李紅艷， 趙思涵， 梅顯運(yùn)， 陳 政， 李旭光， 孫芳云

(西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院∥西藏高原相關(guān)疾病分子遺傳機(jī)制與干預(yù)研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，咸陽 712082)

缺血性心臟病(ischemic heart disease, IHD)已成為世界上死亡率較高疾病之一，主要是由冠狀動(dòng)脈狹窄致心肌缺血引起的[1]. 而心肌缺血造成的氧含量降低是IHD發(fā)病的重要原因之一. 雖有研究表明急性低氧能提高細(xì)胞存活率，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)，但慢性或極端低氧卻引起細(xì)胞死亡. 同時(shí)，心肌低氧常常伴有氧自由基增加、鈣超載、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等現(xiàn)象. 因此，保護(hù)心肌細(xì)胞免受低氧損傷是降低IHD風(fēng)險(xiǎn)的有效策略.

自噬是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞分解代謝過程[2]. 通常自噬可以保護(hù)細(xì)胞免受各種破壞性因素的影響，如低氧或饑餓，以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[3]. 同時(shí)，自噬對(duì)于維持心臟正常功能至關(guān)重要[4]. 在缺血應(yīng)激下，自噬被激活以保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血或缺血/再灌注損傷[5]. 而嚴(yán)重缺血時(shí)，心臟過度自噬會(huì)促進(jìn)細(xì)胞死亡并惡化心臟功能[6].

甘松新酮(Nardosinone，Nar)是一種從甘松提取而來的倍半萜類化合物，已將其含量作為衡量甘松品質(zhì)定性的主要標(biāo)準(zhǔn). 研究發(fā)現(xiàn)，Nar的藥理作用主要有鎮(zhèn)靜、抗癲癇、抗抑郁、促神經(jīng)生長(zhǎng)、改善認(rèn)知能力、保護(hù)心肌細(xì)胞、降血壓、抑菌與抗瘧、抗腫瘤等[7]. Nar可通過激活蛋白激酶A(Protein Kinase A, PKA)促進(jìn)小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移和選擇性分化；通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular Signal-Regulated Kinase, ERK)減少原代培養(yǎng)神經(jīng)元因缺氧缺葡萄糖誘導(dǎo)的損傷，提高細(xì)胞活力；促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)生長(zhǎng)等[8]. Nar通過抑制核因子-κB(Nuclear Factor-κB, NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)途徑治療相關(guān)神經(jīng)炎癥疾病[9]. 另外，Nar可抑制NF-κB配體誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成，減輕脂多糖誘導(dǎo)牙槽骨吸收等. 在心血管研究中發(fā)現(xiàn)，Nar可阻斷SD大鼠心室肌細(xì)胞鈉離子通道電流或通過影響cAMP-PKA信號(hào)通路，抑制心律失常大鼠心肌細(xì)胞鈣超載，從而發(fā)揮抗心律失常作用，以及通過靶向磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol-3-Kinase, PI3K)/Akt和MEK/ERK信號(hào)通路，減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞肥大等．

盡管Nar在神經(jīng)生長(zhǎng)、心律失常和心肌肥大中有著重要作用，但Nar在心肌低氧損傷中是否有作用及該過程是否由自噬介導(dǎo)還未見報(bào)道. 因此，本研究利用氯化鈷(CoCl2)模擬H9C2心肌細(xì)胞低氧，探討Nar干預(yù)的作用及機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 試劑、藥品和儀器

甘松新酮(SN8280，北京索萊寶，純度≥98%)；氯化鈷(Sigma)；3-MA(Selleckchem)；DMEM高糖培養(yǎng)基和胰蛋白酶(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青生物工程研究所)；CCK-8試劑盒(北京同仁)；乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究院)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(上海貝博生物)；RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(西安晶彩生物科技有限公司)；一抗Caspase-3、β-actin、Bax、Bcl-2、LC3B、Beclin-1、P62和羊抗鼠二抗(ImmunoWay公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；蛋白電泳與轉(zhuǎn)移儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)等.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

