吳 鵬，邢俊娥，曹凌群，李少琳，熊 赟

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)，又稱老年癡呆病，是一種最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，隨著疾病的不斷發(fā)展嚴(yán)重危害著患者的身心健康，是癡呆病中最常見類型[1]。AD在臨床上最特征的表現(xiàn)為：進(jìn)行性的記憶力減退、認(rèn)知功能障礙和人格改變等。隨著我國人口老齡化，AD的發(fā)病率有逐年提高的趨勢[2]。該病病因迄今不明、發(fā)病機(jī)制也較為復(fù)雜，目前研究尚未證實其特定的有效作用機(jī)制，主要是以一些假說為主，包括：β淀粉樣蛋白(Amyloid β,Aβ)瀑布假說、Tau蛋白假說、基因突變及線粒體功能障礙假說、炎性機(jī)制和氧化應(yīng)激假說等，在上述假說中線粒體功能障礙在AD的早期改變中最具有特征性，可能是今后一段時間研究的熱點和治療的靶點[3-6]。本課題基于“線粒體障礙假說”發(fā)病機(jī)制出發(fā)，應(yīng)用多年的臨床經(jīng)驗方藿苓益智方探討AD小鼠腦內(nèi)線粒體通路神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，具體的實驗方法和結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：健康雄性SPF級SD小鼠100只，體重：(150±45)g，鼠齡：1～2個月，動物由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格證號:SCXK(桂)2005-0003。對所有動物的處置完全符合2006年由科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.1.2 藥物及試劑：藿苓益智方由茯苓、刺五加、淫羊藿、山藥4味中藥組成，由我院藥劑科統(tǒng)一采購，并按照藿苓益智方的比例和提取工藝進(jìn)行提取，濃縮，干燥，備用。鹽酸多奈哌齊片[衛(wèi)材(中國)有限公司制造，國藥準(zhǔn)字H20070181]。Aβ25-35由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒由美國Genzyme公司提供。四甲基偶氮唑鹽(MTT)由河北博海生物工程公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模方法：采用Aβ的活性片段Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡建立AD的細(xì)胞模型PC12細(xì)胞。用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的雙抗配成一定比例的DMEM培養(yǎng)基，后進(jìn)行分裝封口處理，培養(yǎng)基置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每4～5 d進(jìn)行1次細(xì)胞傳代，傳代時取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25胰酶將其加入到培養(yǎng)瓶中，輕微搖動培養(yǎng)瓶讓培養(yǎng)基細(xì)胞充分和胰酶接觸，然后再次放入培養(yǎng)箱約2 min后取出，在顯微鏡下觀察細(xì)胞突起開始收縮變圓時重新加入含血清的培養(yǎng)基中終止細(xì)胞消化，移液槍完全將細(xì)胞吹散，收集細(xì)胞液離心，離心后重新加入新鮮的培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液倒入15 ml離心管中，1000 r/min離心10 min去除上清液，將新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種于96孔培養(yǎng)板中，24 h后再次除去舊的培養(yǎng)基，加入不含血清的Aβ25-35培養(yǎng)基繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用于各項指標(biāo)檢測。

1.2.2 動物分組：本實驗設(shè)置六組，即對照組、Aβ25-35組、Aβ25-35+鹽酸多奈哌齊組、Aβ25-35+藿苓益智方提取物低劑量組(50 μg/ml)、藿苓益智方提取物中劑量組(100 μg/ml)、藿苓益智方提取物高劑量組(200 μg/ml)。對照組：DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h；Aβ25-35組：先在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，然后換成含有20 μmol/L Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；Aβ25-35+正常血清組：正常血清預(yù)處理24 h后加入20 μmol/L Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；Aβ25-35+鹽酸多奈哌齊組、Aβ25-35+藿苓益智方提取物組預(yù)處理24 h后加入20 μmol/L Aβ25-35的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 細(xì)胞存活率測定 采用MTT法檢測各組細(xì)胞存活率，觀察藿苓益智方提取物對Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞活性的影響。收集PC12細(xì)胞，按1.2.2所示的方法分組培養(yǎng)并處理細(xì)胞，根據(jù)測得的吸光度值(OD值)，來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。

1.4 凋亡定量檢測 采用流式細(xì)胞儀，Annexin V/PI雙染法檢測各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量。收集 PC12細(xì)胞，按1.2.2所示的方法分組培養(yǎng)并處理細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集細(xì)胞于離心管內(nèi)，孵育緩沖液洗滌1次，離心5 min棄上清液，加入100 μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞，室溫下孵育20 min，然后再進(jìn)行離心沖洗，最后加入10 μl Annexin V-FITC和Propidium Iodid混勻，4 ℃避光反應(yīng)20 min，并不時振動，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5 線粒體超微結(jié)構(gòu)檢測 采用Hoechst 33342染色，透射電鏡檢測各組神經(jīng)細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)變化。收集PC12細(xì)胞，按1.2.2所示的方法分組培養(yǎng)并處理細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后，用倒置熒光顯微鏡對各組細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察分析。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞存活率測定結(jié)果 本實驗采用MTT法檢測藿苓益智方提取物(50、100、200 μg/ml)以及鹽酸多奈哌齊片對PC12細(xì)胞活性的影響。結(jié)果如圖1所示，Aβ25-35組與對照組相比較細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)；藿苓益智方提取物50 μg/ml組的細(xì)胞存活率與Aβ25-35組相比有一定的增高(P<0.05)；鹽酸多奈哌齊組和藿苓益智方提取物(100、200 μg/ml)與Aβ25-35組相比，細(xì)胞存活率顯著升高(均P<0.01)，但藿苓益智方提取物200 μg/ml升高的更明顯。

