鐘欣 欒佐 臧靜 管倩 楊印祥 王倩 史源

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒科/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗室/重慶市干細(xì)胞治療工程技術(shù)研究中心，重慶 400014；2.解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心，北京 100048）

隨著圍生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，幾乎所有國家的早產(chǎn)率都在上升。不幸的是，早產(chǎn)兒大腦發(fā)育過程特別容易遭受缺氧缺血和炎癥感染，其發(fā)生腦白質(zhì)損傷（white matter injury, WMI）的風(fēng)險很高[1]。WMI常導(dǎo)致遠(yuǎn)期認(rèn)知障礙和腦性癱瘓等后遺癥[1]，給家庭和社會經(jīng)濟(jì)造成了巨大負(fù)擔(dān)。腦室周圍白質(zhì)軟化（periventricular leukomalacia, PVL）是WMI的主要表現(xiàn)形式[2]，它干擾少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系的發(fā)育[3-4]。然而，目前還沒有針對WMI 治療的特異性方法。

少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells, OPCs）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體，在胚胎發(fā)育和出生后早期的神經(jīng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。髓鞘脫失是PVL 的病理標(biāo)志,隨著OPCs 向有髓少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化減少而增加[5-6]。越來越多的研究表明，在WMI 中，OPCs 對于潛在的髓鞘重塑活動驅(qū)動也發(fā)揮了關(guān)鍵作用[7]。此外，實(shí)驗室先前的研究表明通過側(cè)腦室移植人少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（human oligodendrocyte precursor cells, hOPCs）后可對WMI 大鼠模型起神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)作用，增強(qiáng)髓鞘再生能力，并維持正常的神經(jīng)功能[8]。因此，hOPCs 具有很大的移植潛力。

通過腦立體定位儀移植細(xì)胞到胼胝體和側(cè)腦室，或者通過動靜脈注射移植等途徑都是目前干細(xì)胞動物實(shí)驗中常用的方法。但是將這些干細(xì)胞研究轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，需要改善細(xì)胞遞送方式從而避免對腦組織的損傷，同時需要克服中樞神經(jīng)系統(tǒng)存有血腦屏障的難題。經(jīng)小腦延髓池注射細(xì)胞至蛛網(wǎng)膜下腔的移植方式是非侵入性的，操作簡單方便，不良反應(yīng)小，可反復(fù)操作。細(xì)胞可以進(jìn)入腦脊液，快速彌散于蛛網(wǎng)膜下腔，并且直接接觸腦組織。

本實(shí)驗的目的是研究經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植hOPCs 至WMI 大鼠模型是否能促進(jìn)髓鞘再生和改善其遠(yuǎn)期行為能力。

1 材料與方法

1.1 動物

從北京維通利華購買清潔級Sprague-Dawley孕鼠。將孕鼠單獨(dú)關(guān)在籠子里，自由進(jìn)食。待產(chǎn)子后，選取生后3 d 的新生大鼠作為實(shí)驗對象。根據(jù)實(shí)驗要求，將新生大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、hOPCs 移植組（移植組），每組10 只，其中雄性大鼠5 只，雌性大鼠5 只，30 日齡時分籠。90 日齡時，進(jìn)行水迷宮實(shí)驗后，每組隨機(jī)選取3只大鼠進(jìn)行電鏡觀察。

1.2 主要試劑

多聚甲醛和牛血清白蛋白（A1992，美國Sigma 公司），兔抗鼠神經(jīng)節(jié)苷脂（ganglioside,A2B5）抗體（MAB1416，美國R&D Systems 公司），兔抗鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子-2（oligodendrocyte transcription factor-2, Olig2）抗體（AB9610，美國Millipore 公司），驢抗兔IgG 488 二抗（AB175649，英國Abcam 公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

本研究中采用的hOPCs 從人類自然流產(chǎn)的11周胎兒腦中分離的神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化產(chǎn)生。細(xì)胞來源已獲得解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)（20170812），并在術(shù)前與供者簽訂知情同意書。按照文獻(xiàn)所述[9]，通過反復(fù)的機(jī)械分散、離心、分離，將提取的胎兒腦組織分離成單細(xì)胞懸液。然后將這些細(xì)胞種植到專用的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)其在體外分化得到hOPCs。用hOPCs 特異性標(biāo)記物A2B5 和Olig2 進(jìn)行染色，鑒定并檢測細(xì)胞純度。細(xì)胞移植時，將hOPCs 濃縮在磷酸緩沖0.9%氯化鈉溶液中制成細(xì)胞懸液（1.8×106/20 μL PBS）。

