趙婷，施紅媛，李菁，陳詩怡，趙鈺萍，楊曉蕾，李國(guó)良，楊凈思

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650118

在最近數(shù)十年中，許多國(guó)家和地區(qū)已清除了野生型脊髓灰質(zhì)炎（簡(jiǎn)稱脊灰）病毒的傳播，在此情況下，世界衛(wèi)生組織提出停止三價(jià)口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗（trivalent oral poliovirus vaccine，tOPV）的使用，改為二價(jià)口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗（bivalent oral poliovirus vaccine，bOPV），并引入至少 1 劑脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗（inactivated poliovirus vaccine，IPV）［1］。近期，我國(guó)響應(yīng)世界衛(wèi)生組織的策略，開始實(shí)施脊灰序貫免疫程序（接種1 劑IPV 后，接種兩劑bOPV），研究發(fā)現(xiàn)，IPV 和bOPV 的聯(lián)合序貫免疫接種程序與全程接種tOPV 程序相比，其脊灰特異的腸道黏膜免疫有所降低［2］。在發(fā)展中國(guó)家，脊灰特異的腸道黏膜免疫十分重要，其可有效抑制病毒沿糞口途徑傳播，阻止脊灰快速傳播［3-4］。因此，在疫苗策略轉(zhuǎn)換后，增強(qiáng)脊灰特異的腸道黏膜免疫力成為一個(gè)新的問題。

在前期臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，腸道菌群中富集雙歧桿菌的嬰幼兒群體在服用OPV 后，脊灰特異的免疫球蛋白 A（immunoglobulin A，IgA）陽性率更高［5］。該現(xiàn)象為提高疫苗激發(fā)的黏膜免疫效果提供了新的思路。本研究旨在觀察服用和未服用雙歧桿菌的脊灰受體轉(zhuǎn)基因小鼠接種bOPV 后的黏膜免疫效應(yīng)，探討雙歧桿菌與bOPV 腸道黏膜免疫效率之間的相關(guān)性及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 疫苗、菌株及載體 Ⅰ+ Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗（人二倍體細(xì)胞）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供，規(guī)格：0.1 mL ／ 劑，含脊髓灰質(zhì)炎活病毒總量不低于6.12 lgCCID50，其中Ⅰ型應(yīng)不低于6.0 lgCCID50，Ⅲ型應(yīng)不低于 5.50 lgCCID50；雙歧桿菌菌株（Bifidobacterium animalis subsp.Lactis）購自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；pSP64 polyA 載體購自美國(guó)Promega 公司；大腸埃希菌Top10 工程菌購自日本TaKaRa 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)脊灰受體轉(zhuǎn)基因C57BL ／ 6N小鼠，雌性，體重18 g，購自北京維通利華公司，動(dòng)物合格證號(hào)：1103411911000199。

1.3 主要試劑 小鼠脊髓灰質(zhì)炎抗體IgA 酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒購自默沙克生物公司；流式抗體 FITC anti-mouse CD3、Alexa Fluor?700 anti-mouse CD4、APC ／ Cyanine7 anti-mouse CD45、PE anti-mouse CD19 購自美國(guó)BD 公司；RNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；RNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-SP6）購自美國(guó)Promega 公司；一步法絕對(duì)定量試劑盒（One Step Pri-meScript?RT-qPCR Mix 購自日本TaKaRa公司。

1.4 動(dòng)物分組及免疫 將脊灰受體轉(zhuǎn)基因小鼠分為兩組：試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5 只。試驗(yàn)組以灌胃方式接種 bOPV，0.1 mL ／ 只，間隔 28 d 接種第 2 劑bOPV，每劑bOPV 接種前7 d 以灌胃方式接種雙歧桿菌，0.1 mL ／ 只，含 1 × 106個(gè)菌落形成單位（colonyforming unit，CFU）／ μL［6］；對(duì)照組同樣間隔 28 d 接種相同劑量的bOPV，每劑bOPV 接種前7 d 以灌胃方式喂磷酸鹽緩沖液（PBS），0.1 mL ／ 只。

