協(xié)變量效應(yīng)、發(fā)表偏倚等。本研究發(fā)現(xiàn)納入研究間存在異質(zhì)性，且沒有閾值效應(yīng)。Deek's 法的P=0.69（圖6），說明納入研究沒有發(fā)表偏倚。將納入研究分為早產(chǎn)兒組、非早產(chǎn)兒組、VLBW 組（出生體重＜1 500 g）、非VLBW 組，分別進(jìn)行亞組分析，結(jié)果見表2。在早產(chǎn)兒組中FC 診斷NEC 有較高的靈敏度與特異度，在VLBW 組中，靈敏度與早產(chǎn)兒組相近，但有更高的特異度，亞組分析說明FC在早產(chǎn)兒和VLBW 兒的NEC 診斷中均有較高的靈敏度與特異度。將文獻(xiàn)中發(fā)表時間、研究方法、研究國家、NEC 診斷時間、糞便標(biāo)本收集時間作為協(xié)變量進(jìn)行Meta 回歸分析，未發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性的來源（均P＞0.05），說明異質(zhì)性來源于其他非協(xié)變量因素。利用Stata 15.0軟件進(jìn)行敏感性分析（圖7），評估單個研究對本次Meta 分析的影響，刪除任意1 篇文獻(xiàn)，然后對余下研究進(jìn)行匯總分析發(fā)現(xiàn)診斷參數(shù)置信區(qū)間與原數(shù)據(jù)大部分重疊，說明本文納入文獻(xiàn)的穩(wěn)定性較好。繪制Fagan 圖（圖8）進(jìn)行試驗(yàn)后概率估計，用Fagan 分析說明 FC 在診斷NEC 中的價值，即納入研究金標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)概率為80%，計算得知FC 診斷NEC 時，明確患有NEC的概率為86%，排除NEC 時，明確患有NEC 的概率為13%。

圖5 FC 診斷NEC 的匯總診斷比值比分析

圖6 Deek's 法分析納入文獻(xiàn)發(fā)表偏倚情況

表2 亞組分析

圖7 納入文獻(xiàn)敏感性分析

圖8 納入文獻(xiàn)Fagan 圖

3 討論

當(dāng)PLR＞10 或NLR＜0.1 時，診斷或排除某種疾病的可能性就顯著增加。DOR＞1 時，其值越大說明該診斷試驗(yàn)的判別效果越好；取值＜1 時，正常人比患者更有可能被診斷試驗(yàn)判為陽性；取值=1 時，表示該診斷試驗(yàn)無法判別正常人與患者。為了評估SROC 曲線的準(zhǔn)確性，還計算了Q*指數(shù)，Q*指數(shù)越大時，AUC 越接近1，說明準(zhǔn)確性越高。

本研究有較高的總Se、Sp，分別為0.86（95%CI：0.83～0.89）、0.80（95%CI：0.78～0.82）?？侾LR、NLR 分 別 為4.71、0.19，PLR＞10 或NLR＜0.1 時，診斷或排除某種疾病的可能性就顯著增加，該研究結(jié)果不支持FC 檢測陰性時排除NEC的可能性大。DOR 為29.56，其值越大說明該診斷試驗(yàn)的判別效果越好。AUC=0.9131、Q*=0.8456，Q*指數(shù)越大時，AUC 越接近1，說明準(zhǔn)確性越高。由于納入文獻(xiàn)存在高度異質(zhì)性，因此從診斷閾值效應(yīng)、協(xié)變量效應(yīng)、發(fā)表偏倚3 個方面探討可能的異質(zhì)性來源。分析發(fā)現(xiàn)本研究沒有閾值效應(yīng)和發(fā)表偏倚，進(jìn)一步行Meta 回歸分析，結(jié)果表明，發(fā)表時間、研究國家、研究方法、NEC 診斷時間、糞便標(biāo)本收集時間均不是異質(zhì)性的來源，異質(zhì)性可能與FC 診斷界值、有無NEC 高危因素等其他因素有關(guān)，說明本研究設(shè)計的差異并不會造成結(jié)果的明顯差異。本研究通過Meta 分析方法將小樣本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)FC 對早期診斷NEC 具有較好的靈敏度和特異度，有較高的診斷價值。

NEC 是一種少見且嚴(yán)重的胃腸道疾病，目前還沒有有效的干預(yù)措施來防止NEC 的發(fā)生和進(jìn)展。其發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，可能與多種因素有關(guān)，NEC 的發(fā)生很可能是黏膜損傷和宿主反應(yīng)之間相互作用的結(jié)果，這種反應(yīng)導(dǎo)致受影響區(qū)域壞死，其進(jìn)展會導(dǎo)致腸破裂、腹膜炎、膿毒癥和死亡[20]。NEC 的診斷依賴于一系列臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)和放射學(xué)發(fā)現(xiàn)，這些臨床參數(shù)是非特異性的，不能為NEC 的早期診斷提供足夠的依據(jù)。現(xiàn)在并無針對NEC 的特異性治療方案，其預(yù)防策略包括鼓勵使用母乳喂養(yǎng)、應(yīng)用益生菌[28-29]，及早懷疑和適當(dāng)管理。因此，早期找到可靠的特異的腸道炎癥生物標(biāo)志物或因子，將有助于降低NEC 的發(fā)病率和病死率。

先前的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)C 在NEC 患兒糞便中含量較正常新生兒、喂養(yǎng)不耐受等患兒明顯升高，治療后下降，F(xiàn)C 的增加與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[8,18,30-31]。NEC 可能會損害整個腸道，最常見的區(qū)域是末端回腸和近端升結(jié)腸，這可能是不可逆轉(zhuǎn)的。廣泛的黏膜感染會導(dǎo)致FC 水平升高，當(dāng)FC 螯合了鋅離子，形成了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，則具有抗熱性，它們不會被降解，這種穩(wěn)定形式的FC 在室溫下可以在糞便中保持長達(dá)7 d[18]，且FC 的檢測是無創(chuàng)、簡便的，減少了對新生兒的刺激，F(xiàn)C 的這些特性使其能作為篩選腸道炎癥的可靠生化標(biāo)志物。

本研究的局限性：（1）檢索文獻(xiàn)均為公開發(fā)表的，可能遺漏一些灰色文獻(xiàn)；有可能會錯失除中英文外的相關(guān)文獻(xiàn)；（2）在診斷性試驗(yàn)中應(yīng)用盲法可大大減少診斷的傾向性，但大多研究未報道是否使用盲法，存在測量偏倚的可能；（3）大多數(shù)文獻(xiàn)并未說明納入病例有無發(fā)生NEC 的高危因素，有無使用抗生素、益生菌等信息，可能對結(jié)果造成一定影響；（4）納入文獻(xiàn)的異質(zhì)性較大，盡管本研究已進(jìn)行了亞組分析、異質(zhì)性探索，均未發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性來源，但臨床異質(zhì)性仍可能對結(jié)論的可靠性造成一定影響，待以后相關(guān)研究增多，可進(jìn)一步細(xì)化亞組分析；（5）部分納入研究樣本量偏少或質(zhì)量偏低。

綜上所述，糞便FC 在新生兒NEC 的診斷中具有較高的特異度及靈敏度，結(jié)合其穩(wěn)定性高、方便檢測等特點(diǎn)，可作為NEC 良好的輔助診斷工具，在臨床上用于診斷新生兒NEC 具有一定價值，有利于早期對新生兒NEC 作出診斷。未來可以進(jìn)行更多多中心、大樣本試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證其診斷效能。