張夢(mèng)迪，彭小林，吳 巖，韓開林，劉 振，孫 華

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457)

糖尿病是人類生活中最常見的代謝性疾病之一，以高血糖和高脂血癥為主要特征，并伴隨多種并發(fā)癥，包括神經(jīng)病變、腎病、心臟病、中風(fēng)和血管疾病[1].2 型糖尿病約占糖尿病患病人數(shù)的90%以上，其病因是胰島素分泌不足或胰島素抵抗引起的血糖升高[2].目前治療2 型糖尿病的口服藥物有α–葡萄糖苷酶抑制劑、磺脲類、噻唑烷二酮類、二甲雙胍和中成藥等.α–葡萄糖苷酶通過水解低聚糖的1，4–α–糖苷鍵釋放葡萄糖，是消化碳水化合物過程的最后一步.α–葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制小腸黏膜刷狀緣的α–葡萄糖苷酶活性，減緩低聚糖和二糖中葡萄糖的釋放，從而降低餐后血糖水平，延緩葡萄糖吸收[3–4].磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)抑制合成代謝過程，刺激產(chǎn)生能量的分解代謝過程，降低血糖水平[5].AMPK活化也會(huì)抑制乙酰輔酶A 羧化酶(ACC)活性和丙二酰輔酶A 的產(chǎn)生，從而抑制脂肪合成和刺激脂肪酸氧化.

四環(huán)吲哚衍生物是一類代表性的生物堿，廣泛存在于植物和微生物代謝產(chǎn)物中，具有多種生物活性[6–7].本課題組曾經(jīng)報(bào)道了一系列新型四環(huán)吲哚衍生物的合成以及抑制α–葡萄糖苷酶活性的研究[8–9].其中，四環(huán)吲哚衍生物化合物7i 具有較強(qiáng)的α–葡萄糖苷酶抑制活性，但其作用機(jī)制以及體內(nèi)是否具有降血糖和降血脂活性尚不清楚.因此，本研究旨在探討化合物7i 能否改善糖尿病小鼠的高血糖和高血脂等癥狀，并進(jìn)一步研究該化合物的抑制α–葡萄糖苷酶作用機(jī)制以及其他可能的作用靶點(diǎn).

1 材料與方法

1.1 材料

化合物7i(圖1)由天津科技大學(xué)藥物設(shè)計(jì)與合成研究室合成(純度＞95%)[10].

圖1 化合物7i的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of compound 7i

來源于酵母的α–葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)、對(duì)硝基苯基–α–D–吡喃葡萄糖苷(pNGP)、4，4′–二苯胺–1，1′–聯(lián)萘–5，5′–二磺酸二鉀鹽(Bis-ANS)、油紅O溶液、3–異丁基–1–甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、油酸、棕櫚酸、亞油酸、花生四烯酸、阿卡波糖，Sigma-Aldrich 公司；透析袋(MD 34-3.5-5)、DAPI 染料，北京索萊寶生物科技有限公司；人肝癌細(xì)胞HepG2、前脂肪細(xì)胞3T3-L1，中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所；胰島素，諾和諾德(中國)制藥有限公司；洛伐他汀(10μmol/L)，南京草本源生物科技有限公司；anti-p-AMPKα(Thr172) 、AMPKα、p-ACC(Ser79)、ACC 和β-actin 的抗體，Cell Signaling Technology 公司；5–氨基–1–[(2 R，3 R，4 S，5 R)–3，4–二羥 基–5–(羥 甲 基)惡 唑–2–基]咪 唑–4–甲 酰 胺(AICAR)，安諾倫生物科技有限公司；甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)測(cè)試試劑盒，北京普利萊基因技術(shù)有限公司；鏈脲霉素(STZ)，北京博愛港商貿(mào)有限公司.

1.2 體內(nèi)活性評(píng)價(jià)

1.2.1 動(dòng)物與飲食

體質(zhì)量18～22 g 的雄性昆明小鼠購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)研究所( 許可證號(hào)為SCXK(Jun)2012–0004).該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照國家和當(dāng)?shù)氐膫惱頊?zhǔn)則執(zhí)行.小鼠每籠5 只，在實(shí)驗(yàn)室條件下(18～23 ℃，濕度 55% ～60% ，光/暗周期為12 h/12 h)進(jìn)行飼養(yǎng).所有小鼠均以普通顆粒飼料喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分組，正常組(10 只)的小鼠繼續(xù)用普通飼料喂養(yǎng)，其余小鼠用高糖高脂飼料喂養(yǎng)(模型組和給藥組).所有的小鼠均自由飲食.