1.5 灌胃雙歧桿菌對(duì)小鼠影響的檢測(cè) 灌胃當(dāng)天記為第 1 天，在第 1、2、3、5、7 天分別測(cè)量?jī)山M小鼠體重。灌胃雙歧桿菌后第3 天采集小鼠血清樣本，基于Luminex 平臺(tái)，利用Luminex 檢測(cè)技術(shù)，測(cè)定血清中細(xì)胞因子 IL-1、TNF-α、IFNγ、IL-6、IL-10、IL-17A 的含量。

1.6 IgA 檢測(cè) 在每劑bOPV 接種后的第3 和第7天收集當(dāng)天新鮮的小鼠糞便，均質(zhì)后秤取500 mg，加入 2 mL PBS 溶液并充分混勻，800 × g 離心 20 min后收集上清溶液，使用小鼠脊髓灰質(zhì)炎抗體IgA 酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒測(cè)定糞便上清溶液中IgA 水平。

1.7 灌胃雙歧桿菌對(duì)脊灰減毒活疫苗引發(fā)的腸道黏膜免疫效應(yīng)影響的檢測(cè)

1.7.1 淋巴細(xì)胞檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。第2 劑bOPV 接種后第7 天處死小鼠，采集腸道淋巴結(jié)，放入含 4% FBS，0.5 mg ／ mL 膠原蛋白酶，0.5 mg ／ mL分散酶和 40 μg ／ mL DNaseⅠ的 RPMI1640 培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩消化 1 h；加入含4% FBS 的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，研磨，使用100 μm 尼龍網(wǎng)過濾，收集濾液，860 × g 離心 5 min；收集細(xì)胞，用 5 mL 40% Percoll 分離液重懸，使用淋巴細(xì)胞分離管，下層加入5 mL 80% Percoll 分離液，上層加入含細(xì)胞的 40% Percoll 分離液，860 × g 離心 30 min，取中間白色的淋巴細(xì)胞進(jìn)行流式分析，標(biāo)記抗體：FITC anti-mouse CD3、Alexa Fluor?700 anti-mouse CD4、APC ／Cyanine7 anti-mouse CD45、PE anti-mouse CD19。CD4+T 淋巴細(xì)胞標(biāo)記為 CD45+CD3+CD4+，B 淋巴細(xì)胞標(biāo)記為CD45+CD3-CD19+。

1.7.2 細(xì)胞因子檢測(cè) 首劑bOPV 接種后第1、3、6天，經(jīng)小鼠尾靜脈采血，分離血清，基于Luminex 平臺(tái)，利用Luminex 檢測(cè)技術(shù)，測(cè)定血清中細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-10、IL-17A、IFNγ、TNF-α 絕對(duì)濃度。

1.8 病毒載量檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。每劑bOPV 接種后第3 和第7 天收集當(dāng)天新鮮的小鼠糞便，按照1.6 項(xiàng)步驟處理得到糞便上清溶液，取140 μL 上清溶液，使用RNA 提取試劑盒提取樣品RNA。標(biāo)準(zhǔn)品制備：將Sabin1 和Sabin3 基因序列［由生工生物工程（上海）股份有限公司合成］酶切連接入pSP64 polyA 載體中，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Top10 工程菌，挑取單克隆，提取載有基因片段的完整質(zhì)粒作為模板。將分別載有Sabin1 和Sabin3 基因片段的完整質(zhì)粒線性化，使用RNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄獲得Sabin1 和Sabin3 的RNA 序列作為絕對(duì)定量PCR 的標(biāo)準(zhǔn)品，使用一步法絕對(duì)定量試劑盒測(cè)定病毒載量。Sabin1 株實(shí)時(shí)定量引物為：Primer1：5′-CCACTGGCTTCAGTGTTT-3′，Primer2：5′-AGGTCAGATGCTTGAAAGC-3′，Probe：Cy5-TTGCCGCCCCCACCGTTTCACGGA-BHQ-3；Sabin3 株實(shí)時(shí)定量引物為：Primer1：5′-TTAGTATCAGGTAAGCTATC-3′，Primer2：5′-AGGGCGCCCTAACTTT-3′，Probe：ROX-TCACTCCCGAAGCAACAG-BHQ2。擴(kuò)增條件為：第1步：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；第 2 步：95 ℃ 5 s，56 ℃30 s，35 個(gè)循環(huán)；在第 2 步 56 ℃擴(kuò)增時(shí)檢測(cè)信號(hào)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 5 和SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間平均值的比較采用t 檢驗(yàn)，率的比較采用Fisher 確切概率法，假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α = 0.05，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 灌胃雙歧桿菌對(duì)小鼠的影響 試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠體重在第 1、2、3、5、7 天均無明顯差別，在第 2天由于灌胃禁食的原因，體重略有下降，恢復(fù)飲食后兩組小鼠體重均上升至正常水平，見圖1。試驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠血清中 IL-1、TNF-α、IFNγ、IL-6、IL-10、IL-17A 含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 分別為0.479 7、1.086、0.912 6、1.596、0.476 和 1.009，P 分別為0.644 3、0.309 2、0.308 1、0.149 2、0.646 8 和 0.342 7），見圖2。

