崔喜喜，韓宗昌，李記天，李無陰，張 虹，△

（1．河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2．河南省洛陽正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院，河南 洛陽 471002）

骨髓炎（osteomyelitis）是臨床上常見的感染性疾病，多發(fā)生于四肢長管狀骨，急性期治療不及時(shí)易發(fā)展為慢性骨髓炎，嚴(yán)重者可致畸致殘，影響患者生活質(zhì)量[1-2]。無論是急性骨髓炎還是慢性骨髓炎，在臨床上均以抗生素治療為主[3-4]，慢性骨髓炎長期反復(fù)應(yīng)用抗生素容易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，這對(duì)臨床治療產(chǎn)生不良影響[5]，因此亟需尋找一種新型治療方法或研發(fā)一種靶向藥物來治療骨髓炎。大量臨床數(shù)據(jù)顯示中醫(yī)藥治療骨病療效顯著，且能夠避免耐藥性[6-8]，因此有必要深入探索中醫(yī)藥治療骨髓炎的有效方法及藥物作用機(jī)制。

中醫(yī)古籍對(duì)骨髓炎有著明確的記載，多數(shù)醫(yī)家將其歸為“附骨疽”“骨蝕”[9]，《黃帝內(nèi)經(jīng)》描述：“虛邪之入于身也深……，內(nèi)傷骨為骨蝕”。中醫(yī)學(xué)根據(jù)發(fā)病癥狀總結(jié)為早期邪毒壅盛，氣血阻滯，辨證屬熱毒熾盛；中期毒熱內(nèi)盛，氣血耗損，辨證屬正虛邪滯；后期熱毒傷陰，正氣虛損，辨證屬氣陰兩虛?？v觀整個(gè)發(fā)病過程，多存在“毒、虛”的臨床特點(diǎn)，因此有醫(yī)家將“益氣解毒”作為治療骨髓炎的核心原則。

劉艷等[7]總結(jié)不同醫(yī)家治療骨髓炎的用藥規(guī)律，分析了100條方劑，涉及162味中藥，發(fā)現(xiàn)金銀花、黃芪為高頻中藥。金銀花味甘，性寒，歸肺、心、胃經(jīng)[10-11]，具有清熱解毒的功效，現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)其含有綠原酸類化合物[12]、黃酮類化合物[13]等活性成分，并證實(shí)其廣譜抗菌、抗病毒、增強(qiáng)免疫的功效[10-13]。黃芪味甘，性微溫，歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣固表、利尿、托毒排膿、生肌的功效，被譽(yù)為補(bǔ)氣之圣藥[14]。金銀花配伍黃芪能清熱解毒兼以補(bǔ)益氣血，符合中藥治療骨髓炎的用藥特點(diǎn)[7，15]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過大數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)藥物多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療疾病的可能機(jī)制，分子對(duì)接技術(shù)是通過受體與藥物分子之間的相互作用，從分子水平上模擬驗(yàn)證中藥有效成分作用于疾病的科學(xué)依據(jù)。基于此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎可能的作用機(jī)制，并采用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，為臨床用藥提供理論支持，同時(shí)為新藥的研發(fā)提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分的篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索“金銀花”“黃芪”獲得其活性成分信息，并設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18進(jìn)行篩選。

1.2 藥物作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與疾病靶點(diǎn)查詢 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，獲取化合物的靶點(diǎn)，并在 Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中對(duì)各靶點(diǎn)人類基因簡(jiǎn)稱進(jìn)行查詢轉(zhuǎn)化，獲取相關(guān)基因。在 GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//auth.lifemapsc.com）中以“osteomyelitis”為檢索詞進(jìn)行檢索，獲取骨髓炎已知的相關(guān)靶基因。

1.3 共同靶點(diǎn)的確定 在網(wǎng)站（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）中導(dǎo)入藥物作用靶點(diǎn)和疾病作用靶點(diǎn)的相關(guān)基因數(shù)據(jù)，繪制Venny圖獲取藥物（金銀花和黃芪）靶點(diǎn)與疾?。ü撬柩祝┌悬c(diǎn)的交集為共同靶點(diǎn)，即為金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎的潛在靶點(diǎn)。

