崔金鵬，李淑洲，王佐梅，李雪瑩，姚欣卉，苗金雪，肖洪彬

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

桃仁是薔薇科植物桃Prunuspersica(L.)Batsch或山桃Prunusdavidiana(Carr.)Franch的干燥成熟種子，其味甘、苦，性平，行血活血之藥也，而其活血之性緩?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》云：“主瘀血”，《名醫(yī)別錄》曰“破癥瘕”。紅花是菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，其味辛性溫，入心肝二經(jīng)，可逐腹中惡血而補(bǔ)血虛。血瘀證是由于血液循環(huán)障礙而造成的全身或局部組織器官供血供氧不足，引起組織的炎癥、增生、壞死、血栓、出血等。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝主疏泄、肝藏血。肝通過(guò)疏泄功能調(diào)暢氣機(jī)，氣機(jī)逆亂，則清濁混淆，津血敗壞為痰濁瘀血，痰濁瘀血壅塞于脈絡(luò)之間，影響津血的正常運(yùn)行，致使血液發(fā)生濃、黏、凝、聚的異常變化，誘發(fā)非酒精性脂肪肝[1]、腦梗死[2]、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病[3]和心肌梗死[4]等，以上是高脂血癥形成的原因之一。王微[5]、馬貴萍[6]、曾定倫[7]、王臬[8]等醫(yī)家都對(duì)高脂血癥痰濁血瘀型進(jìn)行過(guò)論述。高脂血癥是體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂引起的血脂水平增高的一種全身性疾病，嚴(yán)重威脅著人類健康。高脂血癥屬于西醫(yī)病名，其論述散見(jiàn)于胸痹、中風(fēng)、痰濕、濁阻等病中，現(xiàn)代中醫(yī)將其歸屬于傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的痰濁、血瘀范疇[9]。痰濁和血瘀的高脂血癥的主要病理產(chǎn)物，痰瘀互結(jié)證也是高脂血癥的常見(jiàn)證型[10]。由于中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用，使中藥作用機(jī)制難以明確。近年來(lái)通過(guò)對(duì)疾病基因網(wǎng)絡(luò)和藥物作用網(wǎng)絡(luò)的分析研究發(fā)現(xiàn)，藥物不僅作用于多個(gè)靶點(diǎn)，同時(shí)靶點(diǎn)也作用于多種疾病，因此就形成了復(fù)雜的藥物-靶點(diǎn)-疾病的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將系統(tǒng)科學(xué)、網(wǎng)絡(luò)科學(xué)、生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和數(shù)學(xué)等多學(xué)科融合，通過(guò)數(shù)據(jù)收集、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、網(wǎng)絡(luò)分析與可視化、多組分相互作用和信號(hào)通路預(yù)測(cè)，使多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)更為精確，從而提高應(yīng)用基礎(chǔ)研究的成功率。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展與應(yīng)用，將會(huì)對(duì)疾病特別是復(fù)雜疾病發(fā)病機(jī)制的全面了解，以及治療藥物的發(fā)現(xiàn)和研究做出貢獻(xiàn)。所以本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析桃仁-紅花治療高脂血癥的作用，為中西醫(yī)結(jié)合治療高脂血癥提供新的研究思路，同時(shí)為活血化瘀降脂藥的研究提供參考依據(jù)。

1 方法

1.1 高脂血癥相關(guān)作用靶點(diǎn)收集在Drugbank疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)和TTD(therapetutic target datebase)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)輸入疾病名稱“Hyperlipidemia”“Hyperlipemia”檢索高脂血癥的作用靶點(diǎn)，運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲得人源Uniprot ID，以供后續(xù)分析。

1.2 桃仁-紅花活性成分的收集及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索桃仁、紅花化學(xué)成分，共獲得化學(xué)成分255個(gè)，其中桃仁66個(gè)、紅花189個(gè)，考慮中藥在體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄后作用靶點(diǎn)器官及數(shù)據(jù)量，設(shè)置口服藥物利用度(drug-like，OB)≥30%、類藥性(oral bioavailability,DL)≥0.18、化合物的半衰期(half-life，HL)≥4。運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲得人源Uniprot ID。