H9C2細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù). 細(xì)胞放置在相對(duì)濕度95%、5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，以DMEM高糖培養(yǎng)基并補(bǔ)加10%胎牛血清和1%青鏈霉素培養(yǎng). 每隔3 d進(jìn)行一次細(xì)胞傳代，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.3 細(xì)胞活性檢測(cè)

細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，24 h后，分別以CoCl2(0、50、100、200、500、1 000 μmol/L)孵育24 h. 根據(jù)CCK-8試劑盒說明測(cè)定細(xì)胞活力. 后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用CoCl2半最大效應(yīng)濃度(EC50)500 μmol/L進(jìn)行細(xì)胞低氧造模. 另外，用Nar(0、10、50、100、200 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞24 h后，再用CoCl2(EC50)作用24 h，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力.

1.4 流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，24 h后，分為對(duì)照組(0.1% DMSO作用48 h)、CoCl2組(500 μmol/L CoCl2作用24 h)、Nar組(50 μmol/L Nar作用24 h)和Nar+CoCl2組(Nar預(yù)作用24 h后，CoCl2再作用24 h). 根據(jù)Annexin V-FITC/PI試劑盒說明處理細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡.

1.5 Western Blot

細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，24 h后，分為對(duì)照組(0.1% DMSO)、CoCl2組(500 μmol/L)、Nar組(50 μmol/L)、Nar+CoCl2組和3-MA+Nar+CoCl2組(5 mmol/L 3MA預(yù)處理3 h，隨后同Nar+CoCl2組). 在冰上以RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，提取總蛋白. 用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度. SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白. 電泳完成后，以濕轉(zhuǎn)的方式將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上. 室溫下以5%脫脂奶粉封閉2 h，再一抗4 ℃孵育過夜. 根據(jù)抗體說明進(jìn)行稀釋. 用到的一抗有：Caspase-3、β-actin、Bax、Bcl-2、LC3B、Beclin-1和P62. TBST洗3次(室溫，搖床上緩慢晃動(dòng))，每次10 min. 二抗室溫孵育2 h, TBST洗3遍(同上). 用Bio-Rad分光成像系統(tǒng)曝光.

1.6 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，24 h后，細(xì)胞分組同“1.5”. 利用分光光度計(jì)測(cè)細(xì)胞上清液中MDA濃度及SOD、CK和LDH活性.

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組至少進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn). 數(shù)據(jù)采用Spss19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn). 采用t檢驗(yàn)對(duì)2組間進(jìn)行比較，多組間的比較采用單因素方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 Nar對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷的影響

不同濃度的CoCl2作用H9C2細(xì)胞24 h后(圖1A)，細(xì)胞活力以劑量依賴方式顯著降低，500 μmol/L的CoCl2可抑制約50% H9C2細(xì)胞生長(zhǎng)，故選此濃度造H9C2低氧模型. 不同濃度的Nar預(yù)作用H9C2細(xì)胞24 h，再以500 μmol/L CoCl2孵育24 h. 結(jié)果顯示：與CoCl2組比，50、100、200 μmol/L Nar預(yù)作用均可提高細(xì)胞活力，而50 μmol/L Nar作用最顯著(P<0.01)(圖1B)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以50 μmol/L Nar進(jìn)行分析. 同時(shí)，與對(duì)照組(細(xì)胞不做任何處理組)相比，CoCl2(500 μmol/L)可顯著減少細(xì)胞數(shù). 而50 μmol/L Nar預(yù)干預(yù)24 h，可明顯減輕CoCl2造成的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象(圖1C).

圖1 Nar對(duì)CoCl2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞損傷的影響

2.2 Nar對(duì)CoCl2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)：CoCl2可引起H9C2細(xì)胞凋亡，而Nar明顯減輕CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖2A、B). 與對(duì)照組比較，CoCl2組Caspase-3蛋白表達(dá)升高，Bcl-2/Bax相對(duì)比率降低. 而Nar預(yù)作用后，與CoCl2組相比，Caspase-3蛋白表達(dá)降低，Bcl-2/Bax相對(duì)比率升高(P<0.01)(圖2C～E). 表明Nar對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有抑制作用.

