劉地 ，高惠仙 ，燕平梅 ，李娜 ，李博 ，武曉英

1.太原師范學(xué)院生物系，山西晉中030619；2.太原師范學(xué)院生物系天然生物活性成分創(chuàng)制獸藥工程中心，山西晉中030619

面對由新型病原體引發(fā)的傳染病，縮短疫苗研發(fā)周期，盡早開發(fā)出安全、有效的疫苗仍是目前重要的研究方向。近年來，經(jīng)皮給藥系統(tǒng)發(fā)展迅速，成為僅次于口服和注射的第三大給藥系統(tǒng)［1-2］。皮膚含有大量抗原提呈細(xì)胞能夠捕捉抗原，將抗原轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)并呈遞給T 細(xì)胞，激活抗原特異性的T 細(xì)胞和B細(xì)胞，實現(xiàn)全身的免疫反應(yīng)［3］。微針疫苗方便、安全、無痛，微針輸送系統(tǒng)可提高給藥效率和藥物的生物利用度，降低疫苗成本和冷鏈運輸要求［4-5］。此外，微針疫苗的接種不需要專業(yè)的醫(yī)護人員，利于大規(guī)模的快速接種［6］。到目前為止，微針在藥物輸送、組織修復(fù)及美容保健等領(lǐng)域已得到了廣泛應(yīng)用［7-8］。

乙型肝炎病毒核心蛋白病毒樣顆粒（hepatitis B virus core protein virus-like particles，HBc-VLPs）是一種安全、有效的疫苗載體［9］，這種納米級的載藥平臺為新型疫苗的研發(fā)提供了新的思路，在生物醫(yī)學(xué)研究、疫苗、藥物載體開發(fā)和基因治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［10-11］。本研究以定向改造的HBc-VLPs為載體，將模式抗原偶聯(lián)于HBc-VLPs 表面的主要顯性區(qū)域，制備具有納米結(jié)構(gòu)的重組抗原，再將抗原制成圖層式微針疫苗，并對微針疫苗以及疫苗的免疫效果進行初步評價。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌株 表達載體pET-28a（+）購自美國Novagen 公司；工程菌株 E.coli DH5α 和 E.coli BL21（DE3）購自美國Invitrogen 公司。

1.2 主要試劑及儀器 質(zhì)粒DNA 提取試劑盒和DNA片段純化試劑盒購自日本TaKaRa 公司；卡那霉素（Kan）、IPTG 和4-（N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸3-磺基-N-羥基琥珀酰亞胺酯鈉鹽（Sulfo-SMCC）購自美國Sigma-Aldrich 公司；羧甲基纖維素鈉和Lutrol F-68 購自上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司；Ni-NTA親和介質(zhì)購自美國Thermo Scientific 公司；Sepharose凝膠購自美國GE 公司；小鼠抗A 型流感M2e 單克隆抗體購自英國Abcam 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 抗體購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PE-anti-mouse CD8 和FITC-anti-mouse CD4 抗體購自美國Biolegend 公司；其他分析純化學(xué)試劑購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；金屬微針購自深圳誠之德精密管業(yè)有限公司；JEM-1400 透射電子顯微鏡購自日本JEOL 公司；A1R 激光共聚焦顯微鏡購自日本Nikon 公司；ChemiDoc XRS 多功能成像儀購自美國BioRad公司；FACSCalibur 流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司。

1.3 實驗動物 SPF 級 BALB ／ c 小鼠，6 周齡，雌性，體重16 ～18 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002，SYXK（滬）2012-0002。

