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鼠李糖乳桿菌對產(chǎn)后抑郁小鼠行為和運動能力的影響

2021-04-20 00:30周小蘭王立芹曹國芬張海苗
關(guān)鍵詞:造模桿菌小鼠

李 騰,周小蘭,褚 靜,王立芹,曹國芬,張海苗

產(chǎn)后抑郁癥(PPD)是一種常見的精神疾病,藥物治療和心理治療是PPD最常用的兩種治療方法,但是治療成功率低,效果不理想[1]。目前有研究[2]表明腸道微環(huán)境失調(diào)可能與焦慮、抑郁等心理疾病有關(guān)。因此腸道微生態(tài)與抑郁癥的關(guān)系也為PPD的治療提供新的思路。鼠李糖乳桿菌Lactobacillusrhamnosus屬于乳桿菌屬,和雙歧桿菌都屬于目前公認(rèn)的益生菌[2]。有研究[3]表明,應(yīng)用鼠李糖乳桿菌對小鼠進行體內(nèi)飼喂,能夠影響焦慮和抑郁樣行為。但鼠李糖乳桿菌與PPD之間關(guān)系的研究在國內(nèi)外少有報道。本研究采用地塞米松磷酸鈉建立PPD小鼠模型,初步探究鼠李糖乳桿菌對小鼠產(chǎn)后抑郁樣行為的影響,為產(chǎn)后抑郁的研究和治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級成年C57BL/6小鼠60只,體質(zhì)量18~24 g,購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。進行為期一周的適應(yīng)性喂養(yǎng),室溫24~27 ℃,濕度45%~50%,給予自然晝夜節(jié)律光照,動物可自由攝食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)的后3 d,對雌性小鼠進行24 h食物消耗實驗、黑白箱實驗、強迫游泳實驗和懸尾實驗,以此獲得行為學(xué)實驗的基線值。

1.2 動物模型制備 將雌雄小鼠按1∶1比例合籠交配,24 h后行陰道涂片檢測雌性小鼠是否懷孕。受孕雌鼠獨籠飼養(yǎng),隨機分為鼠李糖乳桿菌干預(yù)低劑量組(Ⅰ組,n=5)、鼠李糖乳桿菌干預(yù)高劑量組(Ⅱ組,n=5)、陽性對照組(Ⅲ組,n=5)、模型對照組(Ⅳ組,n=5)。為了排除注射對母鼠產(chǎn)生的影響,Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組小鼠自受孕第1天開始,皮下注射1 mL·kg-1·d-10.9%氯化鈉溶液,共注射14 d,使其在后期接受地塞米松注射時對注射這一操作適應(yīng),避免操作引起的差異。受孕第15天開始,Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組小鼠皮下注射0.2 mg·kg-1·d-1地塞米松磷酸鈉,直至23 d左右產(chǎn)崽??瞻讓φ战M(Ⅴ組,n=5)小鼠自然飼養(yǎng)。

1.3 干預(yù)方法 產(chǎn)后通過灌胃給藥的方式進行干預(yù),Ⅰ組和Ⅱ組小鼠分別給予1×107CFU/(kg·d)和1×108CFU/(kg·d)鼠李糖乳桿菌,Ⅲ組小鼠給予1.8 mg·kg-1·d-1帕羅西汀,Ⅳ組和Ⅴ組小鼠給予等量的0.9%氯化鈉溶液,干預(yù)時間為4周。

1.4 行為學(xué)實驗

1.4.1 24 h食物消耗實驗 實驗開始前動物需禁食禁水24 h,然后每只小鼠給予足量準(zhǔn)確稱量的普通飼料,24 h后稱量剩余飼料重量,同時稱動物體質(zhì)量。計算24 h攝食量,公式為:攝食量=(食物總量-食物余量)/體質(zhì)量×100%。記錄每周體質(zhì)量變化,體質(zhì)量變化率=(本周體質(zhì)量-第一周體質(zhì)量)/本周體質(zhì)量。

1.4.2 黑白箱實驗 黑白箱是一個 50 cm×30 cm×30 cm 的樹脂板盒子,由占 1/3 體積的不透明黑箱(有蓋,30 cm×20 cm×30 cm)和占2/3體積的透明白箱(無蓋,30 cm×30 cm×30 cm)組成,在黑箱與白箱相連壁的底部正中有個小的門洞(5 cm×7 cm),小鼠可從該門穿梭于兩箱,每次將小鼠放入黑箱同一位置內(nèi),并由攝像頭記錄小鼠5 min內(nèi)在白箱停留的時間以及在兩箱穿梭的次數(shù)。