圖2 Nar對(duì)CoCl2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響

2.3 Nar對(duì)CoCl2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞損傷與自噬的關(guān)系

為了確定自噬是否介導(dǎo)了Nar對(duì)H9C2細(xì)胞低氧損傷的保護(hù)過程，Western Blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3II/LC3I和P62的表達(dá). 與對(duì)照組相比(圖3A)，CoCl2組LC3II/LC3I、P62和Beclin-1蛋白表達(dá)均增加，這與先前研究結(jié)果一致[10]. 而Nar組LC3II/LC3I和Beclin-1蛋白表達(dá)顯著升高，P62下降. 與CoCl2組相比，Nar+CoCl2組的LC3II/LC3I、Beclin-1和P62表達(dá)均降低. 而3-MA預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)Nar誘導(dǎo)的LC3II/LC3I和Beclin-1蛋白表達(dá)增加及P62蛋白表達(dá)降低(圖3B). 這些結(jié)果表明：Nar通過激活自噬減輕了CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷. CoCl2也激活了自噬，但其對(duì)H9C2細(xì)胞的作用與Nar明顯不同，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究.

2.4 Nar抑制CoCl2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞凋亡與自噬的關(guān)系

為進(jìn)一步探討Nar激活自噬與CoCl2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞凋亡的關(guān)系，以3-MA預(yù)作用3 h，Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá). 結(jié)果表明：3-MA預(yù)作用組與Nar+CoCl2組相比，Caspase-3蛋白表達(dá)升高而Bcl-2/Bax降低，表明3-MA逆轉(zhuǎn)了Nar的抗凋亡作用(圖4A～C). 說明Nar以激活自噬方式對(duì)抗CoCl2誘導(dǎo)的凋亡.

圖3 Nar對(duì)CoCl2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞損傷與自噬的關(guān)系

圖4 Nar抑制CoCl2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞凋亡與自噬的關(guān)系

注：與對(duì)照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與CoCl2組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01；與Nar+CoCl2組比較，∧表示P<0.05，∧∧表示P<0.01 . 圖5同.

2.5 Nar減輕CoCl2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激的關(guān)系

氧自由基的升高是低氧誘發(fā)心肌損傷的重要原因之一. 過量的氧自由基會(huì)攻擊生物膜誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，致使心肌中MDA含量增加，影響脂質(zhì)的生物學(xué)功能. 同時(shí)心肌損傷后會(huì)引起細(xì)胞膜結(jié)合酶的泄露，如血清中CK和LDH水平的升高，最終引起細(xì)胞凋亡. 與CoCl2組相比(圖5A～D)，Nar預(yù)處理顯著提高H9C2細(xì)胞SOD水平，降低CK、MDA和LDH水平. 而3-MA預(yù)作用降低SOD水平，提高CK、MDA和LDH水平，從而逆轉(zhuǎn)了Nar對(duì)CoCl2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的抗氧化作用. 結(jié)果表明：Nar激活自噬減輕了CoCl2對(duì)H9C2細(xì)胞的氧化損傷.

圖5 Nar減輕CoCl2誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激的關(guān)系

3 討論

CoCl2因其二價(jià)鈷離子可以取代脯氨酰羥化酶輔因子(二價(jià)鐵離子)，已廣泛用于包括H9C2細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞系模擬低氧條件. 本研究中CoCl2(500 μmol/L)對(duì)H9C2細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用，而Nar(50 μmol/L)預(yù)作用可減輕CoCl2(500 μmol/L)引起的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象. LI等[8]也報(bào)道Nar(50和100 μmol/L)能保護(hù)因低氧和缺糖引起的神經(jīng)元損傷，并提高細(xì)胞活力. LI等[11]發(fā)現(xiàn)Nar有促神經(jīng)干細(xì)胞增殖、增加細(xì)胞遷移和分化的作用. 這些結(jié)果提示：Nar可促進(jìn)H9C2細(xì)胞低氧損傷條件下的生長(zhǎng).