1.4 微針疫苗抗原的設(shè)計 以流感病毒基質(zhì)蛋白2胞外區(qū)（matrix protein 2 ectodomain，M2e）作為主體模式抗原，其為一種跨膜蛋白，易于接近抗體，在各種甲型流感病毒中具有極高的保守性，其抗血清有抑制流感病毒復(fù)制的功能，序列為SLLTEVETPIRNEWGKRSNDSSD，其中賴氨酸用四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）標(biāo)記側(cè)鏈，由合肥國肽生物科技有限公司合成。HBc-VLPs 作為抗原的載體，通過定向改造HBc 單體，將其主要免疫顯性區(qū)域的第80 位丙氨酸Ala 變?yōu)榘腚装彼酑ys，利用雙功能交聯(lián)劑Sulfo-SMCC 將 M2e 抗原的氨基與 HBc-VLP 載體 Cys 的巰基連接，制備M2e-HBc-VLPs 疫苗抗原（圖1）。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 基因hbc 序列來源于NCBI GenBank（HE981189.1），利用重疊延伸 PCR 技術(shù)將序列中238-240 位的GCA 轉(zhuǎn)變?yōu)門GT，翻譯后的多肽序列80 位氨基酸由Ala 變?yōu)镃ys。目的DNA 片段與載體pET-28a（+）分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切12 h 后回收，使用T4 連接酶將回收產(chǎn)物16 ℃連接8 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5α，從平板上挑取經(jīng) Kan 抗性（終濃度 50 μg ／mL）篩選的單克隆菌落，初步培養(yǎng)后由華大基因公司進行商業(yè)化基因測序，篩選出序列完全正確的重組菌株并提取質(zhì)粒。

1.6 目的基因的誘導(dǎo)表達 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）中，挑取單克隆，轉(zhuǎn)接至含有 Kan 抗性（終濃度 50 μg ／ mL）LB 培養(yǎng)液的試管中培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)液按1 ∶100 的比例轉(zhuǎn)接至搖瓶中，37 ℃，200 r ／ min 振蕩培養(yǎng)至菌液 A600約 0.6 時，加入終濃度為 0.5 mmol ／ L 的 IPTG，30 ℃誘導(dǎo)表達 10 h。取樣進行15% SDS-PAGE 分析，ImageJ 軟件分析目的蛋白的表達量。

1.7 重組蛋白的純化 表達的重組蛋白在含6 mol／L尿素的磷酸鹽緩沖體系中，通過Ni-NTA 親和介質(zhì)純化獲得HBc 單體蛋白，15% SDS-PAGE 分析目標(biāo)蛋白的純化情況。將純化的蛋白在不含尿素的磷酸鹽緩沖液中4 ℃透析12 h，緩慢除去溶液中的尿素，完成單體蛋白自組裝，期間更換2 ～3 次透析液。最后使用Sepharose 凝膠將組裝后的納米微粒進一步純化，超濾濃縮洗脫的樣品。

1.8 載體微粒的染色及電鏡表征 HBc（A80C）蛋白單體純化后，在適宜的條件下能夠進行自組裝，形成VLPs。將30 μL 懸浮樣品滴于帶有支持膜的銅網(wǎng)上，靜置5 min；用濾紙吸去多余液體，待樣品風(fēng)干后，緩慢滴加5%磷鎢酸染液至樣品表面，靜置5 min；用濾紙吸去多余的磷鎢酸染液，自然干燥，使用JEM-1400 透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.9 抗原與載體的偶聯(lián) 將2 mg／mL Sulfo-SMCC 溶液與 2 mg ／ mL M2e 抗原溶液按照 1 ∶1 的比例混合，室溫反應(yīng)1 h，4 ℃透析6 h；將透析后的M2e 溶液與1 mg ／ mL HBc-VLPs 溶液按照 10 ∶1 的比例混合，室溫反應(yīng)4 h，4 ℃透析6 h，除去未交聯(lián)的抗原肽。

1.10 微針疫苗的制備 將金屬微針按照12 × 8 的陣列嵌入聚乙烯材料基質(zhì)中，微針底部直徑為150 μm，針長為700 μm。將嵌入聚乙烯材料支架的實心金屬微針根據(jù)設(shè)計位置放入聚二甲基硅氧烷模具中，加入含 1%（w ／ v）羧甲基纖維素鈉、0.5%（w ／ v）Lutrol F-68、15%（w ／ v）D-（+）-海藻糖二水合物及一定濃度抗原納米微粒的涂層混合溶液，抽真空使涂層溶液完全填充模具，4 ℃硅膠盒中干燥后脫模完成制備（圖2）。

