雷昌斌 林宏生 唐新文 郭志文 蔡永得 唐 光 王 東 王 炯△

（1 湘南學院附屬醫(yī)院(臨床學院)臨床醫(yī)學研究中心，郴州423000；2 暨南大學第一附屬醫(yī)院骨科，廣州510632 ；3 匹茲堡大學，弗格森實驗室，Pittsburgh 匹茲堡15261）

隨著人口老齡化進程，退變性疾病逐漸成為影響人們健康和生活水平的主要疾病[1]。腰痛也隨之成為第二大常見病及多發(fā)病。據(jù)統(tǒng)計有超過80%的人一生中會出現(xiàn)過腰痛，是病人手術(shù)的第5 大病因[2]。而椎間盤退變 (intervertebral disc degeneration, IDD)是引起腰痛的主要病因，造成了重大的社會經(jīng)濟和醫(yī)療負擔[3]。椎間盤退變可由衰老、氧化應激、炎癥、DNA 損傷、生物力學改變及全身因素、吸煙、肥胖等引起，其中衰老是引起椎間盤退變的最重要因素[4,5]。椎間盤既堅韌又富有彈性，具有緩沖脊柱受壓和沖擊的作用。椎間盤是人體最大的沒有血液供應的器官，內(nèi)部髓核營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物，主要通過上下終板及纖維環(huán)的外1/3 毛細血管的滲透作用[4]。衰老的椎間盤包括脫水、纖維化、裂隙，椎間盤高度降低等改變，容易造成纖維環(huán)破裂、髓核突出[6]。目前的治療和研究都集中在椎間盤局部因素使椎間盤細胞損傷、細胞基質(zhì)損失，導致椎間盤細胞死亡或衰老[7]。也有少量研究證實椎間盤外因素如骨質(zhì)疏松和血管硬化癥[8]、肌營養(yǎng)不良[9]等可以加速椎間盤退變。但是尚無血液循環(huán)因素對椎間盤退變的影響研究。

異時聯(lián)體共生模型 (heterochronic parabiosis model)通過將年輕和年老個體的皮膚及軟組織相連，使個體間毛細血管融合達到血液和代謝產(chǎn)物交換的目的，距今已有150 多年的歷史[10]。聯(lián)體共生模型有在腫瘤、移植、免疫耐受方面的應用，但直到20 世紀中后葉才開始在衰老研究中應用。Loffredo 等[11]報道異時聯(lián)體共生模型通過血液交換，年輕小鼠血液中生長分化因子11 (growth differentiation factor 11, GDF11)蛋白可以逆轉(zhuǎn)年老小鼠心肌細胞衰老肥大。本研究團隊的前期實驗也證實異時聯(lián)體共生模型血液循環(huán)因素可以影響脊柱椎旁肌肉組織的衰老退變[12]。椎間盤是人體最大的缺少血液供應器官，營養(yǎng)物質(zhì)僅通過上下椎板及外圍纖維環(huán)滲透吸收。聯(lián)體共生模型能否通過血液循環(huán)因素影響缺少血液供應的椎間盤組織的衰老退變？因此，我們假設老年小鼠血液循環(huán)因素可以加速年輕小鼠椎間盤衰老退變。本研究通過建立小鼠異時聯(lián)體共生模型，對比同時聯(lián)體(isochronic parabiosis) 共生模型，評估血液循環(huán)因素對小鼠脊柱椎間盤退變的影響，探討其作用機制，為重新認識椎間盤衰老的原因并探索新的治療思路提供理論基礎。

方 法

1.試劑與儀器

培養(yǎng)基：90% DMEM/F-12(1X)（Life Technologies 公司，美國）；10% 胎牛血清 (Fetal Bovine Serum, FBS)（ATLANTA 公司，美國）?？贵w：p16、p21、ADAMTS4、MMP13 (abcam 公司，美國），LC3（Thermo 公司，美國）。DAPI：(4', 6-diamidino-2-phenylindole) 即4', 6-二脒基-2-苯基吲哚，規(guī)格：2 ml；型號：P36935（Invitrogen 公司，美國）。Quant-iT PicoGreen ds DNA 試 劑 盒（Invitrogen 公司，美國）；流式細胞儀：2030 Multilabel Reader VicToR X3（PerkinElmer 公司，美國）。聚偏二氟乙烯膜（poly vinyli?dene difluoride, PVDF, Bio-Rad公司，美國），Western Blot 儀器：（Bio-RAD 公司，美國）。清潔操作臺、病理切片機及熒光顯微鏡（Nikon Eclipse Ts100; Nikon 公司，美國）。