Bcl-2家族是凋亡過程的主要調(diào)節(jié)因子，包括促凋亡蛋白如Bax和抗凋亡蛋白如Bcl-2[12-13]. Bcl-2/Bax決定了細(xì)胞是增殖還是凋亡[14]. 此外，Caspase-3是凋亡過程的關(guān)鍵執(zhí)行者[15]. 本研究發(fā)現(xiàn)，Nar可降低CoCl2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡，并減少Caspase-3蛋白表達(dá)，使Bcl/Bax比降升高，表明Nar通過抑制細(xì)胞凋亡減輕了CoCl2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷.

心肌細(xì)胞在缺血狀態(tài)下因缺乏足夠的葡萄糖、氨基酸和能量等而導(dǎo)致自噬被激活[16]. 正常生理活動(dòng)中，自噬通過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝以適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和清除受損細(xì)胞器，從而起到維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用[17]. 但在極端條件下，如慢性或極度低氧，激活自噬會(huì)引發(fā)細(xì)胞凋亡[18]. 在各種自噬相關(guān)基因中，Beclin-1和LC3B在協(xié)調(diào)自噬的細(xì)胞保護(hù)功能中有著重要作用，二者同時(shí)可對(duì)抗凋亡[19]. LC3B由LC3I和LC3II組成，自噬激活后LC3I轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3II. 因此LC3II/LC3I反應(yīng)了自噬體的形成程度[20]. Beclin-1表達(dá)在自噬體形成的初始階段[21]. P62有向自噬體傳遞泛素結(jié)合蛋白復(fù)合物，并以自噬體溶酶體融合機(jī)制促進(jìn)降解的作用，故自噬激活后，細(xì)胞內(nèi)P62水平降低[17]. 本研究Western Blot結(jié)果顯示：Nar和CoCl2均可激活自噬，但作用機(jī)制不同. CoCl2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能增加了自噬體形成通量，而不是降低清除率. Nar激活自噬可能增加了損傷細(xì)胞器的清除，從而對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞低氧損傷起保護(hù)作用. 另有研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理以激活自噬的形式對(duì)心臟起保護(hù)作用[22-23]，且缺血預(yù)處理后，LC3II/LC3I和Beclin-1表達(dá)增加[24]，與本研究中Nar作用一致. 因此，Nar可能具有保護(hù)H9C2細(xì)胞免受CoCl2誘導(dǎo)凋亡的低氧預(yù)處理作用，具體機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證. 另外，3-MA預(yù)作用明顯增加了Nar+CoCl2組細(xì)胞凋亡的發(fā)生，表明Nar誘導(dǎo)的自噬對(duì)CoCl2造成的低氧損傷有抗凋亡作用.

SOD是細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑，有清除自由基的作用[25]. MDA是脂質(zhì)過氧化的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，可間接反應(yīng)細(xì)胞的損傷程度[26-27]. 另外，CK和LDH是心肌損傷的標(biāo)志物. 通常細(xì)胞上清中LDH活性增加與細(xì)胞死亡的程度相關(guān)[28]，而CK可直接反應(yīng)心肌受損程度[29-31]. 本研究中，CoCl2作用后引起的SOD下調(diào)，MDA、LDH和CK的上調(diào)被Nar預(yù)作用所逆轉(zhuǎn)，表明Nar能改善CoCl2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化損傷，但當(dāng)3-MA預(yù)作用時(shí)，SOD、MDA、LDH和CK水平接近CoCl2組水平，表明Nar以激活自噬起到抗氧化損傷的作用.

綜上所述，CoCl2對(duì)H9C2細(xì)胞可造成凋亡和氧化損傷，Nar通過激活自噬對(duì)CoCl2造成的H9C2細(xì)胞損傷有促生長(zhǎng)、抗凋亡和抗氧化作用.