1.3 構(gòu)建桃仁-紅花活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)將藥物預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)與高脂血癥作用靶點(diǎn)運(yùn)用VENNY 2.1數(shù)據(jù)庫(kù)篩選共同靶點(diǎn)，運(yùn)用Cytoscape3.7.1軟件繪制桃仁-紅花活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 潛在靶點(diǎn)生物學(xué)過(guò)程及通路分析使用Cytoscape插件ClueGO對(duì)16個(gè)潛在靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO(gene ontology)生物學(xué)過(guò)程富集分析和KEGG(kyoto encylopedia of genes and genomes)通路富集分析，選取具有顯著性差異的生物學(xué)過(guò)程和通路。

2 結(jié)果

2.1 高脂血癥靶點(diǎn)收集基于TTD、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘并刪除重復(fù)靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)信息導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲取人源基因，得到高脂血癥47個(gè)作用靶點(diǎn)(表1)。

2.2 桃仁-紅花活性成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并設(shè)置OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4，獲得桃仁活性成分23個(gè)，紅花活性成分16個(gè)，去除無(wú)明確作用靶點(diǎn)及靶點(diǎn)無(wú)人源基因的活性成分后，獲得32個(gè)活性成分(包含1個(gè)共有成分)(表2)。對(duì)篩選后的化合物成分進(jìn)行分析，桃仁化合物成分主要有黃酮及其苷類、甾體和萜類、酚酸類等，且《中國(guó)藥典》將苦杏仁苷作為控制桃仁藥材的指標(biāo)性成分。

2.3 桃仁-紅花活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)564個(gè)，其中桃仁133個(gè)、紅花431個(gè)。運(yùn)用VENNY 2.1數(shù)據(jù)庫(kù)篩選桃仁-紅花預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和高脂血癥作用靶點(diǎn)，獲得16個(gè)靶點(diǎn)，即ESR1、PPARG、CASP3、CYP3A4、ALB、SLC6A4、TNF、SLC6A2、INSR、AKR1C3、SLC6A3、MAOB、MAOA、ABCG2、PPARA、PPARD。推測(cè)桃仁-紅花活性成分主要通過(guò)對(duì)16個(gè)潛在靶點(diǎn)的作用治療高脂血癥。應(yīng)用Cytoscape3.7.1構(gòu)建桃仁-紅花活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖1)。其網(wǎng)絡(luò)中共包括29個(gè)節(jié)點(diǎn)(13個(gè)活性成分節(jié)和16個(gè)潛在靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))，組成41條活性成分-潛在靶點(diǎn)聯(lián)系，充分體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，驗(yàn)證了桃仁-紅花對(duì)高脂血癥治療是通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)、整體協(xié)同方式發(fā)揮作用的。經(jīng)過(guò)Network Analyzer對(duì)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，桃仁-紅花活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)平均節(jié)點(diǎn)度為2.6，共有7個(gè)靶點(diǎn)蛋白Degree≥3，分別是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(CASP3)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARG)、鈉依賴去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC6A2)、鈉依賴5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC6A4)、細(xì)胞色素P450(CYP3A4)、腫瘤壞死因子(TNF)、胰島素受體(INSR)，即以上靶蛋白是桃仁-紅花活性成分發(fā)揮治療高脂血癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表1 桃仁-紅花47個(gè)與高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)

表2 桃仁-紅花活性成分基本信息

2.4 桃仁-紅花治療高脂血癥的潛在靶點(diǎn)GO基因功能富集分析富集分析共得到22條P≤0.05的生物過(guò)程，結(jié)果分為3部分，富集分析網(wǎng)絡(luò)圖、富集分析餅狀圖、柱狀圖。依據(jù)P值越小可靠性越高，排名前10位的生物學(xué)過(guò)程依次為dopamine catabolic process(多巴胺的分解過(guò)程)、catechol-containing compound catabolic process(含兒茶酚的化合物分解代謝過(guò)程)、catecholamine catabolic process(兒茶酚胺分解過(guò)程)、phenol-containing compound catabolic process(含酚化合物分解代謝過(guò)程)、response to nicotine(對(duì)尼古丁反應(yīng))、sequestering of triglyceride(甘油三酸酯隔絕)、organic hydroxy compound catabolic process(有機(jī)羥基化合物分解代謝過(guò)程)、dopamine uptake(多巴胺吸收)、monoamine transport(單胺運(yùn)輸)、catecholamine uptake(兒茶酚胺吸收)。這些生物學(xué)過(guò)程表明高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)偏于通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄、蛋白水解、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式，從而促進(jìn)高脂血癥的發(fā)生和發(fā)展。

圖1 桃仁-紅花活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖2 桃仁-紅花治療高脂血癥的潛在靶點(diǎn)GO基因功能富集分析