皖河流域洪水發(fā)生期長，洪水過程具有“四大、兩快、一短”的特征。水患有自然原因，也有人為因素，根本原因在于氣候的不穩(wěn)定性。歷史上，人類不合理開發(fā)利用資源放大了不穩(wěn)定因素。徑流含沙量反映了水土流失狀況。暴雨引起的洪水暴漲，含沙量猛增，形成峰值，大量泥沙輸送到下游，使水土流失。

圖1 通過Sulfo-SMCC 介導(dǎo)的定點交聯(lián)抗原肽M2e 與HBc-VLPs 示意圖Fig.1 Scheme for conjugating M2e peptide and HBc-VLPs with Sulfo-SMCC

圖2 涂層式微針制備模式圖Fig.2 Scheme for preparation of coated microneedles

1.11 微針疫苗的穿刺 將瓊脂糖含量為1%的立方體凝膠于37 ℃預(yù)熱，將微針疫苗貼片至于凝膠立方表面，輕壓5 min 后揭下，除去表面未深入凝膠的涂層，觀察微針穿刺情況。將微針疫苗貼片至于新鮮的皮膚表面，輕壓5 min 后揭下，O.C.T 包埋劑固定，使用切片機制備組織切片，切片固定后采用蘇木精-伊紅染色法對組織切片染色，光學(xué)顯微鏡下鏡檢、拍照。未染色的組織切片放置在35 mm 玻璃底培養(yǎng)皿上，使用A1R 激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

1.12 疫苗涂層的釋放 將附載疫苗的涂層微針刺入小鼠皮膚一段時間后取下，前10 min 內(nèi)，每2 min取下 1 次，10 ～ 30 min 之間，每 5 min 取下 1 次，將微針上剩余涂層溶解于緩沖液中，使用熒光酶標(biāo)儀測定溶液樣品在550 nm 處的熒光強度，根據(jù)附載疫苗的總熒光強度計算抗原的釋放比例，并繪制釋放曲線。

1.13 偶聯(lián)抗原的抗原性檢測 采用Western blot法。將M2e-HBc-VLPs 微粒解聚，樣品經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；加入小鼠抗 A 型流感 M2e 單克隆抗體（1 ∶1 000 稀釋），室溫孵育2 h；經(jīng)PBST 緩沖液漂洗后，加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 抗體（1 ∶500 稀釋），孵育 2 h；漂洗后加入ECL 試劑，在ChemiDoc XRS 多功能成像儀中檢測。

1.14 微針疫苗的動物免疫 將小鼠隨機分為4 組：空白組、試驗1 組、試驗2 組和對照組，每組5 只，試驗前將小鼠背部提前進行脫毛處理。試驗1、2 組使用微針涂層疫苗進行皮內(nèi)免疫，劑量分別為50 和100 μg ／ 只；對照組按 100 μg ／ 只的劑量溶于緩沖液進行皮內(nèi)免疫；空白組不處理。共免疫3 次，間隔14 d。每次免疫1 周后，經(jīng)小鼠尾靜脈采血，分離血清，間接ELISA 法測定血清抗體效價。

1.15 特異性抗體效價檢測 將 5 μg ／ mL 的 M2e抗原包被液加入 96 孔板中，100 μL ／ 孔，4 ℃包被過夜；次日加入 300 μL 封閉液，37 ℃孵育 2 h；加入血清樣品（1 ∶100 稀釋），100 μL ／ 孔，37 ℃孵育 2 h；加入 HRP-山羊抗小鼠 IgG 抗體，100 μL ／孔，37 ℃孵育1 h；加入 OPD 顯色液，37 ℃避光孵育 20 min；H2SO4溶液終止反應(yīng)后，經(jīng)酶標(biāo)儀測定A492值。

