祁大慶，陳琳慧，萬林春

（1.杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，浙江 杭州 310000；2.江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，江西 南昌 330029）

胃癌（gastric cancer）的臨床發(fā)病率及死亡率在各類腫瘤中位于前列[1]。雖然胃癌的發(fā)病率在過去20年中有所下降，但它仍然是世界上最常見的癌癥之一[2-4]。在胃癌中最常見的類型是腺癌，其它類型的胃癌相對罕見[5]。胃癌的傳統(tǒng)治療方法為外科手術(shù)結(jié)合術(shù)后局部或全身放療，具有一定的療效。但無論是手術(shù)技術(shù)和方法的改進(jìn)還是放療設(shè)備和技術(shù)的進(jìn)步，都沒有顯著改善胃癌患者的5年生存率。在臨床實(shí)踐中，胃癌的藥物治療主要用于無法手術(shù)或晚期患者的姑息治療?，F(xiàn)有的化療藥物例如5-氟尿嘧啶、順鉑等治療胃癌的臨床療效并不理想[6]。因此，從中成藥組成中尋找抗癌活性物質(zhì)現(xiàn)在研究領(lǐng)域的科研熱點(diǎn)[7-9]。

胃復(fù)春膠囊由紅參、香茶菜、枳殼（炒）配伍而成，具有健脾益氣、活血解毒的功效?？捎糜谥委熚赴┌┣捌诓∽?，胃癌手術(shù)后輔助治療、慢性淺表性胃炎屬脾胃虛弱證者[10]。胃復(fù)春對抑制腫瘤細(xì)胞的生長有很多報道，但胃癌的作用機(jī)制尚未闡明。本研究旨在探討胃復(fù)春膠囊提取物對胃癌MGC-803細(xì)胞活性、凋亡及凋亡相關(guān)的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）和Bcl-2家族蛋白表達(dá)量的影響，為揭示胃復(fù)春膠囊的抗癌活性、作用機(jī)理及臨床應(yīng)用前景提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 胃復(fù)春膠囊提取物（國藥準(zhǔn)字Z20090697）購買自杭州胡慶余堂有限公司；人胃癌細(xì)胞系MGC-803細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；青霉素、鏈霉素、胎牛血清購于美國Invitrogen公司；CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒購于賽信通（上海）生物試劑有限公司；Hoechst 33258核酸染料購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；AnnexinV-FITC/PI雙染色細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640，細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒均購于上海元龍生物技術(shù)有限公司；Bcl-2、Bax、Casepase-3、Casepase-9、β-actin 等抗體均購于上海哈靈生物科技有限公司；DSMO及其它分析純化學(xué)試劑購于北京試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)于濕度飽和，含青霉素（100 U·mL-1）、鏈霉素（100 μg·mL-1）、10%胎牛血清的PMI1640培養(yǎng)液中。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件：37℃，含5% CO2。實(shí)驗(yàn)選取對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 選取濃度為1×105mL-1的MGC-803細(xì)胞，以200 μL/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入終濃度為0、25、50、100 μg·mL-1的胃復(fù)春膠囊提取物（樣品事先溶解于DMSO）。每一濃度均設(shè)置5個復(fù)孔，以終濃度為0作為空白對照，分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸去藥液，每孔加入含10%的CCK-8的培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)孵化4 h，用分光光度計(jì)在450 nm下測定各孔吸光度值（A）。

1.2.3 Hoechst 33258染色細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn) 取濃度為 1×105mL-1的 MGC-803 細(xì)胞，以 200 μL/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入終濃度為0、25、50、100 μg·mL-1的胃復(fù)春膠囊提取物，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，以冷的PBS清洗細(xì)胞1次，加入4%多聚甲醛，在室溫下固定15 min，再以冷的PBS清洗2 次，室溫下加入 1 mmol·L-1Hoechst 33258，染色15 min，封片，在340 nm激發(fā)光下使用熒光顯微進(jìn)行觀察。

