于 臻，程汝珍，張 偉，吳 丹，張琳琳

（1.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）以進(jìn)行性記憶減退及其他認(rèn)知功能障礙、精神行為異常和日常生活能力下降為主要臨床癥狀[1]，90%于65歲以后發(fā)病，是最常見的癡呆原因[2]。目前我國(guó)AD患者超過(guò)1 000萬(wàn)，是全球AD患者數(shù)量最多的國(guó)家[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，益腎化濁方可有效改善輕度AD患者臨床癥狀[4]。在此基礎(chǔ)上，本研究選取3月齡SAMP8小鼠作為研究對(duì)象，旨在觀察益腎化濁方對(duì)其學(xué)習(xí)記憶能力及精神行為的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)3月齡雄性SAMP8小鼠20只，體質(zhì)量20～25 g，3月齡雄性抗快速老化小鼠（senescence-accelerated-resistant mouse-1，SAMR1）小鼠10只，體質(zhì)量20～25 g，均由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。飼養(yǎng)于天津市南開醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，明暗交替12 h/12 h，室溫23～25℃，相對(duì)濕度為50%～60%，自由攝食與飲水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有操作遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南》[5]。

1.2 藥物與主要儀器 益腎化濁方組成：女貞子10 g，淫羊藿 10 g，肉蓯蓉 10 g，制何首烏 6 g，石菖蒲6 g，川芎6 g，一次性購(gòu)于天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房。為保證灌胃期間藥物的穩(wěn)定性[6]，便于保存同時(shí)利于質(zhì)量控制，將上述中藥飲片提取濃縮、真空冷凍干燥后制成中藥復(fù)方凍干粉，于陰涼干燥處密封保存?zhèn)溆谩?/p>

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州英峪予華儀器有限公司，RE-201D），原位凍干機(jī)（無(wú)錫沃信儀器有限公司，VS-502FD），Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司ZS-001），ANY-maze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)（美國(guó)Stoelting公司）及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)箱，高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，ZS-DSG）。

1.3 分組及干預(yù) 將20只SAMP8小鼠隨機(jī)分成模型（SAMP8）組、益腎化濁方（YSHZ）組各 10只，10只SAMR1小鼠作為對(duì)照組。各組小鼠進(jìn)行灌胃干預(yù)：YSHZ組予以益腎化濁方，模型組和對(duì)照組予以蒸餾水。YSHZ組給藥劑量參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[7]中體表面積法，根據(jù)人（70 kg）與小白鼠（20 g）之間0.002 6的折算系數(shù)進(jìn)行計(jì)算，按患者每日服用益腎化濁方生藥48 g，則20 g小鼠每日生藥量為0.124 8 g，即生藥6.24 g/kg，將上述益腎化濁方中藥復(fù)方凍干粉用蒸餾水配成相應(yīng)濃度的藥液。各組小鼠每日灌胃1次，持續(xù)12周。

1.4 Morris水迷宮 灌胃結(jié)束后參照Vorhees等[8]實(shí)驗(yàn)方案，向水迷宮的圓形水池中注入清水使水深達(dá)30 cm，加入黑色復(fù)配著色劑使水呈現(xiàn)為不透明的黑色，水溫控制在21～22℃。將黑色的目標(biāo)平臺(tái)隱藏于第一象限水面下1 cm，以進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)。

1.4.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 每天每只小鼠進(jìn)行4次檢測(cè)，共持續(xù)5 d。小鼠入水后，系統(tǒng)自動(dòng)跟蹤記錄數(shù)據(jù)。若小鼠在65 s內(nèi)登上平臺(tái)，則系統(tǒng)自動(dòng)停止記錄，逃避潛伏期時(shí)間即為記錄時(shí)間；若超過(guò)65 s，則逃避潛伏期時(shí)間系統(tǒng)自動(dòng)記錄為65 s，同時(shí)引導(dǎo)小鼠到平臺(tái)上停留10 s。

1.4.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 定向航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日將水池中平臺(tái)移除，每只小鼠檢測(cè)1次，從平臺(tái)對(duì)側(cè)位置即第三象限內(nèi)投放，系統(tǒng)自動(dòng)跟蹤記錄小鼠入水后65 s內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)。

1.5 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 將小鼠放于清潔的方形曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)箱內(nèi)，使用ANY-maze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，以記錄5 min內(nèi)各只小鼠的活動(dòng)總距離及進(jìn)入中心區(qū)域的次數(shù)。每次小鼠測(cè)試結(jié)束后，均用酒精充分擦拭檢測(cè)箱以防小鼠間氣味或者臟物的干擾。