2.實驗動物

實驗通過動物倫理委員會審查和審批，并嚴格遵守國家衛(wèi)生和醫(yī)學研究委員會對實驗動物護理和管理的相關(guān)指南。選用C57BL/6J 野生型雌性小鼠，其中年輕小鼠選擇3 個月齡，年老小鼠選18 個月齡，對體重無明顯限制。聯(lián)體手術(shù)后按標準條件下每對聯(lián)體小鼠單籠飼養(yǎng)，給予充足的食物和水，并注意消毒和使用抗生素預防聯(lián)體病。

3.動物模型的建立和分組

將年輕和年老的小鼠異時聯(lián)體 (heterochronic parabiosis, Y-O)，年輕和年輕小鼠同時聯(lián)體 (isochronic parabiosis, Y-Y)，年老的和年老的小鼠同時聯(lián)體 (isochronic parabiosis, O-O)，分別聯(lián)體融合8周。術(shù)前進行1 周的適應治療，并注意做好小鼠保溫及清潔消毒，手術(shù)從一側(cè)小鼠上肢肘關(guān)節(jié)沿腹部到下肢膝關(guān)節(jié)處切開皮膚，從筋膜層分離皮瓣，為了增大血液交流面積將皮膚及部分腹膜融合，后者注意連續(xù)縫合。麻醉蘇醒后檢測，可將小鼠放置37℃溫箱有助于小鼠體溫調(diào)節(jié)恢復。每個籠子只能飼養(yǎng)一對共生小鼠，提供充足的水及食物。術(shù)后24 h 從尾部靜脈注射Evan blue 染料檢測聯(lián)體小鼠是否共享血液循環(huán)。文獻報道異時聯(lián)體2 周后，兩個不同個體的血液循環(huán)可達到動態(tài)平衡。聯(lián)體8 周后處死小鼠，解剖小鼠脊柱椎間盤組織檢測。

4.組織H&E 染色及免疫熒光染色

取各組脊柱腰椎 (L5-6) 功能單位 (functional spine unit, FSU)，F(xiàn)SU 一側(cè)盡量靠近終板避免破壞椎間盤組織，另一側(cè)保留2 mm 骨組織便于后期包埋操作。將FSU 浸泡在2%多聚甲醛中24 h，用1%PBS 清洗2 遍后加入70%酒精繼續(xù)浸泡24 h，后用石蠟包埋及切片，進行標準H&E 染色和組織免疫染色(LC3)。

5.組織免疫熒光 (immunofluorescence, IF)

解剖脊柱腰椎 (L1-L4) 椎體功能單位，將FSU 浸泡于2%的多聚甲醛中過夜，取出后用1%PBS 沖洗3 次，將沖洗后FSU 浸泡在30%的蔗糖溶液中放置4℃房間過夜。取出FSU 用包埋劑 (optimum cutting temperature, OCT) 包埋（注意將保留骨組織的一端朝上），放置-80℃冰箱1 天后冰凍切片，組織厚度設定為7 μm，切片需要包括纖維環(huán)組織及內(nèi)部髓核組織。貼片后的載玻片放入1% PBS 液5 min洗3 次，封閉1 h 后加入150 μl 一抗（aggrecan 1:200稀釋） 避光過夜。第2 天用PBS 液洗5 次，再加入二抗150 μl （抗體按1:500 稀釋），再次用1%PBS液洗5 次后加入DAPI 染色蓋上蓋玻片，注意避光孵育。樣本使用尼康熒光顯微鏡讀片，使用相同的設置和曝光時間獲取不同組別的圖像并進行等效處理。

6.蛋白印痕檢測 (Western blot analysis)