1.2.4 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測 根據(jù)制造商的說明，使用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測早期和晚期細(xì)胞凋亡。MGC-803細(xì)胞以4×105mL-1濃度接種于12孔板，待細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入終濃度分別為 0、25、50、100 μg·mL-1的胃復(fù)春膠囊提取物培養(yǎng)24 h，然后用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，收集細(xì)胞并用PBS洗滌。將細(xì)胞重新懸浮在400 μL Annexin結(jié)合緩沖液中，然后在室溫下與 AnnexinV-FITC（5 μL）和 PI（10 μL）孵育 5 min。用流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）檢測MGC-803細(xì)胞的凋亡。另取每孔細(xì)胞用冷的PBS洗滌2次，4℃下70%乙醇預(yù)冷固定24 h，PBS洗滌2次，加入PI染色液，暗染30 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.2.5 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量檢測 取1×106mL-1濃度的MGC-803細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入胃復(fù)春膠囊提取物，使終濃度達(dá)到 0、25、50、100 μg·mL-1，處理 24 h 后，收集細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書的方法，提取細(xì)胞質(zhì)中的總蛋白并測定其濃度。以肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)標(biāo)做 Western blot分析，檢測 Bcl-2、Bax、Casepase-3 和Casepase-9的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃復(fù)春膠囊提取物對MGC-803細(xì)胞增殖的抑制作用 胃復(fù)春膠囊提取物分不同濃度進(jìn)行處理24 h后，用CCK-8法測定細(xì)胞活力。如圖1所示，在濃度 30～100 μg·mL-1范圍內(nèi)胃復(fù)春膠囊提取物對MGC-803細(xì)胞活力都能體現(xiàn)出顯著且呈劑量依賴性地抑制效應(yīng)。

2.2 胃復(fù)春膠囊提取物可誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞產(chǎn)生凋亡 作為一種細(xì)胞通透性核復(fù)染色劑，Hoechst33258核酸染料與dsDNA結(jié)合后能被活細(xì)胞吸收并激發(fā)藍(lán)色熒光。胃復(fù)春膠囊提取物處理組MGC-803細(xì)胞核濃縮、碎裂，有較強(qiáng)的藍(lán)色熒光（如圖2所示）。

流式細(xì)胞儀雙染色結(jié)果表明，胃復(fù)春膠囊提取物能誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。如圖3所示，25、50、100 μg·mL-1的 胃 復(fù) 春膠囊 提 取 物 處 理MGC-803細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率分別為（20.4±2.7）%、（41.3±6.2）%、（68.8±5.8）%，明顯高于對照組凋亡率（3.8±1.6）%（P＜0.05），且其作用具有明顯劑量依賴性。

圖3 胃復(fù)春膠囊提取物可誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡（流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC和PI雙染色實(shí)驗(yàn)）

2.3 胃復(fù)春膠囊提取物可阻滯MGC-803細(xì)胞周期不同濃度胃復(fù)春膠囊提取物（25、50、100 μg·mL-1）處理MGC-803細(xì)胞24 h后，G0/G1期細(xì)胞比例增加，而G2/M期與S期細(xì)胞比例減少。其中，100 μg·mL-1胃復(fù)春膠囊提取物處理組中，G0/G1期細(xì)胞比例由48.51%大幅度增至77.08%（P＜0.01），而S期細(xì)胞比例由37.03%降低至19.39%（P＜0.01），G2/M期細(xì)胞比例由14.46%降低至3.53%（P＜0.01）。結(jié)果說明胃復(fù)春膠囊提取物使MGC-803細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，正常的細(xì)胞增殖周期被抑制。

不同濃度胃復(fù)春膠囊提取物（25、50、100 μg·mL-1）處理24 h后，MGC-803細(xì)胞周期分布如表1所示。

表1 胃復(fù)春膠囊提取物處理后MGC-803細(xì)胞周期的變化

2.4 胃復(fù)春膠囊提取物對MGC-803細(xì)胞Bcl-2、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、Bax 表達(dá)量的影響 如圖4A所示，未用胃復(fù)春膠囊提取物處理的MGC-803細(xì)胞中cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9表達(dá)量較低。而經(jīng)過胃復(fù)春膠囊提取物（濃度分別為 25、50、100 μg·mL-1） 處理 24 h 后，MGC-803細(xì)胞中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)量顯著增加。此外，胃復(fù)春膠囊提取物可以濃度依賴地上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量，且濃度依賴地下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量（β-actin作為內(nèi)參）。因此胃復(fù)春膠囊提取物處理后的細(xì)胞中Bcl-2/Bax的比例顯著降低。利用Image J軟件對Western Blot條帶進(jìn)行灰度分析和柱狀圖構(gòu)建，蛋白表達(dá)量變化如圖4B 所示，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖4 胃復(fù)春膠囊提取物對MGC-803細(xì)胞中Bax，Bcl-2，cleaved Caspase-3，cleaved Caspase-9表達(dá)量的影響