1.6 高架十字迷宮 參照Walf等[9]實(shí)驗(yàn)方案，將小鼠置于儀器中開放臂和封閉臂的連接處，面朝實(shí)驗(yàn)者對(duì)側(cè)的開放臂，用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)記錄其5 min內(nèi)的活動(dòng)情況，并計(jì)算其在開放臂內(nèi)停留時(shí)間的比例。同曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，在每次測(cè)試后用酒精擦拭儀器，待其揮發(fā)后再進(jìn)行下只小鼠測(cè)驗(yàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，正態(tài)分布數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均值、標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；多組間比較采用方差分析，連續(xù)變量的比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)計(jì)量資料以中位數(shù)、四分間距M（IQR）表示，組間比較采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益腎化濁方對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.1.1 平均游泳速度 各組小鼠5 d的游泳速度數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明各組間小鼠體能情況基本相同，可排除游泳速度對(duì)逃避潛伏期的影響。見表1。

表1 各組小鼠游泳速度估算的邊際均值比較（±s）

表1 各組小鼠游泳速度估算的邊際均值比較（±s）

分組 n 平均游泳速度/cm·s-1）SAMR1 組 10 18.65±1.04 SAMP8 組 10 16.85±1.09 YSHZ 組 10 17.69±1.04

2.1.2 逃避潛伏期 各組小鼠5 d逃避潛伏期時(shí)間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，經(jīng)Mauchly球形檢驗(yàn)（P＜0.05），采用 Greenhouse-Geisser進(jìn)行校正，結(jié)果顯示：時(shí)間因素P＜0.05，說(shuō)明各組小鼠的逃避潛伏期均隨時(shí)間的變化而變化，且時(shí)間與分組因素存在交互作用（P＜0.05），說(shuō)明不同組的逃避潛伏期不相等。事后多重比較結(jié)果顯示：與SAMR1組相比，SAMP8組及YSHZ組小鼠逃避潛伏期均顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）；與SAMP8組相比，YSHZ組小鼠避潛伏期明顯縮短（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠逃避潛伏期估算的邊際均值比較（±s）

表2 各組小鼠逃避潛伏期估算的邊際均值比較（±s）

注：與SAMR1組比較，*P＜0.05；與SAMP8組比較，#P＜0.05。

分組 n 逃避潛伏期/s SAMR1 組 10 32.57±1.49 SAMP8 組 10 56.52±1.49*YSHZ 組 10 39.01±1.49*#

2.1.3 穿越平臺(tái)次數(shù) 經(jīng)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：與SAMR1組相比，SAMP8組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P＜0.05），而YSHZ組與之相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與 SAMP8組相比，YSHZ組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較（M（IQR））

2.2 益腎化濁方對(duì)SAMP8小鼠精神行為的影響

2.2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)：與SAMR1組小鼠相比，SAMP8組小鼠活動(dòng)總距離及進(jìn)入中心區(qū)域次數(shù)均顯著減少（P＜0.05），而YSHZ組與之相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與SAMP8組相比，YSHZ組小鼠活動(dòng)總距離及進(jìn)入中心區(qū)域次數(shù)均顯著增加（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表4 各組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

注：與SAMR1組比較，*P＜0.05；與SAMP8組比較，#P＜0.05。

分組 進(jìn)入中心區(qū)域次數(shù)SAMR1 組 17.50±5.72 n 10 SAMP8 組 5.00±2.97*10 YSHZ 組 16.33±4.18#10總距離（m）7.32±0.99 2.34±1.50*5.62±0.67*#

2.2.2 高架十字迷宮結(jié)果 經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)：與SAMR1組小鼠相比，SAMP8組和YSHZ組小鼠在開放臂停留時(shí)間的占比均顯著減少（P＜0.05），但與SAMP8組相比，YSHZ組小鼠在開放臂停留時(shí)間的占比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表5。

表5 各組小鼠高架十字迷宮結(jié)果比較（±s）

表5 各組小鼠高架十字迷宮結(jié)果比較（±s）

注：與 SAMR1 組比較，*P＜0.05。

分組 n 開放臂停留時(shí)間比例/%SAMR1 組 10 51.54±20.19 SAMP8 組 10 9.88±5.82*YSHZ 組 10 18.12±0.31*

