劉 丹，胥 旸，邢曉靜

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng)110167；2.遼寧省腫瘤醫(yī)院血液乳腺內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng)110042)

乳腺癌是發(fā)病率較高的一種惡性疾病，對(duì)健康有著極大的危害[1]。三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)是指檢查結(jié)果中孕激素受體(Progesterone receptor，PR)、雌激素受體(Estrogen receptor，ER)以及人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2(Human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)表達(dá)均為陰性的一種特殊類型的乳腺癌[2]。三陰性乳腺癌患者在治療過(guò)程當(dāng)中缺少靶點(diǎn)，內(nèi)分泌及靶向治療導(dǎo)致患者預(yù)后差，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率及死亡率很高促使人們探索有效的抗腫瘤藥物[3]。近年來(lái)，中草藥的抗腫瘤、抗癌癥作用，越來(lái)越受人們的關(guān)注，鴉膽子苦醇(Brusatol，BRU)是中草藥苦木科植物鴉膽子分離出的苦木內(nèi)酯類成分之一喹諾酮[4]，具有抗腫瘤、抗炎癥、抗病毒及抗寄生蟲等多種藥理活性[5]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并且能促進(jìn)其凋亡，對(duì)乳腺癌[6]、肝癌[7]、肺癌[8]、前列腺癌[9]、胰腺癌[10]和結(jié)直腸癌[11]等多種癌細(xì)胞具有增殖抑制作用，本研究目的主要探討鴉膽子苦醇對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑：三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株由遼寧省腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，鴉膽子苦醇(BRU)購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：F0818AS CAS:14907-98-3)，DMEM培養(yǎng)液購(gòu)于HYCLONE有限公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)于CLARK公司 ，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma有限公司，胰蛋白酶購(gòu)自GIBCO有限公司，PBS購(gòu)于GENVEW有限公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司，Annexin V-FITC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京義翹神州科技有限公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物有限公司。

1.1.2 儀 器：CO2培養(yǎng)箱(Thermo scientific公司 德國(guó))，超凈工作臺(tái)(安泰空氣技術(shù)有限公司)，熒光顯微鏡(Leica公司)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Bio-RAD公司)，高速離心機(jī)(Eppendorf公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶解藥物：BRU用二甲基亞砜(DMSO)避光溶解，配制初始濃度為5 mmol/L，分裝以待后用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代：三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于配制的含12% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，根據(jù)情況2～3 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，棄去舊培養(yǎng)液，加入PBS約1～2 ml清洗細(xì)胞再棄去PBS，加入1～2 ml胰蛋白酶(含EDTA)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化3 min左右，至細(xì)胞變圓脫離底部，立即取出培養(yǎng)皿，向其中直接加入6 ml左右新培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打皿底使之形成單個(gè)細(xì)胞分散的細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞懸液到離心管中，800 r/min離心5 min后棄去上清，在離心管沉淀中加入新培養(yǎng)液10 ml左右反復(fù)吹打，直到細(xì)胞沉淀完全形成單個(gè)細(xì)胞分散的細(xì)胞懸液，將懸液一傳四的移入培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，然后繼續(xù)孵育，放于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.2.3 用CCK-8法檢測(cè)鴉膽子苦醇對(duì)細(xì)胞增殖抑制的影響：三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，密度調(diào)整為1×105個(gè)/ml，制備細(xì)胞懸液，并接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加100 μl，置于37 ℃飽和溫度，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h，待細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組中分別加入10 μl不同濃度(5、10、20、40 μmol/L)的含藥培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加入10 μl DMSO，每個(gè)濃度梯度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(OD值)，按照公式：抑制百分率=[(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%，根據(jù)5個(gè)復(fù)孔的平均OD值來(lái)計(jì)算各藥物濃度組細(xì)胞的抑制百分比，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，計(jì)算IC50。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞，調(diào)整密度為3×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2 ml，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70%左右時(shí)，據(jù)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)得出的BRU的 IC50，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為5、10、20、40 μmol/L的含BRU的培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加入新培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后消化收集細(xì)胞于離心管中，用4℃預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，800 r/min 5 min離心后去上清，用1×Binding Buffer重懸細(xì)胞至細(xì)胞密度為0.1×107～1×107個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至一個(gè)流式管中，每管100 μl，在每管細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC及5 μl 7-AAD，輕輕混勻，設(shè)置單染，雙染以及對(duì)照，在室溫(25 ℃)避光孵育15 min，加入400 μl 1×Binding Buffer終止反應(yīng)，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，F(xiàn)low jov10軟件分析，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞，調(diào)整為密度3×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于6孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2 ml，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70%左右，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為5、10、20、40 μmol/L的含BRU的培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加入新培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，胰酶(無(wú)EDTA)消化細(xì)胞收集于離心管中，1000 r/min 5min離心后去上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，2000 r/min 5 min離心后去上清，在細(xì)胞中加入提前準(zhǔn)備好的體積分?jǐn)?shù)為70%冷乙醇500 μl固定(2 h至過(guò)夜)，4 ℃保存。染色前用PBS洗去固定液，1000 r/min 5 min離心后去上清，加入提前配制好的500 μl PI/RNase A染色工作液，室溫避光30～60 min，流式細(xì)胞儀去上機(jī)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 鴉膽子苦醇對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率 鴉膽子苦醇對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用顯著，且具有時(shí)間和劑量的依賴性，24、48和72 h的生長(zhǎng)抑制率分別為:19.58%～60.73%、26.11%～81.35%和29.19%～84.48%。且IC50值分別為23.71、13.49、10.27 μmol/L，各組間鴉膽子苦醇對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，鴉膽子苦醇對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨藥物濃度的增加而增高，呈劑量-效應(yīng)正相關(guān)，并且隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞的抑制作用也相應(yīng)提高，呈時(shí)間-效應(yīng)正相關(guān)。見表1。