2.2 灌胃雙歧桿菌對(duì)小鼠脊灰特異的腸道黏膜免疫IgA 抗體的影響 檢測(cè)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組小鼠能在接種第1 劑bOPV 后迅速產(chǎn)生脊灰特異的腸道黏膜IgA，第1 劑bOPV 接種后第3 天，脊灰特異的腸道黏膜IgA 水平和陽轉(zhuǎn)率均顯著高于對(duì)照組（P 均<0.05）；接種第 2 劑 bOPV 后第 3 天，試驗(yàn)組脊灰特異IgA 水平顯著高于對(duì)照組（P < 0.01），但陽轉(zhuǎn)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）；在兩劑 bOPV 接種后的第7 天，兩組脊灰特異腸道黏膜IgA 水平和陽轉(zhuǎn)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），且 IgA 陽轉(zhuǎn)率在第7 天均達(dá)100%。見表1。

圖1 灌胃雙歧桿菌后小鼠體重的變化Fig.1 Changes in body weights of mice after inoculation with bifidobacteria by gavage

圖2 灌胃雙歧桿菌后小鼠血清中細(xì)胞因子分泌水平Fig.2 Cytokine secretion levels of mice after inoculation with bifidobacteria by gavage

表1 兩組小鼠接種第1 和第2 劑bOPV 后脊灰特異的IgA 分泌水平和陽轉(zhuǎn)率Tab.1 Polio-specific IgA secretion levels and positive conversion rates of mice in test and control groups after immunization with the 1st and the 2nd doses of bOPV

2.3 灌胃雙歧桿菌對(duì)脊灰減毒活疫苗引發(fā)的腸道黏膜免疫效應(yīng)的影響

2.3.1 淋巴細(xì)胞水平 流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，試驗(yàn)組小鼠接種bOPV 后，其腸道淋巴結(jié)中的B 細(xì)胞數(shù)量（16.01%）顯著高于對(duì)照組（4.92%）（t = 99.3，P <0.000 1），CD4+T 細(xì)胞數(shù)量?jī)山M之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 0.85，P = 0.42），見圖3。

2.3.2 細(xì)胞因子水平 首劑bOPV 接種后第3 天，試驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠血清中Th1 類細(xì)胞因子IL-1 和TNF-α 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 分別為 2.68 和 3.0，P 分別為 0.04 和 0.03）；試驗(yàn)組 Th1 類細(xì)胞因子IFNγ 和 Th2 類細(xì)胞因子 IL-6、IL-10 水平高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 分別為1.35、0.91 和1.57，P 分別為 0.23、0.40 和 0.19）。第 6 天兩組間各細(xì)胞因子水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 分別為0.99、0.69、0.49、0.69、0.37 和 2.70，P 分別為 0.37、0.52、0.65、0.52、0.73 和 0.054）。見圖4。