1.2.2 2 型糖尿病小鼠的誘導(dǎo)及治療

STZ 溶于 0.05 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液中(pH 4.5)，小鼠單次腹腔注射上述STZ 溶液誘導(dǎo)2 型糖尿病，并連續(xù)高糖高脂飼料輔助喂養(yǎng)2 周，小鼠的尾靜脈空腹血糖高于11.0 mmol/L，即2 型糖尿病小鼠造模成功.將造模成功的2 型糖尿病小鼠分為4 組，每組10 只.第1 組灌胃生理鹽水10 mL/kg(模型組)；第2 組灌胃阿卡波糖(溶解于生理鹽水)55 mg/kg；第3 和4 組分別灌胃給藥7i(懸浮于生理鹽水中)55 mg/kg 和100 mg/kg[11].

1.2.3 血糖水平的測(cè)定

各組小鼠灌胃給藥或生理鹽水14 d 后，隔夜禁食，口服葡萄糖(2 g/kg)，于0、30、60 和120 min 從尾靜脈采集血樣，血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)測(cè)量血糖[11].

1.2.4 血脂水平的測(cè)定

在實(shí)驗(yàn)期結(jié)束時(shí)，眼內(nèi)眥取血，1000 r/min 離心獲得血清，-20 ℃儲(chǔ)存.血清總膽固醇和甘油三酯使用試劑盒進(jìn)行分析.

1.2.5 肝臟組織學(xué)評(píng)價(jià)

小鼠麻醉處死，獲取胸腺、脾、胰、肝，組織用冷生理鹽水沖洗，稱量.肝臟用4%多聚甲醛溶液室溫下過夜固定，用石蠟包埋，42 ℃干燥48 h，二甲苯脫石蠟，梯度乙醇復(fù)水，蒸餾水清洗后，用蘇木精復(fù)染切片.隨后用自來水、醋酸和雙蒸水沖洗切片，在乙醇和甲苯中脫水并用中性膠密封.

1.3 體外活性評(píng)價(jià)

1.3.1 酶動(dòng)力學(xué)

在磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 6.8)中加入α–葡萄糖苷酶(400μL，0.01 U/mL，2 組)，其中一組用7i(20μmol/L) 處理的α– 葡萄糖苷酶(400μL ，0.01 U/mL)在4 ℃下透析24 h，測(cè)定透析袋中殘余酶活性，另一組α–葡萄糖苷酶經(jīng)7i 處理30 min 后直接測(cè)定酶的活性[10].

1.3.2 酶內(nèi)源熒光影響

α–葡萄糖苷酶(1 U)經(jīng)一定濃度的 7i(0 ～500μmol/L)在37 ℃預(yù)處理30 min，用M200PRO 型熒光分光光度計(jì)(Tecan 公司)在295 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定320～400 nm 范圍內(nèi)的內(nèi)源熒光光譜[12].

1.3.3 酶結(jié)合區(qū)域分析

α–葡萄糖苷酶(1 U)與一定濃度的 7i(0 ～50μmol/L)在37 ℃溫孵30 min，添加熒光探針(Bis-ANS，30μL，100μmol/L)后，在 37 ℃下再孵育15 min，使用Synergy H1 型微板分光光度計(jì)(美國BioTek 公司)測(cè)量430～630 nm 范圍內(nèi)的熒光光譜(λex＝400 nm)[12].

1.3.4 人肝癌細(xì)胞HepG2 培養(yǎng)及誘導(dǎo)

HepG2 細(xì)胞在含有 10% 胎牛血清(FBS)、10 U/mL 青霉素和10 mg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng).將HepG2 細(xì)胞接種于6 孔板上培養(yǎng)24 h，正常組不加誘導(dǎo)劑，模型組和給藥組分別加入0.75 mmol/L 的誘導(dǎo)劑(油酸、棕櫚酸、亞油酸和花生四烯酸的體積比為29∶47∶18∶6)處理，且給藥組加入不同濃度的化合物7i[13].