1.4 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將確定的藥物成分、疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2（美國）構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。在獲取的結(jié)果圖中，各個(gè)節(jié)點(diǎn)代表著可能存在的化合物和靶蛋白，線條代表著化合物和靶蛋白的相互作用。使用Cytoscape3.8.2中網(wǎng)絡(luò)分析（Network analyzer）功能，對(duì) Degree、Betweenness Centrality（BC）和 Closeness Centrality（CC）進(jìn)行分析，以獲取金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎的主要活性成分。

1.5 蛋白相互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將藥物和疾病的靶點(diǎn)導(dǎo)入在線系統(tǒng)Bisogenet進(jìn)行擴(kuò)展，然后取交集初步獲得金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎的直接和間接靶點(diǎn)，設(shè)置上述獲得靶點(diǎn)Degree的2倍中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，然后運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲕浖﨏ytoNCA進(jìn)行分析，根據(jù)Degree、BC、CC等參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步篩選，以準(zhǔn)確的深度挖掘金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎的直接或間接作用靶點(diǎn)，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.6 生物通路的分析 在Metascape數(shù)據(jù)庫中將金銀花-黃芪藥對(duì)的作用靶標(biāo)進(jìn)行基因本體論（GO）分析與京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，得到通路富集結(jié)果，將相關(guān)篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為P＜0.01。

1.7 分子對(duì)接 利用AutoDock及Pymol軟件將金銀花-黃芪藥對(duì)中的主要活性成分與靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接并可視化，計(jì)算關(guān)鍵活性成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子結(jié)合能，并以結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol為判定標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎的科學(xué)性。

2 結(jié)果

2.1 藥物的活性成分及相應(yīng)靶蛋白 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共檢索出236種金銀花活性成分、87種黃芪活性成分，篩選后得到符合標(biāo)準(zhǔn)的金銀花活性成分23種，黃芪活性成分20種，如黃酮類、環(huán)烯醚萜類和生物堿類化合物，這些化合物很有可能就是金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎的主要活性成分群。詳見表1、表2。

表1 金銀花生物活性成分

表2 黃芪生物活性成分

2.2 藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及共同靶點(diǎn)的確定 在Uniprot數(shù)據(jù)庫中輸入潛在靶點(diǎn)的PDB ID，并剔除重復(fù)的基因靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//auth.lifemapsc.com）中以“Osteomyelitis”為檢索詞進(jìn)行檢索，獲取已知的疾病靶點(diǎn)953個(gè)。取兩者交集的共同靶點(diǎn)共21個(gè)，這些為金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎的可能靶基因，并繪制Venny圖。詳見表3、圖1。

表3 藥物治療疾病的潛在靶標(biāo)

圖1 共同靶點(diǎn)

2.3 成分-靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 以預(yù)測(cè)的21個(gè)基因作為金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎的靶點(diǎn)，使用Cytoscape3.8.2建立金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。排名前5的關(guān)鍵成分分別為quercetin、kaempferol、ursolic acid、apigenin、luteolin，這些成分對(duì)治療骨髓炎有重要的作用。詳見表4。

圖2 藥物治療骨髓炎的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表4 主要活性成分拓?fù)鋮?shù)

2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Bisogenet進(jìn)行擴(kuò)展，CytoNCA進(jìn)行分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。設(shè)置 Degree為 12、BC 為 0.013907、CC 為 0.53、LAC為 28.025、Neighborhood Conne（NC）為 13.3125 為篩選條件進(jìn)行篩選并取交集為核心蛋白，見圖4。結(jié)果顯示排名前 3的是 HSPA5、MAP3K14、DHX9，表明這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用，可能是金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 藥物治療骨髓炎PPI圖

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中的核心蛋白

2.5 交集基因的GO和KEGG通路富集分析 將21個(gè)藥物與疾病的共同靶點(diǎn)映射到Metascape數(shù)據(jù)庫中，篩選背景選擇為“Human”進(jìn)行生物學(xué)功能富集，富集條件設(shè)置為 P Value Cutoff=0.01、Min Enrichmen=1.5，系統(tǒng)的分析其生物過程并選擇排名前5的進(jìn)行圖例展示。GO富集中交集基因主要參與了對(duì)細(xì)菌的反應(yīng)、對(duì)無機(jī)物的反應(yīng)、活性氧化過程、對(duì)腫瘤壞死因子的反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)等，見圖5。