1.4.3 強迫游泳實驗 將小鼠放入玻璃燒杯中,水溫保持在25~27 ℃。攝像頭檢測 6 min,在小鼠游泳2 min 后,記錄接下來4 min內(nèi)小鼠的不動性的累計時間:即小鼠在水中放棄掙扎,呈直立漂浮狀態(tài),或僅有細小的肢體運動以保持頭部浮在水面的持續(xù)時間總和。

1.4.4 懸尾實驗 用膠帶將小鼠懸掛于距離臺面 50 cm 的支架邊緣上,膠帶粘貼位置距小鼠尾尖1~2 cm 處,腹部對準(zhǔn)攝像頭,攝像記錄 6 min,統(tǒng)計最后 4 min 小鼠靜止不動的累計時間:即小鼠放棄掙扎,呈僵直狀態(tài),或僅有細小的肢體運動的持續(xù)時間總和。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組24 h食物消耗和體質(zhì)量變化率比較 攝食量均下降,造模后變化則較平穩(wěn)。與造模前相比,造模后和干預(yù)后各組小鼠攝食量減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);不同組別間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。體質(zhì)量變化率呈上升趨勢,與造模前相比,造模后和干預(yù)后各組小鼠體質(zhì)量變化率明顯增加(P<0.01);與造模后相比,干預(yù)后各組小鼠體質(zhì)量變化率增加(P<0.05)(見表1、2)。

2.2 各組黑白箱實驗行為評估 造模前各組小鼠的白箱停留時間和黑白箱穿梭次數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后與Ⅴ組相比,其余組小鼠的白箱停留時間降低,但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),黑白箱穿梭次數(shù)有所減少(P<0.05)。干預(yù)后黑白箱穿梭次數(shù)各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與Ⅴ組比較,其余組的白箱停留時間減少但各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表3、4)。

表1 各組24 h食物消耗實驗攝食量比較

表2 各組體質(zhì)量變化率比較

表3 各組黑白箱實驗行為評估(白箱停留時間)

2.3 各組強迫游泳實驗和懸尾實驗情況 造模前各組小鼠的懸尾不動時間和不動狀態(tài)持續(xù)時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模結(jié)束后各組小鼠進行行為學(xué)測試,與Ⅴ組相比,其余組小鼠懸尾不動時間明顯升高(P<0.01)。干預(yù)后與Ⅴ組比較,其余組小鼠的懸尾不動時間增加(P<0.01);與Ⅳ組比較,Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的懸尾不動時間減少(P<0.01)。與造模前相比,造模后和干預(yù)后Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組小鼠強迫游泳不動持續(xù)時間和懸尾不動時間增加(P<0.05);與造模后相比,干預(yù)后Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組小鼠強迫游泳不動持續(xù)時間和懸尾不動時間減少(P<0.05)(見表5、6)。

表4 各組黑白箱實驗行為評估(黑白箱穿梭次數(shù))

表5 各組強迫游泳實驗不動狀態(tài)持續(xù)時間比較

表6 各組懸尾實驗不動時間比較

3 討論

PPD是最常見的產(chǎn)褥期精神綜合征之一,伴隨著發(fā)病率的升高,越來越受到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界普遍重視。然而在基礎(chǔ)研究中,目前還沒有較為完善的PPD動物模型。孕期皮質(zhì)酮法、母嬰分離法或模擬妊娠后激素停撤方案等,這些方法在發(fā)病原因和臨床表現(xiàn)等方面與臨床PPD有一定差異[4]。近年來,有學(xué)者發(fā)展轉(zhuǎn)基因抑郁動物模型(Wistar Kyoto 大鼠和Flinder Resistant Line 大鼠)[5],這類PPD模型雖然較穩(wěn)定,但又難以獲得。GREGUS等[6]通過長期反復(fù)高劑量地塞米松注射成功誘導(dǎo)出PPD動物模型,本研究根據(jù)GREGUS等的研究設(shè)計本實驗,自然分娩后建立穩(wěn)定可靠的PPD動物模型,并對其進行行為學(xué)測試評估。