1.3.5 前脂肪細(xì)胞3T3-L1 培養(yǎng)與分化

前脂肪細(xì)胞3T3-L1 在添加10%新生小牛血清和1%青霉素–鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng).為了進(jìn)行脂肪細(xì)胞分化，將前脂肪細(xì)胞3T3-L1 培養(yǎng)2 d 后，模型組和給藥組加入分化培養(yǎng)基(含 10% 胎牛血清、0.5 mm IBMX、1μmol/L 地塞米松和10μg/mL 胰島素)，2 d 后更換含有10%胎牛血清和10μg/mL 胰島素的DMEM 分化培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育2 d 后給藥[14–15].

1.3.6 油紅O 染色法測(cè)定脂含量

將給藥處理后的人肝癌細(xì)胞HepG2 和前脂肪細(xì)胞3T3-L1 用油紅O 染色，4%多聚甲醛固定30 min，1×PBS 沖洗3 次.用異丙醇提取細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的油紅O，并在492 nm 處測(cè)量吸光度，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)脂含量[14].

1.3.7 尼羅紅染色法分析脂含量

將尼羅紅溶解在1 mg/mL 丙酮中.HepG2 細(xì)胞接種在6 孔板上，給藥處理24 h 后，分別加入到終質(zhì)量濃度10μg/mL 的尼羅紅和1μg/mL DAPI 染料，室溫黑暗條件下孵育15 min，使用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行拍照[14].

1.3.8 細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和總膽固醇的測(cè)定

將HepG2 和3T3-L1 細(xì)胞接種在6 孔板上，誘導(dǎo)分化后給藥處理24 h，用1×PBS 洗3 次，離心收集細(xì)胞，用TG 和TC 試劑盒中裂解液裂解細(xì)胞，室溫保存 10 min，對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，在70 ℃加熱細(xì)胞10 min 后，2 000 r/min 離心5 min，使用試劑盒分析TG 和TC 含量[13].

1.3.9 免疫印跡分析

HepG2 和3T3-L1 細(xì)胞在60 mm 培養(yǎng)皿中以每孔1×105個(gè)細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，正常組不加誘導(dǎo)劑處理，模型組和給藥組加入誘導(dǎo)劑(油酸、棕櫚酸、亞油酸和花生四烯酸的體積比為29∶47∶18∶6)處理.給藥組加7i 處理24 h 加入胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，細(xì)胞用1×PBS 洗滌3次，2 500 r/min 離心5 min，加入蛋白裂解液，在冰上裂解60 min，4 ℃、13 500 r/min 離心20 min.用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量，使用等量的蛋白質(zhì)溶液在十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠(SDSPAGE)進(jìn)行電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上.PVDF 膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉 1 h，用不同的一抗 p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC 和β-actin 與PVDF 膜4 ℃孵育過夜，PVDF 膜用1×PBS 清洗3 次，與鼠抗或兔抗(1∶5 000 稀釋度)在室溫下孵育2 h 后，ECL-Western-Blotting 底物(Thermo-Scientific 公司)檢測(cè)條帶[14].

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，結(jié)果采用單因素方差(ANOVA)或雙向檢測(cè)(two tailed independent Student’s t-tests)進(jìn)行分析，顯著性差異用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和最小顯著性差異(LSD)多重比較確定.

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物7i對(duì)體質(zhì)量的影響

化合物7 i 對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響如圖2 所示.經(jīng)過1 周正常喂養(yǎng)，各組小鼠的初始體質(zhì)量無顯著性差異.高糖高脂飼料喂養(yǎng)3 周后，模型組的體質(zhì)量顯著增加.模型組單次腹腔注射STZ 后，繼續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飼料喂養(yǎng)2 周，模型組體質(zhì)量有所減輕，出現(xiàn)糖尿病小鼠的癥狀.2 型糖尿病組口服灌胃化合物7i 和阿卡波糖.給藥2 周后，與2 型糖尿病模型組相比，7i 給藥組體質(zhì)量沒有明顯變化.結(jié)果表明：7i 對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量無明顯影響，與阿卡波糖作用效果相似.

圖2 化合物7i對(duì)體質(zhì)量的影響Fig. 2 Effect of 7i on body weight

2.2 化合物7i對(duì)血糖和口服葡萄糖耐量的影響

化合物7i 對(duì)血糖和口服葡萄糖耐量的影響如圖3 所示.以55 和100 mg/kg 劑量的7i 給藥后，糖尿病小鼠的空腹血糖水平顯著降低(aP＜0.05、bP＜0.01、cP＜0.001 表示與模型組比較，dP＜0.001 與正常對(duì)照組比較).為了評(píng)價(jià)化合物7i 對(duì)糖尿病小鼠的葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性的影響，進(jìn)一步進(jìn)行了葡萄糖耐量的測(cè)試.