2.4 灌胃雙歧桿菌對(duì)接種bOPV 后排毒的影響 對(duì)于Ⅰ型脊灰疫苗株，第1 劑bOPV 接種后第3 天，試驗(yàn)組小鼠排毒量（972.3 個(gè) ／ μL）顯著低于對(duì)照組（6 627 個(gè) ／ μL）（t = 3.71，P = 0.006）；第 1 劑 bOPV接種后第 7 天和第 2 劑bOPV 接種后第 3、7 天，試驗(yàn)組小鼠排毒量略高于對(duì)照組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 分別為 1.70、1.53 和 1.25，P 分別為 0.13、0.16 和0.25）。Ⅲ型脊灰疫苗株與Ⅰ型有相同的趨勢(shì)，但試驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 分別為 0.31、1.43、1.23 和 2.02，P 分別為 0.76、0.19、0.25 和 0.08）。見圖5。

圖3 灌胃雙歧桿菌對(duì)脊灰減毒活疫苗激發(fā)的腸道淋巴細(xì)胞的影響Fig.3 Effect of inoculation with bifidobacterium by gavage on intestinal lymphocytes stimulated by bOPV

圖4 灌胃雙歧桿菌對(duì)脊灰減毒活疫苗激發(fā)的細(xì)胞因子分泌的影響Fig.4 Effect of inoculation with bifidobacterium by gavage on cytokine secretion induced by bOPV

圖5 灌胃雙歧桿菌對(duì)bOPV 接種后排毒的影響Fig.5 Effect of inoculation with bifidobacteria by gavage on virus shedding after immunization with bOPV

3 討 論

對(duì)于口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗，先前有研究表明鼠李糖乳桿菌［7］和干酪乳桿菌［8］能增強(qiáng)其特異性IgA水平，本研究發(fā)現(xiàn)，另外一種益生菌雙歧桿菌也具有相同的效應(yīng)。在脊灰受體轉(zhuǎn)基因小鼠上開展的研究提示，接種bOPV 前服用雙歧桿菌，可提高bOPV 激發(fā)的脊灰特異的黏膜IgA 分泌水平，且具有一定的減緩排毒效應(yīng)的作用。

給脊灰受體轉(zhuǎn)基因小鼠接種bOPV 前接種雙歧桿菌可快速激發(fā)小鼠黏膜免疫反應(yīng)，顯著提高脊灰特異的腸道黏膜IgA 的陽轉(zhuǎn)率，這種效應(yīng)在首劑bOPV 接種后更為明顯。在第1 劑bOPV 接種后第3天，接種過雙歧桿菌的試驗(yàn)組小鼠中脊灰特異的黏膜IgA 陽轉(zhuǎn)率顯著高于未接種雙歧桿菌的對(duì)照組，對(duì)照組小鼠無脊灰特異黏膜IgA 陽轉(zhuǎn)的個(gè)體。在第2 劑bOPV 接種后的第3 天，兩組中均有IgA 陽轉(zhuǎn)個(gè)體，兩組陽轉(zhuǎn)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。這種隨著劑次增加，服用雙歧桿菌提高脊灰特異的黏膜IgA 陽轉(zhuǎn)率變得不明顯的現(xiàn)象，可能與首劑bOPV已在兩組均留下了免疫記憶有關(guān)。因此，如使用益生菌來提高疫苗激發(fā)的腸道黏膜 IgA 水平，需在早期使用效果更佳。

