吳志文，張振濤

(內蒙古醫(yī)科大學，內蒙古 呼和浩特 010110)

一氧化氮(NO)是一種重要的氣體分子，是通過三種不同的一氧化氮合酶(內皮型一氧化氮合酶eNOS；神經元一氧化氮合酶nNOS；誘導型一氧化氮合酶iNOS)將L-精氨酸轉化為瓜氨酸而產生的[1]。從生理學上講，NO是一種內源性的表皮舒張因子，可刺激血管平滑肌舒張，并且還充當神經遞質和免疫系統(tǒng)中的抗感染分子，以抵抗感染。從病理上講，NO與穩(wěn)態(tài)障礙發(fā)作有關[2-4]。由于其明確的意義，開發(fā)用于實時追蹤生物系統(tǒng)中NO水平的靈敏方法和工具，對于人類的健康至關重要。在過去的幾十年中，電化學，電子順磁共振，化學發(fā)光，比色法和熒光法等許多分析技術已被用于檢測不同環(huán)境下的NO[5-11]。在這些方法中，基于熒光的生物成像方法因其出色的靈敏度和選擇性，高分辨率，無創(chuàng)性，廣泛的被用于NO的檢測，目前，已經開發(fā)出用于檢測NO的各種小分子熒光探針。特別是在過去的五年中，已經報道了各種具有改善的熒光性質和傳感能力的NO熒光探針，其中一些在監(jiān)測生物系統(tǒng)中的外源性和內源性NO方面顯示出巨大的潛力。本綜述總結了近年來報道的新型NO熒光探針。討論了采用不同NO識別基團和方法的有機物和金屬配合物熒光探針，以及它們在體外和體內實時定量檢測外源性和內源性NO的應用。

通常，基于有機物的NO熒光探針通常包含兩個關鍵元素，即NO識別位點和熒光團。NO識別位點可以與NO發(fā)生特異性化學反應，并激發(fā)熒光團發(fā)生特異性發(fā)性，起到捕捉NO的作用，很多官能團可以用作NO識別位點，例如鄰苯二胺，可以與NO發(fā)生環(huán)化反應，生成苯并三唑；二氫吡啶(Hantzsch酯)，可以與NO發(fā)生氧化反應，將二氫吡啶芳構化；芳香族仲胺，可以與NO反應，生成N-亞硝產物。為了實現(xiàn)NO探針的細胞器靶向能力，還會配備一些官能團作為遞送載體，以將探針特異性地運輸到細胞器，如帶正電荷的三苯基膦可以靶向到線粒體，帶弱堿性嗎啉可以靶向溶酶體。

1 基于有機物的NO熒光探針

1.1 基于鄰苯二胺環(huán)化的熒光探針

由長野研究小組最早開發(fā)的基于鄰苯二胺的NO熒光探針是生物系統(tǒng)中NO檢測最廣泛使用的探針[5,12-17]。在沒有NO的情況下，將發(fā)生從富電子的鄰苯二胺基團到熒光團的光致電子轉移(PET)過程，以猝滅熒光。在富氧條件下與NO反應后，富電子的鄰苯二胺部分可以轉化為吸電子的苯并三唑環(huán)，從而阻斷PET過程并激發(fā)熒光團，從而提供可檢測的熒光發(fā)射。

2016年，Chen J B等[18]將鄰二胺基苯基連接到了3,5-(2-羥基苯基)-二亞甲基吡咯上，首次合成了硼螯合熒光探針(BOPB)(圖1)，該探針在622/643 nm的最大激發(fā)/發(fā)射波長下，可以敏感且選擇性地響應，并且可以用于小鼠肝臟中的NO的檢測。與之前報道的用于確定NO的熒光探針方法相比，該方法具有更長的檢測波長(675 nm)，最短的衍生時間(12 min)和最低的LOD(0.02 nM)。

圖1 BOPB探針對NO的傳感機制

同年，F(xiàn)eng W等[19]合成了一種基于1,8-萘甲酰亞胺的鄰苯二胺熒光探針LysoNONaph(圖2)，用于對溶酶體中的NO進行成像。該探針在pH值為3.8～12的范圍內不敏感，對NO的選擇性高，靈敏度低，檢出限低至4.57 mmol/L，因此可以用于細胞溶酶體成像。

圖2 LysoNONaph探針對NO的傳感機制

2018年，Zhang J等[20]通過將鄰苯二氨基與BODIPY染料相連接，成功設計出了一種用于檢測NO和亞硝酸鹽的雙響應式熒光探針1(圖3)。該探針本質上由于PET效應而不會發(fā)熒光，但是在中性條件下用NO處理或在酸性環(huán)境中用亞硝酸鹽處理時，探針會迅速變?yōu)楦邿晒鉅顟B(tài)，具有高選擇性和低檢測限。在細胞成像實驗中，使用DEA·NONOate作為NO的源并在細胞內Cys和GSH的輔助下，探針1可以觀察到藍色熒光。

