王澤祥，孫曉林

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

鉛是人類最早使用的金屬之一，其用途十分廣泛，包括交通、涂料、農(nóng)藥、包裝材料等諸多領(lǐng)域。鉛是比重高于4.0 的重金屬元素，也是對人體危害最大的幾種重金屬元素之一，其進(jìn)入人體之后，會(huì)直接造成神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等器官組織的損害，危害人體健康[1-3]。由于近現(xiàn)代工業(yè)的迅猛發(fā)展和廢物處理不當(dāng)，近些年重金屬的濫用和排放時(shí)有發(fā)生，尤其是對人體危害嚴(yán)重的鉛[1]。因此根據(jù)國家法律和法規(guī)的規(guī)定，檢查環(huán)境中重金屬鉛污染狀況和監(jiān)督食品中鉛殘留情況，對保障人民身體健康和食品安全是十分必要的。

傳統(tǒng)的檢測食品中重金屬離子殘留的方法主要有原子吸收光譜法（atomic absorption spectrometry）、氣相色譜分析法（gas phase chromatography）、比色法（colorimetry）、電感耦合等離子體光譜法（inductively coupled plasma spectrometry）、電感耦合等離子體質(zhì)譜分析（inductively coupled plasma-mass spectrometry）法、電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry）法等，這些方法雖然有精確測量樣品中單種重金屬總量等優(yōu)點(diǎn)，但是也有所需儀器昂貴，相對費(fèi)力、費(fèi)時(shí)，需要專業(yè)人員操作等缺點(diǎn)，因此難以應(yīng)用到現(xiàn)場檢測中[4-7]。隨著免疫學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，重金屬免疫學(xué)檢測方法顯現(xiàn)出其檢測快速、陳本低廉、操作簡單、選擇性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，如ELISA、免疫層析法、電化學(xué)發(fā)光檢測法等[8-12]。這些方法是基于特異性抗體識(shí)別重金屬離子的免疫分析方法，其中重金屬完全抗原的制備與其抗體的制備及純化是關(guān)鍵[13-15]。目前國外已有多種重金屬ELISA 檢測方法的報(bào)道[16-17]，而國內(nèi)關(guān)于重金屬免疫學(xué)檢測方法的相關(guān)研究卻很少。本研究利用兔多克隆抗體制備技術(shù)，采用制備的重金屬鉛鰲合抗原免疫新西蘭大耳白兔，制備了抗重金屬鉛離子的特異性抗體，并運(yùn)用凝膠過濾層析技術(shù)純化制備的多克隆抗體，為建立快速、靈敏、特異的鉛離子ELISA 檢測技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

DTPA 螯合劑、二甲基亞砜（DMSO）和葡聚糖凝膠Sephadex G200 均購自索萊寶科技有限公司；1mol/L Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液、HEPES 緩沖液、三乙胺、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自西格瑪奧德里奇（上海）有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；。

1.2 儀器與設(shè)備

pH（瑞士梅特勒-托利多公司）；超純水儀（美國Millipore 公司）；磁力攪拌器（金壇市恒豐儀器廠）；冷凍離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；紫外分光光度計(jì)（美國Plextech 公司）；脫色搖床（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠），超濾離心管購自美國Millipore 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康新西蘭大耳白兔（2.0 kg 左右）購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廠。

1.4 方法

1.4.1 金屬鉛離子完全抗原的制備

重金屬鉛離子免疫抗原的制備參考Blake、Zhu等報(bào)道的抗原合成方法[18-20]，首先稱取50 mg 的DTPA 溶于15 mL DMSO 中，在磁力攪拌器中緩慢溶解20 min，制備成金屬螯合劑溶液;稱取100 牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）,溶于HEPES 緩沖溶液（10 mmol/L,pH 7.5）;將溶解的牛血清白蛋白溶液緩慢逐滴加入金屬螯合劑溶液中，然后加入500 μL 三乙胺溶液，在磁力攪拌器中緩慢攪拌均勻后反應(yīng)24h；使用預(yù)處理的超濾管（100 mmol/L EDTA 和0.1mol/L、pH 7.4 HEPES 緩沖液）4℃、6000rpm 離心超濾15 min去除未偶聯(lián)的DTPA；應(yīng)用pH 7.4 的HEPES 緩沖液將截留物洗取，然后將1mol/L 的Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液500μL 逐滴加入，反應(yīng)4h 后，4℃、6000rpm 離心超濾30 min 除去未鰲合的Pb2+，再用pH 7.4 的HEPES 緩沖液稀釋截留物，-80 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 抗原的鑒定

完全抗原應(yīng)用SDS-PAGE 電泳鑒定，取BSA、DTPA-BSA、Pb-DTPA-BSA 分別用三蒸水稀釋到適當(dāng)濃度，煮沸10 min,灌制12%濃縮膠和5%分離膠，加入電極緩沖液，每控上樣量10μL,Marker 按說明書處理，設(shè)定電壓為60V,進(jìn)行垂直SDS-PAGE電泳，電泳至溴酚藍(lán)指示劑離底線1cm 時(shí)停止，考馬斯亮藍(lán)染色20～30min,脫色至透明。

1.4.3 完全抗原蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定

運(yùn)用紫外分光光度計(jì)測定重金屬鉛離子完全抗原中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。