1.16 T 淋巴細(xì)胞亞群分析 取100 μL 小鼠外周靜脈血液樣品，肝素鈉抗凝，200 × g 離心 20 min 分離細(xì)胞，取中層細(xì)胞，PBS 溶液洗滌2 次，依次加入1 μL PE-anti-mouse CD8 與 1 μL FITC-anti-mouse CD4抗體，室溫避光孵育20 min；PBS 溶液洗滌2 次，使用FACSCalibur 流式細(xì)胞儀進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 表達及純化產(chǎn)物的鑒定 誘導(dǎo)后的全菌體裂解液經(jīng)15% SDS-PAGE 分析，可見相對分子質(zhì)量約16 800 的特異蛋白條帶，大小與目的蛋白理論值相符，見圖3。經(jīng)ImageJ 軟件分析，目的蛋白含量達總蛋白的26%。HBc（A80C）蛋白經(jīng)親和純化后，雜蛋白被有效除去，目標(biāo)蛋白電泳條帶單一，無雜帶，純度達95%以上，見圖4。

2.2 HBc-VLPs 的形貌特征 透射電鏡觀察顯示，HBc-VLPs 微粒呈較為均一的球形，微球直徑約為30 nm，與HBc-VLPs 粒徑的理論值相符，見圖5。

2.3 微針涂層的形貌特征 顯微鏡觀察可見，未結(jié)合疫苗涂層的微針呈平滑的圓錐體形態(tài)；疫苗涂層附著于微針表面后，整體呈三角錐形。使用熒光顯微鏡進行成像時，TRITC 被激發(fā)后產(chǎn)生橙色熒光，可清楚地看見微針涂層除在針尖頂部附著較少外，其余部分均有大量附著。見圖6。

2.4 微針的穿刺結(jié)果 凝膠穿刺試驗結(jié)果顯示，疫苗涂層在含水的凝膠中能夠快速釋放，重組納米抗原沿著微針穿刺后形成的微孔向周圍擴散（圖7A、B）。皮膚組織穿刺試驗結(jié)果顯示，附載疫苗共聚物涂層的微針可刺穿皮膚角質(zhì)層，在皮膚表面形成微孔（圖7C），微針能將疫苗送達至皮膚真皮層，進行釋放（圖7D）。

圖3 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig.3 Expression of HBc（A80C）recombinant protein analyzed by SDS-PAGE

圖4 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE profile of purified recombinant HBc（A80C）protein

圖5 HBc-VLPs 微粒的透射電鏡觀察Fig.5 Transmission electron microscopy of HBc-VLPs

2.5 微針涂層的溶解與疫苗釋放 微針表面的涂層能在皮膚內(nèi)快速溶解，釋放出混合于涂層中的HBc-VLPs 納米重組抗原，前10 min 涂層內(nèi)的疫苗快速釋放，呈指數(shù)型釋放曲線，10 min 內(nèi)即可將涂層內(nèi)的抗原釋放超過90%，隨后抗原釋放速率趨于平緩，約15 min 涂層內(nèi)疫苗基本釋放完全，見圖8。

疫苗涂層進入皮膚后開始溶解，涂層聚合物微粒暴露在表皮，微粒從皮膚組織中吸取組織液，水平擴散至表皮，并隨著時間的推移擴散至內(nèi)皮，隨后垂直擴散至真皮層（圖9A）。大多數(shù)微粒隨著時間的推移逐步進入皮膚組織，最終輸送至微通道中心的一個空洞內(nèi)（圖9B）。

圖6 熒光顯微鏡下微針涂層的表面形態(tài)Fig.6 Surface morphology of microneedle coating under fluorescence microscope

圖7 微針列陣的凝膠和皮膚穿刺情況Fig.7 Gel and skin puncture of microneedle vaccine

圖8 微針涂層疫苗的釋放曲線Fig.8 Release curve of coated microneedle vaccine

圖9 共聚焦顯微鏡下微針穿刺后涂層中疫苗在皮膚組織的釋放情況Fig.9 Release of vaccine in coatings on skin tissue after microneedle micropuncture under confocal microscope