解剖提取頸椎和胸椎椎間盤組織，稱重后按1 g:10 ml 加入蛋白裂解液，提取各樣本組織蛋白，平衡蛋白濃度后每孔加入30 μg 蛋白量，使用4%～20%聚丙烯酰胺凝膠跑膠，之后用PVDF 轉(zhuǎn)膜。室溫下在5%的脫脂牛奶封閉1 h。分別加入一抗P16、P21、MMP13、ADAMTS4（1:1000 稀釋）在4℃搖擺平臺上過夜。第2天用TBS-T緩沖液清洗3遍PVDF膜，每次10 min，之后在室溫下加入二抗（1:1 0000 稀釋）并避光搖晃1 h。后再用PBS-T 洗滌3 次，使用奧德賽成像儀以化學顯色蛋白質(zhì)條帶，并且通過使用儀上的軟件進行定量分析。

7. RT-qPCR 檢測RNA 表達

解剖提取腰椎L1-L3椎間盤組織后，用Trizol法提取組織總RNA 并進行逆轉(zhuǎn)錄。按照預先設定的熱學過程： 95℃預變性 10 min，95℃變性 15 s，58℃退火30 s，62℃延伸1 min，50 個循環(huán)，保存設置。用 GAPDH 作為內(nèi)參使基因表達標準化。每個樣品做 2 個復孔。系統(tǒng)自動繪制擴增曲線和熔解曲線，并采集CT 值。引物序列(5'-3')：GAPDH 上游引物，GGTTGTCTCCTGCGACTTCA；下游引物，TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC。P16 上游引物，AATCTCCGCGAGGAAAGC；下游引物，GTCTGCAGCGGACTCCAT。P21 上游引物，GGAGACTCTCAGGGTCGAAA；下游引物，GGATTAGGGCTTCCTCTTGG。MMP13 上游引物，TCCCTGCCCCTTCCCTATGGT；下游引物，CTCGGAGCCTGTCAACTGTGGA。ADAMTS4 上游引物，ATGGCTATGGGCACTGTCTC；下游引物，GTGTTTGGTCTGGCACATGG。

8.統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果采用Shapiro-Wilk 檢驗法進行正態(tài)性檢驗。實驗結(jié)果的統(tǒng)計學分析采用4 組獨立實驗數(shù)據(jù)的平均值，將所有回收的資料統(tǒng)一編號后，采用Graphpad Prism 7.03 統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計描述和統(tǒng)計分析。對于雙變量非參數(shù)數(shù)據(jù)，采用Mann-Whitney 檢驗，用Bonferroni 校正方差分析對多個實驗組的數(shù)據(jù)進行多重比較。P值取雙側(cè)概率，進行統(tǒng)計描述和統(tǒng)計推斷，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1. H&E 染色及免疫組化染色

實驗結(jié)果顯示，從陰性對照組Y-Y 中可觀察到健康的椎間盤組織H&E 染色后可見：椎間盤纖維環(huán)結(jié)構(gòu)完整，纖維環(huán)及髓核組織沒有裂痕，纖維環(huán)及髓核分界清楚，髓核組織含大量髓核細胞，基質(zhì)完整；Y-O 組H&E 染色可見：纖維環(huán)基質(zhì)結(jié)構(gòu)破損并出現(xiàn)裂痕，纖維環(huán)及髓核分界不清，髓核細胞數(shù)相比Y-Y 組明顯減少，O-O 組H&E 染色可見：髓核細胞大量消失，纖維環(huán)及髓核基質(zhì)出現(xiàn)大量裂痕（見圖1）。

2.組織免疫熒光IF 檢測aggrecan 表達

IF 檢測Y-O 組年輕小鼠aggrecan 含量較Y-Y組年輕小鼠減少了20.1%±3.2%，IF 檢測O-O 組椎間盤組織aggrecan 含量較Y-Y 組下降23.9%±3.7%（P＜ 0.05，見圖2）。