3 討論

AD屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)“健忘”“癡呆”等病證范疇[10]，其根本病機(jī)在于腎虛，兼有痰瘀濁邪[11]，因此采用益腎化濁法以切中肯綮。該法由著名中醫(yī)腦病專家張伯禮院士提出，課題組成員在傳承其經(jīng)驗(yàn)及研究成果的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年的臨床實(shí)踐和專家建議，以法組方并進(jìn)行了優(yōu)化。益腎化濁方由6味中藥組成，方中女貞子并制首烏以增滋腎陰之功，淫羊藿合肉蓯蓉以強(qiáng)溫腎陽(yáng)之力，4藥合用以于“陰中求陽(yáng)，陽(yáng)中求陰”；石菖蒲豁痰開竅、川芎活血行氣，使津液得布、氣血通利。美國(guó)國(guó)立老化研究所和阿爾茨海默病協(xié)會(huì)強(qiáng)調(diào)AD的病理改變?cè)谄渑R床癥狀出現(xiàn)前15～20年就已經(jīng)開始，因此早期干預(yù)對(duì)于預(yù)防或延緩其進(jìn)一步發(fā)展具有重要意義。

快速老化小鼠（SAM）[12]是日本ToshioTakeda教授在京都大學(xué)研發(fā)，并由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的韓景獻(xiàn)教授引進(jìn)入我國(guó)[13]，其中SAMP8小鼠是目前公認(rèn)的研究衰老和AD的動(dòng)物模型[14]。隨著月齡的增加，雄性SAMP8小鼠不僅行為活動(dòng)減少、反應(yīng)下降，外觀上皮膚毛發(fā)欠光澤、晦暗、粗糙，并出現(xiàn)脫毛、皮膚潰瘍、眼睛損害和脊柱后凸的老化征象及情緒失調(diào)、晝夜節(jié)律紊亂等[15-16]，且伴增齡性學(xué)習(xí)記憶能力障礙[17]。研究顯示，SAMP8小鼠4月齡出現(xiàn)早期學(xué)習(xí)和記憶障礙[18]，5月齡時(shí)已出現(xiàn)焦慮抑郁相關(guān)的精神行為異常[19]。而中醫(yī)認(rèn)為衰老的出現(xiàn)與腎虛密切相關(guān)[20]，故SAMP8小鼠是進(jìn)行本研究的理想模型。

行為學(xué)評(píng)價(jià)是衡量動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力及其精神行為的主要標(biāo)準(zhǔn)[21]。Morris水迷宮是評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的經(jīng)典方法[22]，利用動(dòng)物厭惡水而被迫游泳、學(xué)習(xí)尋找水中隱藏平臺(tái)的本能進(jìn)行檢測(cè)。涉及兩大經(jīng)典實(shí)驗(yàn)：一是定向航行實(shí)驗(yàn)，主要用于考察動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力，其中，動(dòng)物找到隱匿平臺(tái)所需的時(shí)間為逃避潛伏期，該時(shí)間的長(zhǎng)短與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力成反比；二是空間探索實(shí)驗(yàn)，主要反映動(dòng)物對(duì)空間記憶的維持能力[23]。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮則是研究動(dòng)物精神行為的常用測(cè)試，前者用于分析小鼠活動(dòng)和焦慮樣行為[24]，小鼠受到壓力時(shí)在曠場(chǎng)中的活動(dòng)減少，而其焦慮程度較低時(shí)更傾向于在曠場(chǎng)的中央?yún)^(qū)域活動(dòng)；后者利用嚙齒動(dòng)物對(duì)保護(hù)區(qū)域如封閉臂的偏好及探索新環(huán)境的天性之間的矛盾來(lái)考察其焦慮狀態(tài)，在開放臂中停留時(shí)間越長(zhǎng)顯示其焦慮程度較低。

本次研究結(jié)果顯示，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中各組小鼠在游泳速度無(wú)顯著差異的前提下，與SAMR1組小鼠相比，SAMP8組小鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯增加，表現(xiàn)出一定的學(xué)習(xí)記憶障礙；在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與SAMR1組相比，SAMP8組小鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，說(shuō)明該小鼠對(duì)于前5d的學(xué)習(xí)記憶保持較差；而經(jīng)過(guò)益腎化濁方干預(yù)后，SAMP8小鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)也顯著增加，提示益腎化濁方能有效改善SAMP8小鼠早期學(xué)習(xí)記憶能力減退。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮結(jié)果顯示，與SAMR1組相比，SAMP8組小鼠總運(yùn)動(dòng)距離、進(jìn)入中心區(qū)域次數(shù)及在開放臂停留的時(shí)間比例顯著減少，提示SAMP8小鼠的精神行為異常；在使用益腎化濁方干預(yù)后，SAMP8小鼠總運(yùn)動(dòng)距離和進(jìn)入中心區(qū)域次數(shù)均顯著增加，在開放臂停留的時(shí)間比例有增加的趨勢(shì)，但尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明益腎化濁方具有一定的抗焦慮作用，考慮進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)樣本量予以確認(rèn)。

綜上所述，益腎化濁方可有效改善SAMP8小鼠早期學(xué)習(xí)記憶能力減退及精神行為異常，今后將進(jìn)行具體機(jī)制的探索。