圖3 化合物7i對(duì)血糖和口服葡萄糖耐量的影響Fig. 3 Effect of 7i on blood glucose and on oral glucosetolerance in diabetic mice

與模型組相比，口服葡萄糖后，7i 的55 mg/kg 劑量組在30、60、90 和120 min 的血糖濃度分別降低11.06%、10.27%、10.37%和11.08%.從曲線下面積圖可以看出，與模型組相比，阿卡波糖組和化合物7i均能顯著改善葡萄糖耐量(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001).

2.3 化合物7i對(duì)糖尿病小鼠器官的影響

分別對(duì)各組的胸腺、脾、胰、肝臟臟器指數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有肝臟臟器指數(shù)發(fā)生顯著變化.口服7i 可顯著改善肝臟臟器指數(shù)的增加.進(jìn)一步對(duì)肝臟進(jìn)行組織學(xué)染色分析，結(jié)果如圖4 所示.

圖4 不同組小鼠肝臟蘇木精染色Fig. 4 Haematoxylin staining of different groups of mice liver

經(jīng)蘇木精染色后，發(fā)現(xiàn)正常組肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝細(xì)胞索排列整齊.模型組肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的病理改變，具有肝索紊亂、水腫變性和脂肪變性的特征.阿卡波糖給藥組肝細(xì)胞恢復(fù)效果較差，而7i 給藥組的肝細(xì)胞出現(xiàn)良好的恢復(fù)現(xiàn)象，尤其是給藥100 mg/kg 劑量組，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)與正常肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)相似，水樣變性和脂肪變性得到顯著恢復(fù).因此，對(duì)于改善糖尿病小鼠的肝臟病變，相同劑量下，化合物7i治療效果優(yōu)于阿卡波糖.

2.4 化合物7i對(duì)血脂的影響

化合物7i 對(duì)血脂的影響見表1.STZ 誘導(dǎo)后糖尿病小鼠組血清TC 和TG 較正常組顯著升高，而7i治療的糖尿病小鼠，TC 和TG 水平顯著下降.因此，化合物7i 可以顯著改善糖尿病小鼠的高血脂癥狀.

表1 甘油三酯和總膽固醇含量(n＝10)Tab. 1 Levels of TC and TG in each group of mice(n＝10)

2.5 α–葡萄糖苷酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)分析

利用透析方法，對(duì)化合物7i 抑制α–葡萄糖苷酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖5 所示(與酶透析組相比，**P＜0.01).經(jīng)化合物7i 處理的α–葡萄糖苷酶，透析后活性不能恢復(fù)，與未經(jīng)透析的7i 處理的α–葡萄糖苷酶活性相似，這表明7i 對(duì)α–葡萄糖苷酶的抑制方式是不可逆的.

圖5 化合物7i處理下透析或非透析后α-葡萄糖苷酶活性Fig. 5 α-Glucosidase activity after dialysis or non-dialysis in presence of DMSO or 7i

2.6 化合物7i猝滅α–葡萄糖苷酶的內(nèi)源熒光

使用熒光猝滅實(shí)驗(yàn)研究了化合物7i 與α–葡萄糖苷酶的相互作用，結(jié)果如圖6 所示.α–葡萄糖苷酶在295 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下，在336 nm 處出現(xiàn)內(nèi)源熒光吸收峰.經(jīng)不同濃度7i 處理后，α–葡萄糖苷酶的內(nèi)源熒光強(qiáng)度隨著化合物7i 濃度的增加而逐漸減弱，該結(jié)果為化合物7i 直接與α–葡萄糖苷酶結(jié)合提供了證據(jù).這種結(jié)合可能導(dǎo)致α–葡萄糖苷酶中色氨酸殘基的構(gòu)象變化，進(jìn)而影響酶活性中心與底物的結(jié)合.

