馬紅靜，馬民凱，馬紅建，陳新苗，侯冰潔

(保定市第四中心醫(yī)院，河北 保定 072350)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是由環(huán)境、遺傳和自身免疫等多種致病因素導致的機體內(nèi)代謝紊亂，胰島素分泌缺陷或功能障礙引發(fā)胰島素抵抗和缺乏，主要以血糖持續(xù)處于高水平狀態(tài)為特征的臨床綜合征[1]。2型糖尿病病因復雜，患者由胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷，血漿胰島素水平可正?；蛏?，通常可不依賴胰島素治療，多數(shù)患者可進行系統(tǒng)管理模式治療，如醫(yī)學營養(yǎng)治療、規(guī)律的運動治療及藥物治療等綜合治療，有助于控制血糖水平[2]。此型糖尿病的發(fā)病機制尚無統(tǒng)一定論，有報道稱[3-4]，2型糖尿病的發(fā)生與遺傳因素和環(huán)境因素關系密切，可影響胰島功能的發(fā)揮，以胰島素抵抗為主，出現(xiàn)一系列感染炎癥性表現(xiàn)及代謝紊亂，可并發(fā)復雜性并發(fā)癥。近年來，有關中醫(yī)藥治療糖尿病的基礎研究和臨床報道越來越多，關于中藥及其復方治療糖尿病的機制研究亦不斷深入。目前，中醫(yī)藥治療糖尿病取得較為顯著的療效，對于抑制炎癥反應、提高免疫功能及改善胰島素功能體現(xiàn)了明顯的效果，對糖尿病的治療提供了有效的思路。本研究以中藥復方通絡散結湯為研究對象，對灌胃給予通絡散結湯的2型糖尿病大鼠血及脾臟組織中炎癥因子及T淋巴細胞表達情況進行了檢測，闡明了通絡散結湯治療該病的作用機制，為臨床應用提供了良好的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠50只，體重(190±10)g，雄性，購自北京維通利華實驗動物中心[動物合格證號：SCXK(京)2002-0006]。

1.2 實驗儀器、藥物及試劑 藥物：通絡散結湯(黃芪40 g，生地黃15 g，黨參、當歸、夏枯草、僵蠶各10 g,丹參、牡蠣各20 g，川芎12 g，地龍5 g，水蛭粉1 g，甘草6 g) ，把上述藥味采用常規(guī)水煎煮方法，以10倍量藥材的水浸泡30 h，先大火煮沸以后小火繼續(xù)煎煮1 h，過濾取濾液，殘渣再加入10倍量的水煎 30 min，再過濾，合并兩次濾液，濃縮至1 g(生藥材)/ml。試劑：鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)購于北京索萊寶公司；實驗檢測血清各炎癥因子指標所需試劑盒均購自上海西唐生物科技有限公司；實驗檢測指標CD4+、CD8+所需ELISA試劑盒，均購自上海西唐生物科技有限公司；BCA蛋白測定試劑盒，購自美國Thermo公司；TNF-α抗體、IL-6抗體、CRP抗體、β-actin抗體及辣根過氧化物酶標記二抗均購自杭州弗德生物技術有限公司；ECL發(fā)光液和硝酸纖維素膜，購自美國Millipoer公司。儀器：G-421-1型血糖儀購置愛奧樂醫(yī)療器械有限公司；SpectraMax iD5-多功能酶標儀(上海美谷分子)；H1650R臺式高速離心機(湖南湘儀)。

1.3 實驗動物模型建立 SD大鼠50只，體重(190±10)g，均于標準實驗室基礎飼料適應性喂養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表法隨機分組，即正常對照組(M組)10只和高脂高糖飼料組40只。造模方法：M組大鼠持續(xù)予SPF級飼料喂養(yǎng)，其余造模組大鼠均給予高糖高脂高營養(yǎng)飼料(高糖高脂飼料配比為：豬油16.5%，白糖20%，膽酸鈉1.5%，膽固醇2%，高營養(yǎng)飼料60%)喂養(yǎng)，連續(xù)8周。8周后，禁食12 h，高脂高糖飼料組大鼠一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液(60 mg/kg)，M組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。繼續(xù)喂養(yǎng)72 h，依據(jù)大鼠空腹血糖即尾靜脈血糖≥16.7 mmol/L為判定造模成功標準。造模成功后，共篩選糖尿病模型大鼠30只，分為：模型對照組(N組)10只；通絡散結湯高劑量組(S組)10只、低劑量組(T組)10只。