服用雙歧桿菌不僅可幫助疫苗快速激發(fā)黏膜免疫，也可在服用bOPV 的最早期有一定的降低排毒量的作用。服用雙歧桿菌的小鼠在接種第1 劑bOPV 后的第3 天，Ⅰ型脊灰排毒量低于未接種雙歧桿菌的對(duì)照組小鼠，之后排毒量隨著接種bOPV 的劑次慢慢減少。接種第1 劑bOPV 后的第3 天，Ⅲ型脊灰排毒量在服用雙歧桿菌的試驗(yàn)組中略低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。服用雙歧桿菌后，在早期減少Ⅰ型和Ⅲ型脊灰病毒排毒的效應(yīng)有所不同，這可能與不同型別的脊灰病毒排毒模式差異有關(guān)。有研究表明，Ⅰ型OPV 比Ⅲ型OPV 到達(dá)排毒峰值的時(shí)間更早［9］，本研究也觀察到Ⅰ型OPV 在第3 天引起的排毒量遠(yuǎn)高于Ⅲ型OPV。在服用bOPV 后第3 天，Ⅲ型脊灰的排毒量不高，可能是服用雙歧桿菌引起的Ⅲ型脊灰病毒排毒減少效應(yīng)不明顯的原因。在接種第2 劑bOPV 后，無論是接種還是未接種雙歧桿菌的小鼠，其排毒量相比第1 劑接種后均顯著降低，這與首劑bOPV 免疫后留下的黏膜免疫記憶有關(guān)。首劑bOPV 接種后刺激腸道黏膜產(chǎn)生脊灰特異的IgA 和脊灰特異的效應(yīng)記憶性細(xì)胞，在第2 次bOPV 接種后，腸道的效應(yīng)記憶性細(xì)胞可快速反應(yīng)產(chǎn)生IgA 清除脊灰病毒，致使排毒大大減少。因此，在第2 劑bOPV 接種后，脊灰特異的免疫記憶對(duì)排毒的減少效應(yīng)占主導(dǎo)作用，雙歧桿菌引起的排毒減少效應(yīng)非常小，幾乎觀察不到。

一些在動(dòng)物模型上的研究幫助我們初步認(rèn)識(shí)了腸道菌群影響疫苗免疫反應(yīng)的機(jī)制。加氏乳酸桿菌能激活小鼠結(jié)腸固有層B 細(xì)胞群的分化［9］。另一些研究證明，連續(xù)用乳酸桿菌喂養(yǎng)小鼠能增強(qiáng)CD4+T細(xì)胞和B 細(xì)胞的增殖［11］。干酪乳桿菌與人外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)后，NK 和CD8+T 細(xì)胞上的活化標(biāo)記CD69 和CD25 上調(diào)，這些均是在疫苗特異的免疫反應(yīng)中十分重要的免疫細(xì)胞亞群［12］。本研究在對(duì)腸道淋巴結(jié)細(xì)胞分群分析后發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌接種的小鼠在bOPV 免疫后能激活更多B 淋巴細(xì)胞分化，這可能是引起在接種過雙歧桿菌的小鼠中接種bOPV能檢測(cè)到更多的脊灰特異IgA 抗體的原因。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠在接種bOPV 后細(xì)胞因子分泌上有差異，提示接種雙歧桿菌可提高口服脊灰疫苗使用后的免疫效應(yīng)，激活更多的Th1 細(xì)胞因子和免疫通路。

研究表明，益生菌在其他一些口服疫苗上同樣表現(xiàn)出佐劑效應(yīng)，如在嬰幼兒口服輪狀病毒疫苗之前服用鼠李糖乳桿菌，表現(xiàn)出輪狀病毒特異的IgM抗體分泌細(xì)胞增加，且具有更高的病毒特異IgA 抗體滴度［7］。服用嗜酸乳桿菌La1 和短雙歧桿菌Bb12的發(fā)酵乳后使用傷寒桿菌減毒活疫苗，能增加特異性的血清IgA 滴度［13］。這些現(xiàn)象表明，益生菌可能通過共同的調(diào)節(jié)機(jī)制和路徑影響口服疫苗的免疫效應(yīng)，其對(duì)增強(qiáng)口服疫苗的免疫效應(yīng)可能具有廣泛性。腸道共生菌能維持腸道體內(nèi)平衡，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能［14］。另一方面，腸道共生菌群可能修飾呈遞給腸道相關(guān)淋巴組織的病原相關(guān)分子模式，或通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸來直接或間接影響免疫功能［15-17］。

綜上所述，雙歧桿菌用于bOPV 接種前可提高脊灰特異的黏膜免疫IgA 分泌水平，且有一定的減緩排毒作用。研究者可使用益生菌或亞成分作為疫苗的佐劑，促進(jìn)疫苗特異性免疫的發(fā)生。