1.4 PVL 動物模型的建立

參照文獻(xiàn)建造PVL 動物模型[10-11]，將出生后（P）3 d 的大鼠放置在冰上15 min 行冰凍麻醉，待其對有害刺激無反應(yīng)。大鼠取仰臥位用膠布固定，消毒頸部皮膚。在顯微鏡下沿正中線切開皮膚約0.5 cm，剝離其右側(cè)頸總動脈，用電凝筆離斷后，縫合皮膚。建造模型過程中，排除模型組出血過多的大鼠1 只。術(shù)后，立即將新生大鼠放回母鼠籠中復(fù)溫2 h，然后將幼鼠置于密封的37℃恒溫缺氧箱中，暴露于缺氧（94%N2+6%O2）環(huán)境中2 h。假手術(shù)組大鼠僅在冰凍麻醉后游離右側(cè)頸總動脈，但不予離斷，也不對其進(jìn)行缺氧處理。

1.5 細(xì)胞移植

給予戊巴比妥（60 mg/kg）腹腔注射麻醉P8 d大鼠，并用立體定位儀將其固定在俯臥位，頭部在水平線下以大約30°的角度彎曲。沿中線切開后頭皮，用鑷子對肌肉進(jìn)行鈍性分離。在枕骨與寰椎的交界處，暴露出寰枕膜。將寰枕膜晾干，用漢密爾頓進(jìn)樣針從中間向左側(cè)刺穿。觀察到腦脊液流出，以確保針尖位于小腦延髓池內(nèi)[12]。將20 μL hOPCs 細(xì)胞懸液（移植組）或20 μL PBS（模型組及假手術(shù)組）緩慢注射到小腦延髓池，此過程大約10 min。然后將針尖停留在蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)10 min 以防止細(xì)胞泄漏。移植期間，大鼠沒有明顯的不良反應(yīng)。拔針后立即將1 滴0.9%氯化鈉溶液滴于針頭處，以避免移植細(xì)胞與腦脊液一起從第四腦室流出。最后縫合皮膚。移植組大鼠無出血、無死亡。移植前3 d 開始對大鼠腹腔注射環(huán)孢素（每日10 mg/kg），直到移植后1 個月。

1.6 行為測試

按照文獻(xiàn)所述方法[13]，在移植后第12 周對所有大鼠進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗。在實(shí)驗中，將大鼠依次緊靠側(cè)壁放置在每個象限內(nèi)。連續(xù)訓(xùn)練5 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗，記錄定位目標(biāo)平臺所用的總時間（延遲截止時間60 s），評估大鼠的學(xué)習(xí)能力。在測試的第6 天，進(jìn)行空間探索實(shí)驗，將平臺移出迷宮，測量60 s 內(nèi)的目標(biāo)平臺穿越次數(shù)、目標(biāo)象限穿越次數(shù)和目標(biāo)象限停留時間，評估大鼠的遠(yuǎn)期記憶功能。

1.7 免疫熒光染色

取狀態(tài)良好的6 孔板培養(yǎng)的hOPCs 進(jìn)行免疫熒光染色鑒定。hOPCs 用4%多聚甲醛室溫固定5 min，PBS 洗3 次；每孔加入3%BSA 在28～30℃的三氣培養(yǎng)箱中封閉2 h，吸棄封閉液后加入一抗A2B5（1 : 50）和Olig2（1 : 100），于4℃孵育過夜；PBS 洗3 次，每次5 min；加入二抗驢抗兔IgG 488（1 : 500），室溫避光孵育2 h，PBS 洗3 次，每次5 min；DAPI 復(fù) 染10 min，PBS 洗3 次，每 次5 min；在熒光顯微鏡下拍照。

1.8 電鏡

移植后第12 周，每組各取3 只大鼠經(jīng)心臟灌注。從每只鼠右半腦同一位置取總面積為1 mm2的胼胝體樣本。2.5%戊二醛固定30 min，PBS 室溫洗滌3 次。四氧化鋨固定后，用丙酮脫水并包埋在環(huán)氧樹脂中。然后將標(biāo)本切成70 nm 的超薄切片，再用電鏡觀察軸突的超微結(jié)構(gòu)。通過Image J 軟件，從低倍率圖像（6 000 倍）中隨機(jī)選取100個有髓軸突，計算g-ratio（軸突總直徑/纖維總直徑），g-ratio 值越大，說明髓鞘厚度越小[14]。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8 和SPSS 11.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。水迷宮定位航行實(shí)驗采用重復(fù)測量方差分析，同一時間點(diǎn)組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。其他結(jié)果采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 從神經(jīng)干細(xì)胞分化制備hOPCs

采用hOPCs 特異性標(biāo)記物（Olig2、A2B5）進(jìn)行免疫熒光染色，驗證移植細(xì)胞純度。免疫熒光分析顯示，移植細(xì)胞為Olig2+、A2B5+細(xì)胞（圖1），陽性百分率分別為92.5%、95.1%，即為hOPCs。該結(jié)果表明hOPCs 純度較高，可用于本實(shí)驗研究。