體質(zhì)量增長情況能從宏觀上反應(yīng)小鼠的抑郁狀態(tài)[7]。鼠李糖乳桿菌的干預(yù)能減緩小鼠產(chǎn)后體質(zhì)量增長率下降,各時相點相比,各組小鼠體質(zhì)量變化率增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,這可能與體質(zhì)量本身變化有關(guān)。24 h攝食量變化較平穩(wěn),呈整體下降趨勢,組間差異不顯著,可能該評價指標(biāo)對PPD動物模型不太敏感。

黑白箱實驗利用動物趨暗避光本能和探索本能對動物進行行為學(xué)評估[8]。造模后Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組小鼠白箱停留時間減少,干預(yù)后Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組小鼠白箱停留時間有所增加,提示鼠李糖乳桿菌對產(chǎn)后抑郁小鼠的行為有一定影響。造模結(jié)束后除Ⅴ組外,其余組小鼠白箱停留時間明顯減少,黑白箱穿梭次數(shù)也有所減少但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而鼠李糖乳桿菌干預(yù)能增加抑郁小鼠白箱停留時間,但對于黑白箱穿梭次數(shù)影響不大,可能需要其他的行為學(xué)實驗幫助鑒定。強迫游泳實驗和懸尾實驗都是利用動物的“行為絕望狀態(tài)”,衡量其抑郁情緒,也是常用的檢測抑郁行為的方法[9]。本實驗結(jié)果表明,鼠李糖乳桿菌干預(yù)后,抑郁小鼠不動狀態(tài)持續(xù)時間和懸尾不動時間明顯縮短,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示鼠李糖乳桿菌對產(chǎn)后抑郁小鼠的情緒有一定影響。Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組組間比較,各指標(biāo)變化不顯著(P>0.05),表明鼠李糖乳桿菌和帕羅西汀有類似的抗抑郁效果。Ⅰ組和Ⅱ組小鼠各指標(biāo)比較差別也不明顯,表示鼠李糖乳桿菌的低劑量和高劑量對各指標(biāo)的影響差異不大。

近年來,越來越多的研究將腸道微生物群與大腦的神經(jīng)反應(yīng)通過多種雙向途徑(微生物群-腸-腦軸)聯(lián)系起來,腸-腦軸也引起了國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。臨床研究和動物實驗都發(fā)現(xiàn),抑郁癥宿主的腸道菌群與健康對照組比較,都發(fā)生了明顯改變[10]。焦慮或抑郁等心理疾病可能與腸道菌群失調(diào)有關(guān),本研究選用鼠李糖乳桿菌作為干預(yù)用物。鼠李糖乳桿菌是革蘭氏陽性益生菌,存在于人和動物的腸道內(nèi),屬于目前公認(rèn)的益生菌。本研究結(jié)果提示,鼠李糖乳桿菌對產(chǎn)后抑郁小鼠的行為學(xué)有一定影響,但具體的作用機制還不十分明了。

以往研究[11]表明,腸道微生物比例失調(diào)引起機體抑郁情緒,其可能的機制包括:機體炎癥反應(yīng)學(xué)說,腸道菌群失調(diào),有害物質(zhì)增多,激活免疫系統(tǒng),使得機體炎癥反應(yīng)明顯,產(chǎn)生一系列免疫因子的釋放和應(yīng)答,影響腸系神經(jīng)系統(tǒng)進而導(dǎo)致腦部功能的紊亂,使機體情緒和行為發(fā)生相應(yīng)變化,引發(fā)抑郁癥[12]。此外,單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的改變,益生菌能產(chǎn)生多種神經(jīng)遞質(zhì),比如5-羥色胺、去甲腎上腺素等,它們能與宿主相互作用,從而影響大腦的功能[13]。這些神經(jīng)遞質(zhì)代謝水平失衡會導(dǎo)致病人精神活動和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的異常。研究[14]表明,用鼠乳桿菌喂食無菌焦慮和抑郁樣小鼠時,發(fā)現(xiàn)GABA受體表達會增加,GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一個重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),GABA 信號障礙通常都會與抑郁和焦慮相關(guān)聯(lián)。但對于臨床PPD而言,PPD與生理、心理和環(huán)境等諸多因素相關(guān),鼠李糖乳桿菌是否影響抑郁樣小鼠腸道菌群和神經(jīng)遞質(zhì)的變化,這都將是我們課題組繼續(xù)探索和研究的方向。

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