表1 鴉膽子苦醇對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率

2.2 鴉膽子苦醇對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響 鴉膽子苦醇作用MDA-MB-231細(xì)胞48 h后，結(jié)果顯示(圖1):鴉膽子苦醇對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞有明顯的凋亡促進(jìn)作用，隨著濃度的提高，細(xì)胞凋亡率也相應(yīng)增加，5、10、20、40 μmol/L的BRU處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h后，藥物各濃度組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。表明鴉膽子苦醇可濃度依賴性的誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。

圖1 不同濃度鴉膽子苦醇誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡

2.3 鴉膽子苦醇對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響 用濃度為5、10、20、40 μmol/L的鴉膽子苦醇作用MDA-MB-231細(xì)胞48h后，結(jié)果顯示，濃度越高，細(xì)胞G0/G1期的比例越高，S及G2/M期的比例則下降，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。說(shuō)明BRU可阻滯MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯于G0/G1期，并進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖2)。

圖2 不同濃度鴉膽子苦醇處理MDA-MB-231細(xì)胞后各周期比例

3 討 論

近年來(lái)，隨著乳腺癌的發(fā)病率越來(lái)越高，已成為多發(fā)病以及常見病,尤其三陰性乳腺癌是乳腺癌治療中最棘手的一種，死亡率最高、且最容易復(fù)發(fā)，中醫(yī)認(rèn)為該病是多種因素交互錯(cuò)雜而生成的疾病，中醫(yī)藥在乳腺癌的治療中的地位也日益提升，中藥的有效成分對(duì)乳腺癌的基礎(chǔ)性研究也越來(lái)越多[12]，鴉膽子為中草藥苦木科植物鴉膽子的干燥成熟果實(shí)，其性寒味苦，歸大腸和肝經(jīng)，是中國(guó)的傳統(tǒng)中藥，被收錄于《中國(guó)藥典》，鴉膽子具有清熱解毒、殺蟲、截瘧、止痢等眾多功效，可用于治療熱毒血痢、瘧疾、雞眼、疣等?，F(xiàn)代藥理活性研究表明，鴉膽子具有抗炎癥、抗瘧疾、抗病毒、抗腫瘤以及降血糖等多方面的作用，其中抗癌作用及機(jī)制現(xiàn)已有眾多研究[13]，鴉膽子含有多種的化學(xué)成分，其中含量相對(duì)較高的成分則為苦木內(nèi)酯類，并且具有較強(qiáng)的抗腫瘤，抗炎等多種生物活性[14]，鴉膽子苦醇則是苦木內(nèi)酯的主要代表性化合物[15]，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦醇可以快速而短暫的抑制結(jié)腸腫瘤細(xì)胞Nrf-2信號(hào)通路，降低胞內(nèi)Nadph的水平，抑制DNA的合成，可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[16]。王敏等[17]研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦醇可下調(diào)Nrf-2，降低Notch1及下游蛋白的表達(dá)，從而抑制了A549、H460細(xì)胞的增殖，并促使細(xì)胞凋亡。崔玲娣等[18]研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦醇可抑制Nrf-2表達(dá)，并誘導(dǎo)ERS，較低劑量的鴉膽子苦醇可顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡。本研究主要探究鴉膽子苦醇作用于三陰性乳腺癌細(xì)胞的作用，研究結(jié)果顯示鴉膽子苦醇對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞體外也有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。其抑制作用隨給藥濃度的增加或作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的濃度和時(shí)間的依賴關(guān)系。已知從一個(gè)細(xì)胞周期階段到下一個(gè)細(xì)胞周期階段，包括分裂間期以及分裂期，分裂期即是M期，分裂間期包括G0/G1/S/G2期，若某一期出現(xiàn)異常，則細(xì)胞的分化，增殖將出現(xiàn)問題[19]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞G1期是周期啟動(dòng)的一個(gè)重要調(diào)控點(diǎn)，當(dāng)細(xì)胞G1期出現(xiàn)異常則無(wú)法進(jìn)入S期進(jìn)行細(xì)胞周期[20]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鴉膽子苦醇濃度越高，細(xì)胞G0/G1期的比例越高，S/G2/M期比例則減少，鴉膽子苦醇可以將三陰性乳腺癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，并且誘導(dǎo)其凋亡，細(xì)胞的凋亡率隨著藥物濃度的增加也顯著增高，三陰性乳腺癌細(xì)胞的凋亡研究成為臨床學(xué)者研究的一個(gè)熱點(diǎn)，細(xì)胞的凋亡主要有內(nèi)在途徑和外在途徑，與細(xì)胞生命活動(dòng)有密切關(guān)系的線粒體，對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控也起到重要的作用，Bcl-2蛋白家族通過(guò)控制線粒體通透性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，應(yīng)進(jìn)一步探究細(xì)胞的凋亡及其凋亡機(jī)制，為臨床提供新的治療方法。綜上所述，鴉膽子苦醇對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞體外的生長(zhǎng)有顯著抑制作用，不僅能阻滯MDA-MB-231細(xì)胞的增殖并且能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，其是潛在的臨床治療三陰性乳腺癌的藥物，后續(xù)將進(jìn)一步研究鴉膽子苦醇促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制。