3 討論

包括民族醫(yī)藥學(xué)在內(nèi)的中醫(yī)藥是防治癌癥的有力武器。對比化學(xué)藥物，中藥往往具有原料方便易得、價格低廉、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。在臨床實(shí)踐中，中藥對于癌癥患者在減輕癥狀、預(yù)防復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、提升生活質(zhì)量、延長生存時間、降低放化療不良反應(yīng)風(fēng)險等方面具有優(yōu)勢。近年來，學(xué)術(shù)界對于單味藥和復(fù)方中成藥的抗癌活性研究逐漸成為成為研究的焦點(diǎn)[13-15]。胃復(fù)春膠囊臨床主要適應(yīng)證為脾胃虛弱、胃癌、慢性淺表性胃炎、胃炎等，具有較為廣泛的藥理活性。藥理學(xué)研究表明胃復(fù)春具有抗腫瘤、抑制幽門螺旋菌、抗胃黏膜上皮化生（腸化），升高環(huán)磷腺苷等作用。然而，胃復(fù)春膠囊提取物的體外抗腫瘤活性研究還不夠深入，對腫瘤細(xì)胞作用的具體機(jī)理尚不清楚，本文重點(diǎn)研究了胃復(fù)春膠囊提取物對胃癌細(xì)胞活力和凋亡的影響。

Hoechst33258是一種能穿透細(xì)胞膜對DNA進(jìn)行染色的核染色試劑，插入雙鏈DNA后發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光。由于Hoechst 33258是一種具有膜通透性的熒光染料，正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞均可被Hoechst 33258染色，但正常細(xì)胞核呈圓形，淺藍(lán)色，或深藍(lán)色顆粒；凋亡細(xì)胞核因濃縮而呈亮藍(lán)色，或細(xì)胞核分葉狀、碎裂、邊緣化。結(jié)果表明，胃復(fù)春膠囊提取物能顯著增強(qiáng)MGC-803細(xì)胞的藍(lán)色熒光，提示胃復(fù)春膠囊提取物能增加細(xì)胞膜通透性，誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞產(chǎn)生凋亡[16-17]。

人體自我調(diào)節(jié)機(jī)制之一是體內(nèi)多細(xì)胞生物維持內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定，細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的熱點(diǎn)，也是評價抗癌藥物療效的重要指標(biāo)之一[18-20]。此次研究發(fā)現(xiàn)，胃復(fù)春膠囊提取物在 0～100 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)對人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖有抑制作用，24 h后胃復(fù)春膠囊提取物可劑量依賴地誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡。

Caspase家族蛋白是一類存在于細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)構(gòu)相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶。它們的一個重要相似之處是活性位點(diǎn)含有半胱氨酸，可斷開天冬氨酸殘基肽鍵[21]。Caspase家族蛋白與細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征變化（如細(xì)胞膜空泡形成、核膜破裂、染色質(zhì)聚集和邊聚及DNA斷裂等）以及一些生化改變關(guān)系密切，這類蛋白的激活被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的直接效應(yīng)器。在本次研究中，發(fā)現(xiàn)胃復(fù)春膠囊提取物可以濃度依賴性的方式增加MGC-803細(xì)胞中cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9的表達(dá)。cleaved Caspase-9主要參與細(xì)胞凋亡的起始，cleaved Caspase-3可參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行，它們可通過降解PARP，導(dǎo)致DNA修復(fù)的抑制并啟動DNA的降解[22]。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示胃復(fù)春膠囊提取物可能是通過增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)Caspase活性抑制細(xì)胞增殖，并進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的目的。

Bcl-2是一種特殊的蛋白組群，Bcl-2組群中bad、bid、Bax 等可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2 組群中Bcl-2、Bcl-w可以阻止細(xì)胞凋亡。Bcl-2是一種內(nèi)膜蛋白主要存在于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜中，在多種腫瘤細(xì)胞中均有高表達(dá)，它可以阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，提高線粒體膜電位，進(jìn)而抑制鈣釋放，阻止核酸內(nèi)切酶激活，從而起到抗凋亡作用；與Bcl-2不同，Bax能直接激活Caspase或改變細(xì)胞膜通透性，使細(xì)胞色素C通過細(xì)胞膜釋放一些離子和小分子，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2與Bax的比值大小能夠影響細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bcl-2占多數(shù)時，細(xì)胞具有抗凋亡作用；相反，當(dāng)Bax過度表達(dá)時，細(xì)胞往往容易發(fā)生凋亡[23-25]。本研究發(fā)現(xiàn)胃復(fù)春膠囊提取物作用24 h后，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/Bax比值升高，與胃復(fù)春膠囊提取物的凋亡作用呈正相關(guān)。提示胃復(fù)春膠囊提取物通過調(diào)節(jié)促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。由于胃復(fù)春膠囊提取物不是單一靶點(diǎn)起作用，具有多靶點(diǎn)性。因此，進(jìn)一步研究胃復(fù)春膠囊提取物誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡的機(jī)制、阻斷細(xì)胞傳導(dǎo)通路和信使的相關(guān)研究對其臨床應(yīng)用具備很好的指導(dǎo)意義。

綜上所述，胃復(fù)春膠囊提取物能抑制MGC-803細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，增加Caspase-9的活性、增加Caspase-3的活性，從而促使胃癌細(xì)胞的凋亡。本研究為中醫(yī)藥治療胃癌提供了新的思路。