2.6 M2e-HBc 單體的抗原性 Western blot 分析顯示，M2e-HBc 單體蛋白能與小鼠抗A 型流感M2e 抗體發(fā)生特異性結(jié)合，見圖10，表明其抗原性良好。由于M2e-HBc 單體聚合形成納米結(jié)構(gòu)微粒時，整體的抗原性會進一步加強，因此能夠更好地激活機體的免疫系統(tǒng)。

圖10 M2e-HBc 單體蛋白的Western blot 分析Fig.10 Western blotting of M2e-HBC monomer protein

2.7 M2e-HBc-VLPs 微針疫苗的免疫效果

2.7.1 特異性抗體效價 初次免疫后，各組小鼠血清中僅檢測到少量的抗原特異性IgG 抗體，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）。第 2 次免疫后，試驗 1、2組和對照組小鼠血清中的特異性抗體均明顯升高，其中試驗2 組和對照組抗體含量較高。第3 次免疫后，試驗1、2 組和對照組小鼠血清中均檢測到了抗原特異性IgG 抗體，試驗1 組抗體效價差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 4.32，P ＜ 0.05），試驗 2 組抗體效價進一步升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 6.49，P ＜ 0.01），微針疫苗誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的抗體效價幾乎與等劑量注射免疫相同。見圖11。

圖11 免疫后各組小鼠血清中抗M2e 特異性抗體的含量Fig.11 Serum M2e-specific antibody levels of mice in various groups after immunization

2.7.2 CD4+和CD8+T 細(xì)胞含量的變化 與空白組相比，試驗2 組與對照組小鼠CD4+T 細(xì)胞比例均明顯升高，而CD8+T 細(xì)胞比例小幅下降，CD4+T／CD8+T比值顯著升高。試驗2 組CD4+T 比例提高了約11.1%，CD4+T ／ CD8+T 比值達2.42%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 4.74，P ＜0.05）。見表1。表明疫苗抗原能夠在一定程度上激活機體的細(xì)胞免疫，而微針疫苗激活機體細(xì)胞免疫的能力強于同等條件的注射疫苗。

表1 各組小鼠免疫后CD4+與CD8+T 細(xì)胞含量的變化（±s，n = 5）Tab.1 Changes of contents of CD4+ T and CD8+ T cells in mice of various groups after immunization（±s，n = 5）

表1 各組小鼠免疫后CD4+與CD8+T 細(xì)胞含量的變化（±s，n = 5）Tab.1 Changes of contents of CD4+ T and CD8+ T cells in mice of various groups after immunization（±s，n = 5）

注：a 表示與空白組比較，P ＜ 0.05。

組別 CD4+T（%） CD8+T（%） CD4+T／CD8+T空白組 33.83 ± 1.55 22.57 ± 0.95 1.50 ± 0.11試驗 2 組 44.90 ± 2.16 18.57 ± 0.78 2.42 ± 0.11a對照組 39.03 ± 1.14 18.10 ± 0.93 2.15 ± 0.13

3 討 論

疫苗是預(yù)防和控制傳染病最有效的措施，盡早研制出有效的疫苗能更好地救治患者和控制疫情。能夠更換“抗原模塊”的工程疫苗可在一定程度上縮短疫苗制備和評價周期，通用的疫苗平臺可用于結(jié)合各種抗原，減少過程變化，降低成本，縮短開發(fā)時間［12-13］。VLPs 載體能夠增強抗原穩(wěn)定性，產(chǎn)生高而持久的抗體反應(yīng)，具有較高的安全性，是一種較為理想的疫苗載體［14］。目前，已有包括乙型肝炎病毒、流感病毒等多種VLPs 疫苗獲批上市［15］。本研究對HBc-VLPs 載體進行改造，將其作為連接“抗原模塊”的核心，可將針對不同病原微生物的抗原定點連接至該載體上。在HBc（A80C）單體蛋白純化過程中，存在于菌體破碎液上清中的部分蛋白在緩沖液中發(fā)生了自組裝，His 親和標(biāo)簽被包裹在微粒的內(nèi)部，難以結(jié)合到Ni 親和填料上，導(dǎo)致蛋白收獲率降低。通過在緩沖體系中加入6 mol ／ L 的尿素，利用尿素對蛋白可逆的變性作用，使聚合的蛋白能夠解聚，純化標(biāo)簽得以暴露，提高了蛋白的獲取率［16］。HBc（A80C）蛋白單體自組裝形成VLPs 后，通過Sepharose 凝膠柱層析，能夠除去未組裝的單體蛋白，可進一步獲取純度較高的HBc-VLPs 納米微粒。