圖6 不同濃度7i對(duì)α–葡萄糖苷酶內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響Fig. 6 Variation of the intrinsic fluorescence intensity of α-glucosidase in the absence and presence of different concentrations of 7i

2.7 化合物7i與α–葡萄糖苷酶疏水區(qū)域的結(jié)合

利用外源熒光疏水探針bis-ANS 進(jìn)一步研究化合物7i 與α–葡萄糖苷酶表面疏水性區(qū)域的結(jié)合情況.該熒光探針與α–葡萄糖苷酶共孵育時(shí)，在430～630 nm 范圍內(nèi)可以觀察到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)(圖7).經(jīng)不同濃度的7i 處理后，酶與熒光探針的復(fù)合物的熒光強(qiáng)度呈濃度依賴性明顯降低.該結(jié)果說明化合物7i 可能與酶的疏水區(qū)域結(jié)合，并競(jìng)爭(zhēng)性抑制了α–葡萄糖苷酶的表面疏水性與熒光探針的結(jié)合.

圖7 不同濃度7i 對(duì)α–葡萄糖苷酶與熒光探針復(fù)合物的熒光光譜的影響Fig. 7 Fluorescence spectra of α-glucosidase-bis-ANS complex in the absence and presence of different concentrations of 7i

2.8 化合物7i抑制HepG2和3T3-L1細(xì)胞中TG和TC的積累

以HepG2 和3T3-L1 細(xì)胞為模型，進(jìn)一步研究化合物7i 對(duì)脂質(zhì)代謝的影響，結(jié)果如圖8 所示(與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001).

誘導(dǎo)劑處理24 h 后細(xì)胞內(nèi)TG 和TC 含量顯著增加，加入不同濃度的 7i 和陽性對(duì)照洛伐他汀10μmol/L 后，HepG2 和3T3-L1 細(xì)胞中的TG 和TC水平呈劑量依賴性降低.此外，利用倒置熒光顯微鏡，用尼羅紅和DAPI 染色也能直觀地觀察到HepG2的脂質(zhì)含量隨著7i 劑量依賴性的降低(圖9).

圖8 化合物7i對(duì)HepG2和3T3-L1細(xì)胞的脂質(zhì)代謝的影響Fig. 8 Compound 7i reduced lipid accumulation in HepG2 and 3T3-L1 cells

圖9 對(duì)HepG2細(xì)胞的尼羅紅和DAPI染色Fig. 9 Nile red and DAPI staining of HepG2 cells

2.9 化合物7i對(duì)AMPK通路相關(guān)蛋白的影響

由于AMPK 通路在脂質(zhì)代謝過程中起著關(guān)鍵性作用，因此進(jìn)一步測(cè)定了7i 對(duì)AMPK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果如圖10 所示(與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001).以AICAR(250μmol/L)為陽性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物7i 能夠顯著上調(diào)AMPK(Thr172)和ACC(Ser79)蛋白的磷酸化水平，與AMPK 激活劑AICAR 作用效果相似.

圖10 化合物7i通過AMPK-ACC級(jí)聯(lián)減少HepG2和3T3-L1細(xì)胞中的脂質(zhì)積聚Fig. 10 Compound 7i reduces the lipid accumulation via AMPK-ACC cascade in HepG2 and 3T3-L1 cells

該結(jié)果表明，化合物7i 可能通過上調(diào)AMPK 通路中AMPK 和ACC 磷酸化而起到降脂的作用.

3 結(jié) 論

本研究評(píng)價(jià)了化合物7i 對(duì)糖尿病小鼠的體內(nèi)降血糖和降血脂作用，以及體外抑制α–葡萄糖苷酶機(jī)制，細(xì)胞水平降脂活性和初步針對(duì)AMPK 通路的調(diào)節(jié)活性和機(jī)制.在糖尿病小鼠中，55 和100 mg/kg 劑量的化合物7i 顯著降低餐后血糖水平，并明顯改善葡萄糖耐量.化合物7i 還能明顯抑制血清TC 和TG水平的升高，并改善肝臟臟器指數(shù)，使肝細(xì)胞恢復(fù)正常.化合物7i 可能與α–葡萄糖苷酶輸水區(qū)域直接結(jié)合，不可逆抑制酶的活性而達(dá)到降血糖的作用.此外，7i 能夠降低HepG2 和3T3-L1 細(xì)胞中TG 和TC的積累，其機(jī)制可能是通過上調(diào)AMPK 和ACC 的磷酸化水平而達(dá)到降低血脂和血糖的作用.因此，化合物7i 作為α–葡萄糖苷酶抑制劑和AMPK/ACC 信號(hào)調(diào)節(jié)劑雙重調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂，為其發(fā)展成為新型抗糖尿病藥物提供基礎(chǔ)支持.