2.2 hOPCs 移植對WMI 大鼠神經(jīng)功能的影響

移植后第12 周對大鼠進(jìn)行Morris 水迷宮測試。在Morris 水迷宮定位航行實(shí)驗中，從第1 天到第5 天，模型組的逃避潛伏期明顯長于假手術(shù)組（P＜0.05）。但是，與模型組相比，除第2 天外，移植組的逃避潛伏期均縮短（P＜0.05）。在水迷宮空間探索實(shí)驗中，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的目標(biāo)平臺和目標(biāo)象限穿越次數(shù)均減少，目標(biāo)象限停留時間縮短（P＜0.05）。移植組大鼠的目標(biāo)象限停留時間長于模型組（P＜0.05）；模型組與移植組之間的目標(biāo)平臺和目標(biāo)象限穿越次數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這些結(jié)果表明，hOPCs 移植在一定程度上減輕了WMI 大鼠的認(rèn)知功能障礙，改善了神經(jīng)系統(tǒng)的預(yù)后。見表1～2。

圖1 分化培養(yǎng)hOPCs 移植到WMI 大鼠中（免疫熒光染色，×200） 上圖綠色熒光為神經(jīng)節(jié)苷脂（A2B5）的陽性表達(dá)，藍(lán)色熒光為DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核；下圖綠色熒光為少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子-2（Olig2）的陽性表達(dá)；藍(lán)色熒光為DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核。

表1 各組大鼠定位航行實(shí)驗逃避潛伏期比較 （，s）

表1 各組大鼠定位航行實(shí)驗逃避潛伏期比較 （，s）

注：重復(fù)測量方差分析顯示了時間因素差異（F=26.736，P＜0.001）；分組因素差異（F=13.718，P＜0.001）；時間因素與分組因素?zé)o交互作用（F=1.349，P＞0.05）。a 示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b 示與模型組比較，P＜0.05。

組別 n 第1 天 第2 天 第3 天 第4 天 第5 天假手術(shù)組 10 25.7±11.7 14.1±8.3 7.8±3.2 7.6±2.7 5.1±2.8模型組 10 47.0±9.7a 29.4±16.5a 39.1±17.1a 28.7±16.3a 25.4±12.3a移植組 10 35.9±12.9b 25.6±10.9 23.5±7.8b 17.4±6.0b 13.0±5.7b F 值 6.986 2.795 14.354 7.922 12.315 P 值 0.004 0.079 ＜0.001 0.002 ＜0.001

表2 各組大鼠空間探索實(shí)驗測試結(jié)果比較 （）

表2 各組大鼠空間探索實(shí)驗測試結(jié)果比較 （）

注：a 示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b 示與模型組比較，P＜0.05。

目標(biāo)象限停留時間(s)假手術(shù)組 10 7.1±2.1 3.4±1.6 27±3模型組 10 4.4±1.4a 1.0±0.8a 14±4a移植組 10 6.6±2.6 2.8±1.9 22±4b F 值 4.735 3.856 16.960 P 值 0.021 0.038 ＜0.001組別 n 目標(biāo)平臺穿越次數(shù)目標(biāo)象限穿越次數(shù)

2.3 hOPCs 移植對WMI 大鼠髓鞘再生的影響

為了評估WMI，通過電鏡直接觀察軸突的超微結(jié)構(gòu)（圖2）。模型組髓鞘呈松散、分離和崩解的形態(tài)，有髓軸突數(shù)量減少；假手術(shù)組髓鞘完好，均勻，邊界清晰；移植組部分髓鞘局部分離，結(jié)構(gòu)大致完整，有髓軸突數(shù)量增加。各組g-ratio 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=153.100，P＜0.001）。與假手術(shù)組（0.672±0.010）相比，模型組大鼠的g-ratio（0.857±0.020）升高（P＜0.05），說明髓鞘厚度減?。慌c模型組相比，移植組的g-ratio（0.753±0.006）降低（P＜0.05），說明髓鞘厚度增加。提示hOPCs 移植促進(jìn)了WMI 模型大鼠的髓鞘再生。

圖2 各組大鼠電鏡下髓鞘形態(tài) 電鏡圖像顯示，模型組髓鞘呈松散、分離和崩解的形態(tài)（藍(lán)色箭頭所示），有髓軸突（綠色箭頭所示）數(shù)量減少；假手術(shù)組髓鞘完好，均勻，邊界清晰，同心圓結(jié)構(gòu)正常（紅色箭頭所示）；移植組部分髓鞘局部分離，結(jié)構(gòu)大致完整，有髓軸突數(shù)量增加。