1.4 動物分組及給藥 通絡散結湯大鼠用藥劑量根據(jù)《中藥藥理方法學》人和動物按體表面積折算的等效劑量以及高、低劑量計算法確定。S組(10 g/kg，按生藥材量計)、T組(5 g/kg)組，采用灌胃途徑按照各組藥物劑量給藥，N組和M組予等體積生理鹽水代替灌胃，每天2次，連續(xù)2周，期間各組大鼠正常飲食。

1.5 取材及檢測指標 灌胃給藥結束后，各組大鼠均禁食12 h，可不禁水，于大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)使其麻醉，抽取腹主動脈血，常溫靜置2 h于4 ℃離心，離心后取上清液用于檢測血清(Fasting plasma glucose，F(xiàn)BG)、TC、TG、TNF-α、IL-6、CRP、CD4+、CD8+等濃度。隨后于實驗室解剖臺上快速摘取大鼠脾臟，用生理鹽水進行沖洗，吸干水分，液氮中保存，用于Western blotting法檢測，步驟如下：取處理好的脾臟組織，混入組織裂解液，震蕩裂解為看不見的顆粒，離心提取蛋白，于沸水中煮沸10 min，冷卻離心后取上清液加入制備好的凝膠，放入槽內(nèi)進行電泳，浸入轉膜液中轉膜，后放入盛有配好的牛奶的器皿中室溫封閉過夜，稀釋適當比例的一抗稀釋液(CD4+、CD8+、β-actin均為1∶1000)室溫孵育2 h，取PVDF膜浸入稀釋后的辣根酶標記的二抗(稀釋濃度為1∶5000)溶液室溫孵育1 h，最后掃膜壓片成像并進行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參，結果以目的蛋白灰度值(β-actin)灰度值表示。

2 結 果

2.1 通絡散結湯對2型糖尿病大鼠血糖血脂水平的影響 見表1。與M組比較，N組大鼠血清中FBG、TC、TG等血糖及血脂水平均顯著升高(P<0.05)；與N組比較，S組、T組大鼠血清中FBG、TC、TG等血糖及血脂水平均顯著降低(P<0.05)。

表1 通絡散結湯對2型糖尿病大鼠血糖血脂水平的影響(mmol/L)

2.2 通絡散結湯對2型糖尿病大鼠血清中炎癥因子濃度的影響 見表2。與M組比較，N組大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP濃度均顯著升高(P<0.05)；與N組比較，S組、T組大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP濃度均顯著降低(P<0.05)。

表2 通絡散結湯對2型糖尿病大鼠血清中炎癥因子濃度的影響

2.3 通絡散結湯對2型糖尿病大鼠血清中CD4+、CD8+T淋巴細胞表達的影響 見表3。與M組比較，N組大鼠血清中CD4+T淋巴細胞濃度顯著升高(P<0.05)，CD8+濃度均顯著降低(P<0.05)，CD4+/CD8+比值顯著升高；與N組相比，S、T組CD8+濃度顯著升高(P<0.05)，CD4+/CD8+比值顯著降低(P<0.05)。

表3 通絡散結湯對2型糖尿病大鼠血清中CD4+、CD8+T淋巴細胞表達的影響

2.4 通絡散結湯對2型糖尿病大鼠脾臟組織中CD4+、CD8+T淋巴細胞蛋白表達的影響 與M組比較，N組大鼠組織中CD4+濃度顯著升高，CD8+濃度顯著降低(P<0.05)；與N組比較，S組、T組D4+水平均顯著降低(P<0.05)，CD8+水平均顯著升高(P<0.05)。見圖1。

注：與M組比較，*P<0.05；與N組比較，#P<0.05

3 討 論

中醫(yī)方面，糖尿病可歸屬于“消渴病”范疇，消渴病屬于慢性病，部分患者可發(fā)展為醫(yī)“消渴病心病”“消渴病腎病”。其主要病因病機為：飲食失節(jié)、情志失調(diào)、勞力損傷等導致氣血陰陽失調(diào)，導致氣滯、血瘀、痰濁、寒凝等痹阻心脈與腎絡，血瘀氣滯，脈絡不通，心陽腎陽不足，故疲倦乏力，血瘀氣滯，脈絡不通?；诖死碚?，消渴病實屬本虛標實之證，本虛以心脾腎虧虛為主，標實指痰濁、水濕、瘀血、毒邪等，宜以補虛扶弱、活血化瘀為臨床治則之一[6]。本研究中所用方劑由黃芪、黨參、生地黃、當歸、丹參、川芎、地龍、水蛭、牡蠣、夏枯草、僵蠶、甘草組成，具有益氣養(yǎng)陰、通絡散結的功效。現(xiàn)代藥理研究證明，方中諸多藥味均具有調(diào)節(jié)血糖水平和改善血液流變學特征作用，黃芪可有效降低T2DM大鼠血糖水平，降低炎癥因子釋放，調(diào)控炎癥反應，改善胰島素抵抗，控制T2DM的進展[7]；生地黃對調(diào)節(jié)細胞葡萄糖自身平衡有顯著作用，另外還可調(diào)節(jié)腸道菌群，使機體內(nèi)各種菌群處于平衡狀態(tài)[8]；丹參能改善微循環(huán)，加快血液流速、增加血流量作用[9]；水蛭可通過和凝血酶的直接結合而發(fā)揮抗凝抗凝、抗栓、纖溶作用[10]；牡蠣除具有降糖作用外，對四氧嘧啶所致的小鼠胰腺細胞也有一定的保護作用[11]。