圖3 探針1的合成及探針1對NO的預期傳感機理

圖4 探針2對NO的傳感機制

同年，WangQ等[22]合成了一種選擇性和靈敏的陽離子熒光探針(ROPD)(圖5)，該探針以鄰苯二胺基作為反應位點，以羅丹明作為熒光團。該探針在寬pH范圍內在水相中顯示出對NO的高選擇性和靈敏度，并具有快速響應。同時，探針ROPD可以透過細胞膜，可用于實時觀察L929和HeLa細胞中的外源NO，以及應激的RAW 264.7細胞中的內源性NO。

圖5 ROPD探針對NO的傳感機制

2019年，Jiang WL等[23]合成了dRB-OPD的熒光探針(圖6)并用于識別NO。該探針以鄰苯二胺基作為反應位點，以脫氧羅丹明B作為熒光團。dRB-OPD顯示40秒鐘內對NO的快速響應，熒光增強170倍。此外，該探針相對于脫氫抗壞血酸(DHA)，抗壞血酸(AA)和甲基乙二醛(MGO)表現(xiàn)出對NO的高選擇性。特別地，該探針可以避免來自若丹明內酰胺基熒光NO探針(RB-OPD)中發(fā)現(xiàn)的半胱氨酸(Cys)的嚴重干擾?？梢杂糜跈z測HepG2和RAW 264.7細胞中的外源性和內源性NO。

圖6 dRB-OPD探針對NO的傳感機制

1.2 基于芳族仲胺N-亞硝化的熒光探針

基于芳族仲胺N-亞硝化的熒光探針對NO的檢測具有完美的選擇性，因為由于仲胺基團的電子密度控制，與基于鄰苯二胺類的熒光探針不同，該探針不受其他活性氧發(fā)生反應/氮物種(RNS/ROS)和活性羰基物質(RCS)物質的干擾。此外，芳族仲胺與各種金屬離子的配位能力較低，這對于其高選擇性也至關重要。

2017年，Mao Z等[24]設計了一種基于芳香族仲胺的N-亞硝化的新型熒光探針NCNO(圖7)，探針NCNO可以在ROS，RNS和RCS之間以明顯的選擇性和靈敏度識別NO。由于其雙光子激發(fā)和紅光發(fā)射，可以檢測到活細胞和深層組織中的NO。該探針還首次被用于監(jiān)測缺血再灌注損傷(IRI)小鼠腎臟中的NO。

圖7 NCNO探針對NO的傳感機制

2019年Huo Y等[25]合成了一種芳香族仲胺N-亞硝化的探針1及可靶向線粒體的衍生物探針Mito1(圖8)，作為熒光NO探針，該用于區(qū)分M1巨噬細胞和M2巨噬細胞的誘導型NO合酶(iNOS)水平差異。這兩種探針具有獨特的能力，能夠同時響應NO的兩種二次氧化物，即N2O3和ONOO3，因此，與大多數通常僅響應N2O3的現(xiàn)有熒光NO探針相比，反映細胞內的NO更加敏感和可靠。進一步表明該探針在癌癥免疫療法研究和相關的抗癌藥物篩選中成像的應用潛力。

1906年《治安法官法》最終取消了治安法官的財產資格，僅規(guī)定任命的治安法官不得不住在本郡或居住在所擔任治安法官的郡七英里內。1949年《治安法官法》擴大到離該郡15英里范圍內居住，1979年《治安法官法》再一次規(guī)定直到今天仍是有關治安法官資格僅有的法令?，F(xiàn)在治安法官的任命往往可慮下列情況：

圖8 探針1和Mito1探針對NO的傳感機制

1.3 基于二氫吡啶氧化的熒光探針

二氫吡啶(Hantzsch酯)可以被NO定量氧化，以平穩(wěn)地提供相應的吡啶部分。因此，二氫吡啶基團可以用作NO捕獲基團，用于開發(fā)新型熒光探針。更有趣的是，二氫吡啶與NO的反應可以在厭氧環(huán)境下進行，這將明顯提高熒光探針對NO的選擇性。

2016年，Ma S F等[26]合成了由7-甲氧基香豆素(作為熒光團)和二氫吡啶衍生物(作為NO的受體)組成DHP-1熒光探針(圖9)，用于檢測NO。探針DHP-1的光學特性和活細胞成像顯示出對NO的快速響應，其熒光強度比背景增強了80倍，并且對NO的選擇性高于其他活性氧或氮。DHP-1探針還可用于在生物學相關pH范圍內檢測活細胞中的NO。

圖9 DHP-1 探針對NO的傳感機制

同年，Wang H L等[27]合成了香豆素的水溶性二氫吡啶的衍生物DHPS(圖10)，并將其成功應用于水溶液中的熒光傳感一氧化氮(NO)。DHPS探針的熒光極弱，而加入NO溶液后其熒光極大地打開，并顯示出高的選擇性和對NO的敏感性。檢測限為18 nM。細胞毒性試驗證明DHPS和PYS都是生物相容的，DHPS已被成功應用于追蹤RAW 264.7細胞中內源性產生的NO。