微針疫苗方便、無痛、安全，可用于特定皮膚區(qū)域的藥物輸送，特別是大分子活性藥物，是未來新式疫苗的一個發(fā)展方向。根據(jù)給藥方式，可將微針疫苗分為固體、涂層、空心和溶解微針4 種類型，其中涂層微針是研究最為廣泛的一種［17-18］。微針涂層一般以安全無毒、生物相容性好、能夠快速溶解的材料為基質(zhì)。本研究選取羧甲基纖維素鈉作為基質(zhì)，將Lutrol F-68 作為乳化劑與穩(wěn)定劑，再輔以一定濃度的海藻糖。羧甲基纖維素鈉是一種高分子網(wǎng)狀化合物，無臭、無味、有吸濕性，安全性好，在食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛；Lutrol F-68 易溶于水，具吸濕性，與皮膚相溶性好，能夠增加皮膚通透性，可促進外用藥物的吸收；海藻糖能夠使蛋白質(zhì)分子保持含水狀態(tài)時的構(gòu)型，對抗原蛋白起到一定的保護作用［19］。羧甲基纖維素鈉與Lutrol F-68 結(jié)合后，形成了表面的均勻陰離子電荷層，通過靜電作用使涂層更加緊密地沉積在微針表面［20］。微針刺入皮膚前，涂層共聚物的電荷為負(fù)，進入皮膚后，皮膚與疫苗涂層相互作用，電荷發(fā)生變化，由于靜電作用，疫苗涂層會逐層分解，釋放出疫苗涂層中的納米微粒。

在模式疫苗免疫階段，M2e-HBc-VLPs 微針疫苗能有效刺激小鼠產(chǎn)生抗原特異性的IgG 抗體，與皮內(nèi)注射的免疫方式相比，使用微針疫苗進行皮膚免疫，試驗組小鼠幾乎產(chǎn)生了同等水平的抗體，而激活機體細(xì)胞免疫的能力強于同等條件的注射疫苗，這也進一步說明了皮膚給藥方式的有效性。微針疫苗與注射疫苗相比具有許多優(yōu)勢，但也存在包括皮膚免疫機制尚未完全闡明，目前可用的基質(zhì)材料較少，疫苗活性不穩(wěn)定等問題［21］，相信隨著更多新型材料被發(fā)掘，人體免疫機理的不斷完善，微針疫苗會得到進一步發(fā)展。

本研究以定向改造的HBc-VLPs 為載體，提供了一種利用具備定點偶聯(lián)功能的HBc-VLPs 載藥平臺開發(fā)“模塊化疫苗”的新思路，通過Sulfo-SMCC 將模式抗原錨定于HBc-VLPs 載體表面的特定位點，再將納米抗原微?；旌嫌诳焖偃芙獠牧匣|(zhì)中，制備涂層式的微針疫苗，通過物理性質(zhì)的表征以及動物免疫等方式，驗證模式疫苗的有效性。具備定點偶聯(lián)功能的HBc-VLPs 載體能夠搭載多種抗原模塊，形成針對特定病原體的疫苗，在一定程度上縮短疫苗制備、評價周期。該方法能夠應(yīng)用于類似的VLPs載體，為HBc-VLPs 作為模塊化疫苗載體奠定了研究基礎(chǔ)，促進了基于HBc-VLPs 載體模塊化微針疫苗的研發(fā)以及HBc-VLPs 在其他領(lǐng)域的應(yīng)用。