3.衰老基因表達的差異性

本研究檢測特異性基因P21 及P16 蛋白表達和RNA 轉(zhuǎn)錄的差異性。Western Blot 檢測顯示：Y-O組P16 蛋白表達較Y-Y 組升高77.1±20.5%，O-O 組P16蛋白表達較Y-Y組升高206.7±53.5% (P＜ 0.05)。Y-O 組P21 蛋白表達比Y-Y 組有升高趨勢，但無明顯統(tǒng)計學差異。RT-qPCR 檢測P16 基因異時聯(lián)體后有升高的趨勢但組間無統(tǒng)計學差異。RT-qPCR 檢測P21 基因三組的表達分別為Y-Y：1±0、Y-O：1.405±0.067、O-O：1.955±0.242，組間比較有統(tǒng)計學差異(P＜ 0.05，見圖3）。

4.椎間盤組織金屬蛋白酶表達差異性

實驗數(shù)據(jù)顯示，MMP13 蛋白表達及mRNA 基因檢測均是Y-O 組較Y-Y 組升高，MMP13 蛋白表達量O-O 組較年輕小鼠Y-Y 組升高，組間有統(tǒng)計學差異(P＜ 0.05)。Western Blot 檢測椎間盤基質(zhì)代謝產(chǎn)物ADAMTS4 蛋白表達分別為Y-Y：1±0、Y-O：1.331±0.085、O-O：2.690±0.324，Y-O 及O-O 組明顯升高，與Y-Y 組比較有明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。RT-qPCR 檢 測ADAMTS4 基 因 表 達Y-O 組比Y-Y 組升高33.5±22.6%，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，O-O 組與Y-Y 組比較明顯升高，組間比較有統(tǒng)計學差異（P＜ 0.05，見圖4）。

討 論

聯(lián)體共生模型 (parabiosis model) 早在150 年前就已建立，通過兩個獨立的個體血液融合對免疫、移植、腫瘤、衰老等進行研究[10,13,14]。異時聯(lián)體共生模型使年輕和年老個體血液嵌合，從而達到體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的交換，改變細胞所處的外環(huán)境[15]。Sinha 等[16]通過對小鼠聯(lián)體共生模型研究發(fā)現(xiàn)全身血液環(huán)境中的GDF11 水平的增加可以改善肌肉結(jié)構(gòu)和功能，逆轉(zhuǎn)肌肉衰老。Yamasaki 等[17]使用聯(lián)體共生模型研究外周血細胞 (peripheral blood cells, PBCs) 對同樣缺少血液供應的關(guān)節(jié)軟骨的影響研究，發(fā)現(xiàn)PBCs 可以修復早期關(guān)節(jié)軟骨損傷，逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)軟骨退變。本實驗通過建立小鼠同時和異時聯(lián)體模型，證實椎間盤的衰老不僅受椎間盤局部因素的影響，血液循環(huán)因素也可以影響椎間盤組織的衰老退變。

圖1 小鼠腰椎間盤組織石蠟切片H&E 染色及免疫組化染色小鼠腰椎間盤組織石蠟切H&E 染色Y-Y 組纖維環(huán)及髓核結(jié)構(gòu)完整，無裂痕，分界清楚，內(nèi)部髓核基質(zhì)完整，有大量的髓核細胞；Y-O 組可見纖維環(huán)與髓核交界處分界不清，髓核基質(zhì)部分裂縫（紅色箭頭），內(nèi)部髓核細胞明顯較Y-Y 組減少；O-O 組可見髓核細胞減少（紅色三角符號），基質(zhì)周圍出現(xiàn)裂縫（紅色箭頭） 標尺 = 200 μmFig. 1 Impact of circulatory factors from aged mice on gross disc morphology H&E staining of lumbar disc was performed to assess the gross morphological changes with aging. In Y-Y group, the structure of AF and NP was intact, without cracks, and the boundary was clear. There were a lot of NP cells in the inner NP matrix; In the Y-O group, the junction between the AF and NP was not clear, and part of the NP matrix was cracked (red arrow), and the number of NP cells in the Y-O group was significantly less than that in the Y-Y group; In O-O group, the number of NP cells decreased (red triangle symbol), and cracks around the matrix (red arrow). Scale bar = 200 μm

圖 2 血液循環(huán)因素對年輕小鼠椎間盤aggrecan 蛋白表達的影響(n = 4)紅色為aggrecan 染色，藍色為細胞核DAPI 染色，可見Y-Y 組紅色aggrecan 明顯較Y-O 及O-O 組多，定量分析顯示各組間有明顯差異，所示數(shù)據(jù)為四組獨立實驗(±SD)。*P ＜ 0.05Fig. 2 Effects of circulatory factors from aged mice on aggrecan protein expression in intervertebral discs in mouse heterochronic parabionts (n = 4)Red is aggrecan staining, blue is DAPI staining. It can be seen that red aggrecan in Y-Y group is significantly more than that in Y-O and O-O groups. Quantitative analysis shows that there are significant differences among the groups. Data shown are ±SD of 4 independent experiments, *P ＜ 0.05.