3 討論

隨著早產(chǎn)兒的增加，容易引起遠(yuǎn)期神經(jīng)功能損害的WMI 的發(fā)生率也增加。許多研究報道WMI的典型表現(xiàn)是髓鞘脫失和髓鞘再生能力減弱[1]。人類多能干細(xì)胞hOPCs 被證明在髓鞘形成和損傷后的髓鞘再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。作為一種低侵入性的治療策略，小腦延髓池移植路徑容易應(yīng)用于臨床。因此，為了探討蛛網(wǎng)膜下腔移植hOPCs 的治療效果，本研究通過小腦延髓池將hOPCs 移植到WMI 大鼠的大腦中，通過行為測試評估大鼠神經(jīng)功能，并通過電鏡觀察和評估大鼠髓鞘水平。結(jié)果顯示，與模型組相比，移植hOPCs 明顯增強(qiáng)了移植組的髓鞘生成，改善了神經(jīng)功能結(jié)局。這些結(jié)果提示，采用經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔進(jìn)行的hOPCs 移植可能成為將來治療WMI 的新策略。

過去，hOPCs 直接從人類胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)而來或使用流式細(xì)胞術(shù)檢測其特異的表面標(biāo)記物從供體腦組織中獲得[15-16]。源自人類胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞可能具有很強(qiáng)的致瘤性，而通過免疫分選則需要大量的供體腦組織以獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞。在本實(shí)驗室先前的研究中[9]，根據(jù)細(xì)胞分化方案產(chǎn)生了高純度的、特定神經(jīng)細(xì)胞型的hOPCs，且此細(xì)胞培養(yǎng)方法具有高穩(wěn)定性和可重復(fù)性?？紤]將來臨床使用，這些特性是必要的。因此，我們研究了hOPCs 增強(qiáng)髓鞘再生和減輕WMI 后神經(jīng)功能障礙的能力。

細(xì)胞的腦移植有幾種不同的途徑，包括動靜脈注射，腰椎穿刺后鞘內(nèi)注射，腦實(shí)質(zhì)內(nèi)和腦室內(nèi)注射。腦實(shí)質(zhì)內(nèi)和腦室內(nèi)注射可直接將細(xì)胞移植到病變處，但炎癥微環(huán)境會影響供體細(xì)胞的存活，并且有創(chuàng)的移植方式可能會對腦造成進(jìn)一步損傷從而限制其臨床應(yīng)用。雖然全身給藥如靜脈和動脈注射是微創(chuàng)的，但移植細(xì)胞似乎受到血腦屏障的影響，很難到達(dá)腦損傷部位。由于注射部位位于腦脊液循環(huán)的末端，通過腰椎穿刺后的鞘內(nèi)注射將細(xì)胞遞送至目標(biāo)區(qū)域的移植方式也可能受到限制。有研究報道[12]，通過小腦延髓池移植后，大量的間充質(zhì)干細(xì)胞可以遷移至腦實(shí)質(zhì)并開始增殖。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)[17]，通過小腦延髓池移植的神經(jīng)球細(xì)胞大約有三分之二出現(xiàn)在缺乏髓鞘纖維的區(qū)域。所以我們設(shè)想，炎癥微環(huán)境可能促進(jìn)移植細(xì)胞遷移到受損的腦組織，即我們注射到蛛網(wǎng)膜下腔的hOPCs 可以選擇性地進(jìn)入到腦缺血區(qū)域。小腦延髓池穿刺是臨床上用于腦脊液檢查的常規(guī)醫(yī)療程序，操作簡單、方便、安全。在臨床應(yīng)用中，移植手術(shù)應(yīng)由經(jīng)驗豐富的醫(yī)生進(jìn)行，以避免手術(shù)失誤造成損傷。

作為一種新的移植策略，通過小腦延髓池遞送細(xì)胞方式的有效性在本研究中得到了驗證。本研究結(jié)果顯示，與模型組大鼠相比，經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植的hOPCs 促進(jìn)了移植組大鼠認(rèn)知功能的改善，與假手術(shù)組相比無明顯差別。此外，電鏡結(jié)果顯示，與模型組大鼠相比，通過小腦延髓池進(jìn)行hOPCs 移植的大鼠髓鞘再生能力增強(qiáng)。同時，與假手術(shù)組相比，移植組g-ratio 也無明顯差異。這與先前報道的關(guān)于hOPCs 移植的效果相當(dāng)[8,18]。

研究報道，hOPCs 在移植后通過分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)髓鞘形成和改善神經(jīng)功能預(yù)后[18]。但是，其他研究表明，移植的hOPCs 可以通過獨(dú)立于靶細(xì)胞分化的機(jī)制，對神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用[19-20]。然而，移植的hOPCs 在體內(nèi)遷移分化的情況和其改善行為功能的機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步的研究。