1.4.4 多克隆抗體的制備

制備多克隆抗體的免疫動(dòng)物為5 只體重2 kg的雄性新西蘭大耳白兔，免疫前，抽取新西蘭大耳白兔血清作為陰性對照。將制備好的免疫抗原0.5 mg與等體積的完全弗氏佐劑混合后制備成乳劑，以皮下多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行初次免疫。四周之后，取0.5 mg 免疫抗原與等體積不完全弗氏佐劑混合均勻，以多點(diǎn)皮下注射的方式進(jìn)行第二次免疫，此后每14d運(yùn)用0.5 mg 免疫抗原與等體積不完全弗氏混合均勻后免疫一次，在第5 次免疫后7d，以心臟采血方式采集兔血液，分離血清，血清于4℃保存。

1.4.5 多克隆抗體的純化

取抗體血清運(yùn)用Sephadex G-200 凝膠柱層析法純化多克隆抗體。具體步驟：（1）Sephadex G-200凝膠沸水浴5h，冷卻至室溫后裝柱，保證柱內(nèi)無氣泡且顆粒均勻。（2）用pH 7.4 PBS 緩沖液平衡、洗脫。（3）收集不同峰時(shí)的抗體，裝入透析袋，周圍堆積PEG6000 濃縮。濃縮后的多克隆抗體運(yùn)用SDSPAGE 電泳（同1.4.2）檢測純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬鉛完全抗原Pb-DTPA-BSA 的SDSPAGE 鑒定

通過蛋白質(zhì)在SDS-PAGE 中的遷移率以判定各抗原的相對分子質(zhì)量的改變。與BSA 相比，合成的DTPA-BSA 和Pb-DTPA-BSA 均存在滯后現(xiàn)象，說明相對于BSA，DTPA-BSA 和Pb-DTPA-BSA 的分子質(zhì)量都有增大；況且，與DTPA-BSA 相比，Pb-DTPA-BSA 也存在滯后現(xiàn)象，說明Pb-DTPA-BSA比DTPA-BSA 分子質(zhì)量增大更多，這些結(jié)果說明抗原合成成功(如圖1 所示)。

圖1 重金屬鉛完全抗原Pb-DTPA-BSA 的SDS-PAGE 鑒定

2.2 免疫抗原的蛋白質(zhì)濃度

運(yùn)用紫外分光光度計(jì)法測定的蛋白質(zhì)濃度為3.4 mg/mL（見表1）

表1 抗重金屬鉛免疫抗原濃度

2.3 SDS-PAGE 電泳鑒定抗體的純度

運(yùn)用凝膠柱層析法對制備的重金屬鉛多克隆抗體進(jìn)行純化，根據(jù)蛋白分子Marker 標(biāo)記，純化后的抗重金屬鉛多克隆抗體純度達(dá)到80%以上（如圖2 所示）。

圖2 重金屬鉛多克隆抗體純化的SDS-PAGE 鑒定

3 討論

重金屬免疫學(xué)檢測方法具有靈敏度高、檢測速度快、選擇性好、所需設(shè)備價(jià)格低廉等優(yōu)勢，十分符合對動(dòng)物性食品中重金屬鉛的檢測需求。重金屬ELISA 檢測方法以抗體技術(shù)為基礎(chǔ)，運(yùn)用過量螯合物與樣品中的重金屬離子制備成復(fù)合物，在酶標(biāo)板上包被金屬-螯合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物抗原，二者競爭性結(jié)合抗體位點(diǎn)，應(yīng)用二抗顯色后，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比得出重金屬離子的含量。因?yàn)橹亟饘巽U離子的分子量小、無法形成抗原表位，所以它只是半抗原，缺乏免疫原性[21-22]。因此，重金屬鉛完全抗原的合成和重金屬鉛抗體的制備是ELISA 檢測方法成功建立的關(guān)鍵點(diǎn)，常用的抗原制備技術(shù)有戊二醛法、重氮化法、異硫氰脂法等[23-26]。目前，雙功能螯合劑法制備重金屬完全抗原的報(bào)道很少，而且重金屬鉛抗體的制備方法仍以使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠的少量制備為主[27]，未見使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔的大量制備并純化的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用雙功能螯合劑DTPA 制備重金屬鉛的完全抗原，運(yùn)用紫外分光光度計(jì)法測定完全抗原的濃度，通過SDS-PAGE 對完全抗原的合成進(jìn)行了鑒定，隨后使用完全抗原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭大耳白兔，制備多克隆抗體，并應(yīng)用凝膠過濾層析技術(shù)純化多克隆抗體，SDS-PAGE 檢測顯示出重金屬鉛多克隆抗體的純化成功。該研究系國內(nèi)首次制備和純化重金屬鉛兔多克隆抗體，將為下一步動(dòng)物性食品中重金屬鉛ELISA 檢測方法的建立提供準(zhǔn)備。

4 結(jié)論

本研究成功制備重金屬鉛的完全抗原Pb-DTPA-BSA,紫外分光光度計(jì)法測定其濃度為3.4mg/mL，應(yīng)用免疫抗原Pb-DTPA-BSA 免疫家兔，成功制備抗重金屬鉛多克隆抗體，凝膠柱層析法純化獲得高純度抗重金屬鉛多克隆抗體。