圖10 DHPS探針的結構

2018年，Gao C等[28]通過將二氫吡啶和三苯基膦(TPP)部分引入到硼聯(lián)吡啶(BODIPY)染料中，設計并合成了用于一氧化氮(NO)的線粒體靶向探針Mito-DHP(圖11)。Mito-DHP通過在無氧條件下將二氫吡啶芳構化為熒光吡啶產物，可以有效地檢測一氧化氮。Mito-DHP探針對多種活性氧/氮(ROS/ RNS)表現(xiàn)出對NO的高選擇性，以及高靈敏度(25 nM的檢測限)，pH穩(wěn)定性和生物相容性。

圖11 Mito-DHP探針對NO的傳感機制

1.4 其他類型的有機基NO熒光探針

2014年，Xin Lv等[29]通過將特定的NO識別基團2-氨基-3-二甲基氨基聯(lián)苯連接到Bodipy染料中，構建了熒光探針3(圖12)，該探針該探針可以選擇性地檢測ROS/RNS和AA/DHA/MGO上的NO，檢測限低至30 nM。將細胞用該探針預處理1小時并與DEA·NONONOate(50 mM)孵育1 h后，可以觀察到細胞中強烈的熒光。這些結果證實了探針1具有可視化活細胞中NO水平的潛力。

圖12 探針3對NO的傳感機制

2019年Liu Y等[30]合成了基于花青染料(Cy7)的熒光探針(圖13)，用于通過在Cy7染料的內消旋位置上連接甲基氨基來檢測NO。由于分子內的電荷轉移過程，該探針在800 nm處顯示微弱的熒光發(fā)射，而用NO處理后，該探針迅速變成高度NIR熒光狀態(tài)。檢測限低至11.3 nM。該探針對NO的選擇性超過活性氧，活性氮和金屬離子。更重要的是，該探針對NO的熒光反應發(fā)生在生理上有利的NIR區(qū)域，從而使其能夠進一步用于在背景干擾低且穿透深度較深的發(fā)炎小鼠模型中對內源性NO成像。

圖13 Cy7-MA探針對NO的傳感機制

同年，F(xiàn)u YL等[31]開發(fā)了一種新型熒光探針8-HB(圖14)，該探針以BODIPY作為熒光團，并以8-取代的肼為活性部位來檢測NO。探針8-HB可以與NO/O2反應生成熒光脫水的BODIPY，并伴有少量的8-疊氮化物BODIPY。 8-HB具有出色的靈敏性(LOD=22 nM)。此外，8-HB具有很低的細胞毒性和良好的生物相容性，并能在活的HepG2細胞中選擇性地檢測NO活性氧/氮物種(ONOO-、H2O2和ClO-) 并檢測活體RAW264.7細胞內源性NO。

圖14 8-HB探針對NO的傳感機制

2 基于金屬配合物的熒光探針

2.1 基于銅(II)配合物的NO熒光探針

基于Cu(II)的配合物是開發(fā)NO熒光探針的理想選擇。Cu(II)中不成對的電子與配體配位后，可以猝滅熒光團產生的熒光。但是用NO處理后，Cu(II)平穩(wěn)地轉化為Cu(I)，從而使淬滅作用消除，熒光恢復。

圖15 Cu(II)探針對NO的傳感機制

2017年，ALoas等[32]設計了兩種新的基于Cu(II)的探針(圖15)，用于一氧化氮的檢測。傳感器分別采用聚脯氨酸螺旋和哌嗪單元作為剛性間隔基，并通過FRET機制在7-羥基香豆素和熒光素生色團之間進行能量轉移。這兩種探針通過其對生理pH值下對NO的敏感，直接和選擇性的比例響應，并使它們具有增強的細胞滲透性和亞細胞定位功能。

2.2 基于銥(III)配合物的NO熒光探針

穩(wěn)定的銥(III)配合物由于其強而長壽命的熒光發(fā)射，也可以用作基于金屬絡合物的熒光團。可以引入一個NO識別基團來激發(fā)PET過程并猝滅熒光，從而提供另一種基于金屬配合物的NO探針。

Wu C等[33]設計并合成了一種長壽命的發(fā)光銥(III)配合物探針1(圖16)，用于監(jiān)測從硝普鈉(SNP)可控釋放的NO。探針1在580 nm處存在SNP時顯示15倍的開啟發(fā)光。探針對SNP的線性響應在5～25 μM之間，檢測極限為0.18 μM。重要的是，證明了HeLa細胞中NO的發(fā)光開關檢測。

圖16 銥(III)探針對NO的傳感機制

3 結 語

近年來報道的用于在生物系統(tǒng)中對NO成像的各種熒光探針。大部分還是基于有機物的NO熒光探針，基于金屬絡合物的NO熒光探針很少，這些探針顯示出高選擇性和靈敏度，低細胞毒性和深層的組織穿透能力，非常適合在體外和體內對NO成像。但是，同樣也存在濃度低，半衰期短和擴散特性快等缺點，因此開發(fā)出能夠準確分析生物系統(tǒng)中NO的熒光探針仍然是科學家面臨的巨大挑戰(zhàn)。