T淋巴細胞是由人體多能干細胞分化而來，經(jīng)血液循環(huán)分布至各免疫器官，其數(shù)量穩(wěn)定且比值保持動態(tài)平衡，通過血液及淋巴管等再循環(huán)，發(fā)揮有效的免疫調(diào)節(jié)功能，維持機體免疫系統(tǒng)平衡。CD4+是一種標志性輔助性T細胞，可輔助并調(diào)控其他淋巴細胞免疫反應；CD8+是一種標志性細胞毒性T淋巴細胞，可殺滅受到感染的細胞，維持機體免疫應答，機體的免疫功能可用CD4+/CD8+來表示，其比值高低代表機體免疫機能的強弱，二者成正比關系[3]。研究發(fā)現(xiàn)[3]，2型糖尿病患者血糖持續(xù)處于高水平狀態(tài)，影響機體T淋巴細胞的成熟、分化及功能，使其總數(shù)下降，CD4+/CD8+失調(diào)，降低CD4+T淋巴細胞增殖、釋放，抑制其免疫應答，導致免疫系統(tǒng)紊亂，促進胰島β細胞損傷，胰島功能障礙，產(chǎn)生抗體，或分泌胰島素失衡，出現(xiàn)胰島素抵抗，加重糖尿病的進展[8]。本試驗結果顯示，與M組相比較，N組大鼠血清炎性因子CD4+濃度顯著升高，CD8+濃度顯著降低，與N組相比較，S組、T組大鼠血清炎性因子CD4+濃度均顯著降低，CD8+濃度顯著升高，表明糖尿病大鼠細胞免疫功能降低，通絡散結湯可糾正糖尿病大鼠免疫失控狀態(tài)，改善細胞免疫功能。

糖尿病的發(fā)病機制十分復雜，尚不十分明確，目前多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)炎癥學說參與其發(fā)病[12]。研究表明，2型糖尿病患者由于持續(xù)高血糖水平可誘發(fā)炎癥反應，屬于慢性炎癥性疾病[13-14]。炎癥因子可作為始動因素，與胰島素抵抗的發(fā)生關系密切，大量炎癥因子通過抑制其磷酸化，減少胰島素受體，阻礙葡萄糖轉運途徑，降低胰島素效應，發(fā)生高胰島素血癥。此外，機體處于炎癥環(huán)境下，異常表達的炎癥因子可作用于胰島素信號通路，干擾并抑制其信號轉導，引發(fā)胰島素抵抗[15]。炎癥因子中，與糖尿病的發(fā)生發(fā)展關系密切的指標為TNF-α、IL-6、CRP，TNF-α是由活化的單核巨噬細胞分泌的一種蛋白，可激活和刺激其他炎癥因子的分泌，產(chǎn)生強烈的炎癥反應，其信號傳導活躍，干擾胰島細胞內(nèi)信號通路；CRP是一種炎癥性蛋白質(zhì)，介導NF-κB產(chǎn)生炎癥反應，促使炎癥因子的合成、釋放，進一步加重胰島素抵抗，代謝功能紊亂，致使內(nèi)皮細胞受損，誘發(fā)轉移抑制因子的產(chǎn)生，從而導致糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[16]； IL-6是由活化的成纖維細胞和T淋巴細胞產(chǎn)生的一類細胞因子，功能廣泛，具有調(diào)節(jié)免疫和促進炎癥反應作用，能夠溶解脂肪細胞，損傷胰島β細胞，導致其凋亡，從而降低胰島素受體數(shù)目，抑制糖、脂肪代謝，進而使胰島素信號通路受到阻礙，導致胰島素抵抗[17]。本試驗結果顯示，與M組相比較，N組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6、CRP水平均明顯升高，與N組相比較，S組、T組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、CRP水平均明顯降低，表明處于高血糖水平的2型糖尿病大鼠體內(nèi)存在各種炎癥反應，與目前文獻報道相一致[18]，而通絡散結湯可降低2型糖尿病大鼠體內(nèi)相關炎癥因子水平，緩解炎癥反應，改善2型糖尿病。