圖5 GO功能富集分析條形圖

圖6和圖7-1中的顏色的深淺代表富集程度，顏色越深代表富集程度越高。圖7-2中不同顏色節(jié)點(diǎn)代表不同通路，見表5。

圖6 KEGG通路富集分析條形圖

圖7 KEGG通路富集分析

表5 信號(hào)通路基本信息

2.6 分子對(duì)接結(jié)果與分析 將篩選出的排名前3的quercetin、kaempferol、ursolic acid 及排名前 3 的核心靶點(diǎn)HSPA5、MAP3K14、DHX9分別輸入PUBCHEM、PDB數(shù)據(jù)庫中，以結(jié)合能≤ -5.0 kJ/mol為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)關(guān)鍵活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果顯示9組配對(duì)中兩兩之間對(duì)接的親和力均小于-5.0 kJ/mol，表明藥物活性成分與核心靶點(diǎn)之間具有較好的結(jié)合性，證明金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎科學(xué)有效，見圖8、表6。選取均排名第1的quercetin和HSPA5進(jìn)行對(duì)接流程展示，見圖9。

圖8 分子對(duì)接結(jié)果

圖9 quercetin和HSPA5的對(duì)接結(jié)果

表6 分子對(duì)接能

3 討論

骨髓炎是臨床上常見的骨病之一，急性骨髓炎得到合適治療后一般愈后較好，但治療不徹底就轉(zhuǎn)變?yōu)槁怨撬柩祝洳∏檫w延難愈將嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[3]。早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有其病因病機(jī)的記載，隋代醫(yī)家巢元方將該病稱為“附骨疽”并沿用至今[16]。該病基本病機(jī)為體質(zhì)虛弱，邪毒內(nèi)侵，壅遏成膿[8]。臨床上主要治療原則為清熱解毒，益氣養(yǎng)陰。通過對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)檢索及臨床用藥總結(jié)[7-9，17]，發(fā)現(xiàn)金銀花是常用的抗菌消炎類中藥，為治療“癰疽”的主要用藥之一，也有部分學(xué)者稱其為“中藥抗生素”，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其主要化學(xué)成分為為有機(jī)酸類、環(huán)烯醚萜類和黃酮類，多數(shù)文獻(xiàn)[18-20]也對(duì)其提取物的抗菌消炎作用進(jìn)行討論，但研究結(jié)論較為單一。黃芪為臨床上最常用的補(bǔ)虛類中藥之一，現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)其主要化學(xué)成分包括多糖、皂苷類、黃酮類等，具有抗氧化應(yīng)激、提高免疫力的功效[21]。臨床中瘡瘍、癰疽之病，初起多實(shí)中伴虛，后期多虛中夾實(shí)。金銀花善解實(shí)毒，黃芪善治虛，因此常相配伍用于治療瘡瘍、癰疽。黃貴華等[17]認(rèn)為金銀花配黃芪，有清熱解毒消腫、扶正托膿生肌之效，可用于各個(gè)時(shí)期的瘡瘍、癰疽。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從有效成分、通路和基因蛋白方面探討金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎的作用機(jī)制。首先篩選金銀花、黃芪的活性成分和骨髓炎相應(yīng)的靶蛋白，得到符合標(biāo)準(zhǔn)的有21個(gè)。進(jìn)一步使用Cytoscape3.8.2建立金銀花治療骨髓炎的網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn) quercetin、kaempferol、ursolic acid、apigenin、luteolin 5種成分與疾病的靶點(diǎn)相關(guān)性較高，這些有效成分主要調(diào)控成骨細(xì)胞的代謝平衡、血管的生成和凋亡、改善內(nèi)環(huán)境的炎癥反應(yīng)等。其中槲皮素的潛在連接靶點(diǎn)最高，槲皮素具有抗氧化作用，能夠通過清除ROS，避免其激活NF-kB和AP-1的活性而導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，從而減少氧化應(yīng)激誘發(fā)的炎癥反應(yīng)[22]。也有學(xué)者[23]通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠影響腫瘤壞死基因的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞白介素的分泌，改善早期骨髓炎的癥狀。多數(shù)慢性骨髓炎患者病情反復(fù)，其重要原因之一為免疫力低下[24]。山柰酚作為最常見的黃酮類化合物，具有良好的抗菌活性，尤其對(duì)耐甲氧青霉素的金黃色葡萄球菌有良好的抑制作用。慕靜靜等[25]通過在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)了山柰酚能夠調(diào)控T淋巴細(xì)胞體外活化和增殖，改善機(jī)體免疫力。王倩等[26]發(fā)現(xiàn)木犀草素能抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，影響菌體核酸及蛋白質(zhì)的合成，有效抑制金黃色葡萄球菌的活性。喬林等[27]提出金黃色葡萄球菌是慢性骨髓炎的最主要致病菌，因此中藥治療骨髓炎可能是通過殺滅金黃色葡萄球菌實(shí)現(xiàn)的。綜合來看，金銀花-黃芪藥對(duì)的活性成分功能集中在抗氧化應(yīng)激、提高免疫力、減少細(xì)胞凋亡、抗炎抗菌4個(gè)方面。

