邵長(zhǎng)興，余群英

(九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西 九江 332005)

有機(jī)金屬釕抗癌治療劑因具有良好的生物學(xué)特性被認(rèn)為是鉑類(lèi)抗癌治療劑的可替代品，一些金屬釕抗癌劑甚至對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細(xì)胞系也同樣有效[1]。近年來(lái)，“鋼琴凳式”類(lèi)八面體有機(jī)金屬釕(II)配合物的研究受到了廣泛的關(guān)注，其中一個(gè)η6-π鍵合的芳烴配體形成“鋼琴座”，其余三個(gè)配位基團(tuán)形成“鋼琴腿”(圖1)。芳烴部分對(duì)配合物的活性有著重要的影響，它可以增加配合物的疏水性，促進(jìn)親脂類(lèi)物質(zhì)的吸收[2]。另外，有機(jī)金屬釕的抗癌活性受配體配位方式的影響也很大。含P-或N-單齒配體、O,O-雙齒配體、N,O-雙齒配體的有機(jī)金屬釕試劑對(duì)CH1 (PA-1) 以及A2780細(xì)胞無(wú)活性，而含S,O-、S,N-、C,N-和N,N-雙齒配體的釕試劑抗增殖活性很高[2]。N,N-螯合配體可以是脂肪族二胺、芳香族二胺、聯(lián)吡啶衍生物等含氮有機(jī)化合物，為芳烴釕配合物中常見(jiàn)的配體結(jié)構(gòu)。Sadler等報(bào)道了具有典型代表性的以二胺為核心的芳烴Ru(II)試劑，他們將惰性雙齒配體1,2-乙二胺(en)和氯作為離去基團(tuán)配位到芳烴金屬釕核上，合成出[(η6-芳烴)RuCl(en)]PF6(RM175) (圖1)，該釕試劑對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株A2780具有很強(qiáng)的抗增殖活性[2-3]，能與DNA共價(jià)結(jié)合從而提高了配合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性[4]。Palaniandavar等報(bào)道了含蒽基甲基二氮雜環(huán)庚烷配體的Ru(II)-芳烴配合物，同DNA和蛋白質(zhì)顯示出較高的結(jié)合力，比含簡(jiǎn)單的二氮雜環(huán)庚烷配體的Ru(II)-芳烴配合物具有更高的細(xì)胞毒活性[5-6]。Zheng等[7]開(kāi)發(fā)了含4-苯胺喹唑啉(4-AQ)的釕(II)配合物(4～9)(圖1)，該配合物對(duì)EGFR的抑制活性強(qiáng)于4-AQ。

圖1 “鋼琴凳式”類(lèi)八面體有機(jī)金屬釕(II)配合物，RM-175以及含4-苯胺喹唑啉(4-AQ)配體的釕(II)配合物(4～9)的化學(xué)結(jié)構(gòu)

鑒于以上研究結(jié)果，我們以芳基釕(II)配合物[Ru(η6-傘花烴)(2-氨甲基吡啶-N,N)Cl]PF6為研究對(duì)象，研究其體外對(duì)4種人癌細(xì)胞系的毒性，以抗癌藥物順鉑為對(duì)照組，以期有所發(fā)現(xiàn)。

1 合成實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

所用化學(xué)試劑均為市售產(chǎn)品，分析純，直接使用。采用X-4數(shù)字顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)定熔點(diǎn)(溫度未經(jīng)校正)；采用Bruker DRX-400核磁共振波譜儀測(cè)定氫譜和碳譜，以SiMe4為內(nèi)標(biāo)；采用NICOLET iS10傅里葉紅外光譜儀測(cè)定4000～200 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜。

1.2 合成方法

[(η6-cymene)RuCl(2-picolylamine-N,N)]PF6(1)的合成，室溫下，將二氯(對(duì)甲基異丙苯)釕(II)二聚體(0.212 g，0.33 mmol)懸浮于無(wú)水甲醇(50 mL)中，并一次性加入2-氨甲基吡啶(0.108 g，1 mmol)，攪拌3 h后過(guò)濾，濾液中加入NH4PF6(0.5 g，3.07 mmol)，攪拌5 min后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮體積約15 mL，在277 K下靜置，待析出微晶后過(guò)濾收集產(chǎn)物，乙醚洗滌，甲醇-乙醚重結(jié)晶得到黃色晶體產(chǎn)物(0.206 g, 51.0% yield)。1H NMR譜圖給出以下特征信號(hào)：在δ 9.40～7.30范圍內(nèi)出現(xiàn)的4個(gè)芳香族氫信號(hào)歸為吡啶環(huán)上氫信號(hào)，兩個(gè)dd耦合的芳烴質(zhì)子信號(hào)歸為傘花烴芳環(huán)氫信號(hào)。δ 4.30～3.90范圍內(nèi)的多重峰為N-CH2-質(zhì)子信號(hào)峰。13C NMR譜圖給出16個(gè)碳信號(hào)峰，包括11個(gè)芳香碳和5個(gè)脂肪碳，δ 81.70為 CH2-NH2碳信號(hào)峰。紅外光譜給出3500～3100 cm-1范圍內(nèi)的寬峰，為N-H伸縮振動(dòng)吸收帶。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.11 (d,J=5.4 Hz, 1H), 8.30～7.75 (m, 1H), 7.70～7.40 (m, 2H), 7.10～6.80 (m, 1H), 5.90 (d,J=5.8 Hz, 1H), 5.84 (d,J=5.9 Hz, 1H), 5.71 (d,J=5.9 Hz, 1H), 5.65 (d,J=5.8 Hz, 1H), 4.55～4.30 (m, 1H), 4.25～3.95 (m, 2H), 2.90～2.60 (m, 1H), 1.95 (s, 3H), 1.11 (d,J=6.8 Hz, 6H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 161.23, 154.54, 139.13, 124.87, 121.14, 103.05, 98.02, 84.84, 83.07, 82.27, 81.70, 52.04, 30.23, 22.32, 21.42, 17.63; IR (KBr) νmax(cm-1): 3438, 3334, 3227, 2973, 1613, 1469, 1441, 1386, 1312, 1165, 1105, 1037, 881, 839, 764, 558. Anal. Calcd for C22H39ClF6N2PRu: C, 43.1; H, 6.41; N, 4.57. Found: C, 42.96; H, 6.25; N, 4.41。