表3 桃仁-紅花治療高脂血癥潛在靶點(diǎn)生物學(xué)過(guò)程的GO分析

圖3 桃仁-紅花治療高脂血癥的潛在靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

2.5 桃仁-紅花治療高脂血癥的潛在靶點(diǎn)KEGG通路富集分析共得到4條P≤0.05的通路，PPAR信號(hào)通路(PPAR signaling pathway)、藥物代謝(drug metabolism)、可卡因成癮(cocaine addiction)、安非他明成癮(amphetamine addiction)。

表4 桃仁-紅花治療高脂血癥的潛在靶點(diǎn)通路

3 討論

高脂血癥是體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂引起的血脂水平增高而產(chǎn)生的一種全身性疾病，易誘發(fā)多種疾病及并發(fā)癥。研究表明，高脂血癥與腦血栓、心肌梗死、心臟猝死、糖尿病、高血壓、脂肪肝等有密切的關(guān)系，是形成冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的主要危險(xiǎn)因素之一。隨著生活水平的提高及飲食習(xí)慣的改變，高脂血癥的潛在人群不斷增加，已逐漸成為威脅人類健康的重要因素之一。高脂血癥受多種因素的共同影響，多信號(hào)分子參與其發(fā)生發(fā)展，使得對(duì)高脂血癥的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)輸做出正確的預(yù)測(cè)。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選桃仁-紅花中的活性成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，獲取高脂血癥治療靶點(diǎn)，映射出桃仁-紅花治療高脂血癥的網(wǎng)絡(luò)圖，從系統(tǒng)上研究藥物對(duì)人體之間的相互作用及規(guī)律，并且確定分子層面的靶點(diǎn)、生物學(xué)過(guò)程、通路等，闡釋桃仁-紅花治療高脂血癥的效應(yīng)機(jī)制。通過(guò)對(duì)高脂血癥治療靶點(diǎn)與桃仁-紅花活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)對(duì)比，獲得16個(gè)對(duì)高脂血癥有明確治療意義的靶點(diǎn)，其中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ、鈉依賴去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體鈉依賴5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體、細(xì)胞色素P450、腫瘤壞死因子、胰島素受體被視為桃仁-紅花治療高脂血癥的重要靶點(diǎn)。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ控制著脂肪酸的過(guò)氧化物酶體β氧化途徑是脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。降低 PPAR-γ 的表達(dá)能夠抑制脂肪肝的發(fā)生[11]、脂肪細(xì)胞分化[12]、脂肪細(xì)胞分泌的Adiponectin、Leptin，有效地抑制BMMSCs向脂肪細(xì)胞的過(guò)度分化[13]、非酒精性脂肪肝病中脂代謝[14]。鈉依賴去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體是單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體。去甲腎上腺素通過(guò)其高親和力的鈉依賴性再攝取到突觸前終末而終止其作用[15]。伍菲凡[16]研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食小鼠的五羥色胺濃度會(huì)顯著降低。胰島素受體是介導(dǎo)胰島素多向作用的受體酪氨酸激酶，胰島素結(jié)合可導(dǎo)致多種細(xì)胞內(nèi)底物磷酸化。增加胰島素受體底物的基因表達(dá)，可能是治療肥胖的作用機(jī)制之一，增強(qiáng)胰島素受體底物活性可改善非酒精性脂肪肝大鼠胰島素抵抗[17]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明[18-19]，非酒精性脂肪性肝病血清腫瘤壞死因子-α明顯上升，給予藥物后患者血清脂質(zhì)指標(biāo)改善同時(shí)，腫瘤壞死因子-α水平顯著降低。對(duì)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3靶點(diǎn)對(duì)治療高脂血癥研究相對(duì)較少，可做深入研究。通過(guò)對(duì)潛在靶點(diǎn)的GO和KEGG富集分析結(jié)果說(shuō)明，高脂血癥主要與藥物代謝、PPAR信號(hào)通路最為相關(guān)。歐麗娜等[19]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，具有雌激素樣作用的補(bǔ)腎陽(yáng)藥可調(diào)節(jié)脂代謝，膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵蛋白介導(dǎo)藥物可調(diào)控脂代謝[20]。PPAR信號(hào)通路已經(jīng)通過(guò)關(guān)鍵靶點(diǎn)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ在通路中起到的作用驗(yàn)證了通路的可靠性。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)桃仁-紅花治療高脂血癥的活性成分、作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索，為進(jìn)一步研究活血化瘀降脂藥提供參考和依據(jù)。