對(duì) PPI網(wǎng)絡(luò)分析可知，HSPA5、MAP3K14、DHX9等蛋白可能為金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。HSPA又被稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，其定位在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，作為鈣離子結(jié)合蛋白能輔助蛋白質(zhì)恢復(fù)正常的構(gòu)象，在應(yīng)激狀態(tài)下轉(zhuǎn)移內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的錯(cuò)誤折疊蛋白，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[28]。同時(shí)也有研究[29]發(fā)現(xiàn)，HSPA5能降低細(xì)胞對(duì)殺傷性T細(xì)胞的敏感程度來抑制細(xì)胞凋亡。樊鳳艷等[30]通過在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HSPA5的表達(dá)能夠抑制炎性因子mRNA的表達(dá)，為中藥調(diào)控HSPA5治療骨髓炎提供了理論依據(jù)。MAP3K14屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）超級(jí)家族，參與信號(hào)的跨膜傳導(dǎo)，與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡密切相關(guān)[31]。曹洪慶等[32]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MAP3K14能夠調(diào)節(jié)miR-17-5P的表達(dá)參與細(xì)胞的凋亡。LIU等[33]也通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MAP3K14能介導(dǎo)炎性細(xì)胞死亡，控制炎癥。DHX9又稱為核DNA解旋酶II或RNA解旋酶A，主要由DExH解旋酶和DExD解旋酶構(gòu)成，在核糖核酸的轉(zhuǎn)錄翻譯等方面起著重要的調(diào)控作用。研究[34]表明DHX9能夠激活P53信號(hào)引起凋亡或衰老反應(yīng)。多數(shù)研究結(jié)果表明，細(xì)菌、炎癥和免疫力低下是骨髓炎發(fā)病的關(guān)鍵因素，佐證了金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎的科學(xué)性。

GO富集結(jié)果表明金銀花-黃芪藥對(duì)與細(xì)菌的反應(yīng)、對(duì)無機(jī)物的反應(yīng)、活性氧化過程、對(duì)腫瘤壞死因子的反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)?，F(xiàn)代研究[35]證實(shí)骨髓炎的發(fā)病主要是因?yàn)閯?chuàng)傷或異物的存在引起細(xì)菌大量繁殖而誘發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，而本研究結(jié)果也證實(shí)了金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎是通過抗菌、消炎、抗氧化、提高免疫力等途徑實(shí)現(xiàn)的。KEGG通路富集結(jié)果同樣驗(yàn)證了以上結(jié)論，KEGG通路主要涉及TNF信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、HIF-1信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、結(jié)核通路等。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，金銀花-黃芪藥對(duì)的有效成分（quercetin、kaempferol、ursolic acid）與（HSPA5、MAP3K14、DHX9）自發(fā)結(jié)合，且結(jié)合活性較強(qiáng)（均＜-5.0 kJ/mol），提示金銀花-黃芪藥對(duì)能夠調(diào)控骨髓炎的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白治療骨髓炎，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的金銀花-黃芪藥對(duì)治療骨髓炎的核心靶點(diǎn)的科學(xué)性。

綜上所述，金銀花-黃芪藥對(duì)確實(shí)能多靶點(diǎn)、多途徑治療骨髓炎，主要通過抗氧化應(yīng)激、提高免疫力、減少細(xì)胞凋亡、抗炎抗菌4個(gè)途徑來發(fā)揮治療作用。金銀花、黃芪的多種有效活性成分之間密切聯(lián)系，在治療骨髓炎的過程中共同發(fā)揮著重要作用。