2 活性測(cè)試

2.1 材 料

HepG2(HCC)、Hela(cervical)、A549(lung)、MCF-7(breast)細(xì)胞系；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM/H培養(yǎng)基、PBS、75 cm2培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板均購(gòu)自CORNING；MTT、0.25% Trypsin-EDTA、Pen Strep均購(gòu)自GIBCO；Foetal Bovine Serum購(gòu)自BIOLOGICAL INDUSTRIES；DMSO購(gòu)自AMRESCO；SNAYO CO2培養(yǎng)箱；HEALES MB-580酶標(biāo)儀。

2.2 采用 MTT 法測(cè)定抗腫瘤活性

將釕配合物1及順鉑分別用DMSO溶解，配制成100 mg/mL后于4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將MTT用磷酸鹽緩沖鹽(PBS，pH=7.2)配成5 mg/mL溶液后通過(guò)0.22 μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾備用。

將腫瘤細(xì)胞(HepG-2、Hela、A549、MCF-7)懸浮于10%的胎牛血清中于DMEM/H培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)(37 ℃，5% CO2)。用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期。0.25% Trypsin-EDTA消化收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以每毫升4×104個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200 μL，孵育24 h使貼壁。測(cè)試化合物用培養(yǎng)液和DMSO稀釋成不同濃度，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔，與癌細(xì)胞于CO2培養(yǎng)箱中共同孵育48 h。每孔加入濃度為0.5 mg/mL的MTT (50 μL)，再孵育4 h后，輕輕吸去上清。每孔加入150 μL DMSO，搖床振搖至充分溶解后用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)并記錄各孔吸光度值。抑制率按照以下計(jì)算公式計(jì)算：抑制率%=(化合物組平均OD值-對(duì)照組平均OD值)/對(duì)照組平均OD 值×100%。SPSS 進(jìn)行回歸分析計(jì)算IC50值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，IC50最終結(jié)果以3次實(shí)驗(yàn)平均值±SD值表示。

2.3 活性測(cè)試結(jié)果

文章采用MTT法檢測(cè)有機(jī)金屬釕試劑1對(duì)人癌細(xì)胞系HepG-2(HCC)、A549(lung)、Hela(cervical)、MCF-7(breast)的體外抑制活性，以對(duì)臨床抗癌用藥物順鉑為對(duì)照組。將以上細(xì)胞系與不同濃度的化合物1和順鉑共同孵育48 h，結(jié)果表明有機(jī)金屬釕化合物1對(duì)HepG-2、A549和Hela的抑制作用呈劑量依賴(lài)關(guān)系，濃度在10 μg/mL以下時(shí)效果不如順鉑，濃度在100 μg/mL左右時(shí)，效果逐漸與順鉑相當(dāng)；對(duì)MCF-7(breast)幾乎無(wú)抑制作用，不如順鉑(表1)。

表1 有機(jī)金屬釕化合物1和順鉑與 HepG-2(HCC)、A549(lung)、Hela(cervical)、MCF-7(breast)共同孵育48 h后所測(cè)的半數(shù)最大抑制濃度(IC50)值

3 結(jié) 論

本文合成并表征了芳基釕(II) 配合物[Ru(η6-傘花烴)(2-氨甲基吡啶-N,N)Cl]PF6，首次測(cè)定了其體外對(duì)4種人癌細(xì)胞系HepG2(HCC)、Hela(cervical)、A549(lung)、MCF-7(breast)的抑制作用，以臨床用藥順鉑為對(duì)照。測(cè)試結(jié)果表明其對(duì) MCF-7 (breast) 幾乎無(wú)抑制作用，對(duì)HepG2(HCC)、Hela(cervical)、A549(lung)的抑制作用呈劑量依賴(lài)關(guān)系, 濃度在100 μg/mL左右時(shí)，抑制效果逐漸與順鉑相當(dāng)，說(shuō)明該配合物具有很好的抗腫瘤作用，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。