2.2 凋亡的定量檢測結(jié)果 本研究利用流式細(xì)胞儀、Annexin V/PI雙染法對PC12細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行了定量分析。實驗結(jié)果如圖2所示，對照組細(xì)胞幾乎完好無損、Aβ25-35組細(xì)胞凋亡率則顯著升高(38.1%)。藿苓益智方低、中、高劑量+Aβ25-35組細(xì)胞凋亡率則逐步下降至23.8%、16.2%、7.4%，鹽酸多奈哌齊組下降至7.3%，與Aβ25-35組相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異。以上研究結(jié)果提示：藿苓益智方中、高劑量組能夠有效地抑制Aβ25-35對PC12細(xì)胞的損害，能有效地對神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

注： 與對照組比較，*P<0.01；與Aβ25-35組比較，△P<0.05，#P<0.01

2.3 線粒體超微結(jié)構(gòu)檢測 線粒體超微結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果如圖3所示，經(jīng)Hoechst 33342染色后，對照組細(xì)胞核均勻淡染呈圓形低強(qiáng)度藍(lán)色熒光，邊緣清晰；而Aβ25-35組細(xì)胞核出現(xiàn)較多深染固縮、核濃縮、不規(guī)則以及裂解的現(xiàn)象，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增加，呈現(xiàn)凋亡的典型特征。與Aβ25-35組，鹽酸多奈哌齊組細(xì)胞凋亡的數(shù)目下降明顯，同時藿苓益智方低、中、高劑量+Aβ25-35組上述現(xiàn)象在逐步緩解，細(xì)胞凋亡數(shù)目均有所減少，且呈劑量依賴性趨勢，表明藿苓益智方對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用。

注：與對照組比較，*P<0.01；與Aβ25-35組比較，△P<0.05，#P<0.01

圖3 各組細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)(HE染色，×400)

3 討 論

AD是一個復(fù)雜的多因素綜合病癥,中醫(yī)藥尤其復(fù)方中藥在治療AD方面具有一定優(yōu)勢，往往可以很好的起到多靶點調(diào)控的作用。通過我們十多年來的研究發(fā)現(xiàn)AD患者不僅在認(rèn)知障礙，而且大部分患者有人格和情感障礙，同時臨床上很多患者都有納差，大便溏等情況，這些臨床表現(xiàn)特征符合脾腎虧虛及心神不定的表現(xiàn)，同時研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)的“脾主運化”與線粒體能量生成存在也密切聯(lián)系[7-10]，因此，我們提出了AD治療當(dāng)以補(bǔ)腎健脾、安神益智為主。

根據(jù)上述理論我們研制出中藥驗方藿苓益智方，該方主要組成：刺五加、淫羊霍、茯苓、山藥等。其中淫羊藿具有補(bǔ)腎壯陽，益精安神作用，既可溫腎補(bǔ)陽、又可暖脾土，陳仕檢等[11]應(yīng)用淫羊藿苷對AD大鼠模型干預(yù)后發(fā)現(xiàn)可改善AD的癥狀。茯苓有寧心、健脾、利水滲濕的作用，脾的健運功能正常則痰濁不生，瘀血不滯，血脈能正常運行。研究顯示茯苓多糖主要通過抑制腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶合成，從而提高乙酰膽堿活性以起到改善學(xué)習(xí)記憶[12]。刺五加在《本草綱目》中被描述為“本經(jīng)上品”，研究發(fā)現(xiàn)[13]具有補(bǔ)氣、抗衰老、抗疲勞、強(qiáng)意志的功能，楊坦等[14]研究發(fā)現(xiàn)刺五加皂苷能明顯改善衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。山藥，性平穩(wěn)，具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、益肺生津、補(bǔ)腎澀精的功效，具有抗氧化、抗衰老等藥理作用。上述藥相輔相成，補(bǔ)腎健脾，延緩衰老。

本實驗提示藿苓益智方對AD的治療中可對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用，改善細(xì)胞存活率，減少線粒體細(xì)胞凋亡。人體的細(xì)胞中幾乎都存在著線粒體，線粒體作為細(xì)胞的動力站能源源不斷產(chǎn)生能量，為細(xì)胞的生命活動提供大約95%的能量[15-16]。我們通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)線粒體異常是AD病理的早期特征[17]。AD患者腦內(nèi)出現(xiàn)大量神經(jīng)元丟失的重要原因之一是神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[18]，細(xì)胞凋亡是機(jī)體組織為了清除衰老或受損細(xì)胞的自我保護(hù)的一種方式，凋亡信號的不同在細(xì)胞中也同樣引發(fā)不同的凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中本課題研究的線粒體通路是細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性通路，實驗研究表明在細(xì)胞凋亡調(diào)控活動中線粒體占據(jù)著中心的地位，其在凋亡程序化死亡信號傳導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[19-20]。通過本實驗我們發(fā)現(xiàn)：藿苓益智方可提高細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞凋亡，同時能夠有效地抑制Aβ25-35對PC12細(xì)胞的毒性，阻止并延緩AD的進(jìn)展。