圖3 血液循環(huán)因素對小鼠異時聯(lián)體椎間盤衰老基因蛋白和基因表達的影響 (n = 4)(A) Western Blot 檢測結(jié)果顯示Y-O 及O-O 組衰老基因P16 表達量較Y-Y 組升高；(B) P16 蛋白表達量Western Blot 定量分析結(jié)果；(C) P16 基因RT-qPCR 定量檢測結(jié)果；(D) Western Blot 檢測結(jié)果顯示O-O 組衰老基因P21 表達量較Y-Y 組明顯升高；(E) P21 蛋白表達量Western Blot 定量分析結(jié)果，Y-O 組較Y-Y 組升高不明顯；(F) P21基因RT-qPCR 定量檢測結(jié)果，Y-O 及O-O 組表達量較Y-Y 組明顯升高。*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，*** P ＜0.001Fig. 3 Effects of circulatory factors from aged mice on expression of cellular senescence markers in IVDs in mouse heterochronic parabiotants (n = 4)(A) The expression of P16 was detected by Western blot; (B) P16 in Y-O and O-O groups was higher than that in Y-Y group; (C)P16 gene was detected by RT-qPCR; (D) The expression of P21 was detected by Western blot; (E) Western blot analysis showed that the expression of P21 protein in Y-O group was not signifciantly higher than that in Y-Y group; (F) The expression of P21 gene in Y-O and O-O groups was signifciantly higher than that in Y-Y group. *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001.

1.老年血液循環(huán)因素對椎間盤組織形態(tài)的影響

本研究中通過異時聯(lián)體，椎間盤組織石蠟切片H&E 染色見，通過老年小鼠血液環(huán)境的影響年輕小鼠椎間盤組織中央的髓核細胞明顯減少，并且纖維環(huán)組織出現(xiàn)裂痕，纖維環(huán)及髓核交界處分界不清楚。Isaac 等[9]對杜氏肌營養(yǎng)不良癥 (duchenne muscular dystrophy, DMD) 模型研究中發(fā)現(xiàn)，肌肉組織的退化可以加速脊柱椎間盤組織的退變。這些都證明椎間盤外的因素可以影響椎間盤組織和細胞的衰老退變。Smith 等[18]報道衰老的系統(tǒng)環(huán)境中免疫相關(guān)分子和細胞變化可以負向調(diào)節(jié)細胞的形成和分化。

圖 4 血液循環(huán)對小鼠異時聯(lián)體椎間盤分解代謝蛋白和基因表達的影響(n = 4)(A) Western Blot 檢測各組MMP13 蛋白印痕結(jié)果；(B) MMP13 蛋白表達量Western Blot 定量分析結(jié)果；(C)MMP13 基因RT-qPCR 定量檢測結(jié)果；(D) Western Blot 檢測各組ADAMTS4 蛋白印痕結(jié)果；(E) ADAMTS4 蛋白表達量Western Blot 定量分析結(jié)果；(F) ADAMTS4 基因RT-qPCR 定量檢測結(jié)果。*P ＜ 0.05Fig. 4 Effects of circulatory factors from aged mice on catabolic gene expression in intervertebral discs obtained from mouse heterochronic parabionts (n = 4)(A) MMP13 protein was detected by Western blot; (B) The expression of MMP13 protein was analyzed by Western blot;(C) MMP13 gene was detected by RT-qPCR; (D) ADAMTS4 protein was detected by Western blot; (E) The expression of ADAMTS4 protein was analyzed by Western blot; (F) ADAMTS4 gene was detected by RT-qPCR. *P ＜ 0.05.

2.老年血液循環(huán)因素對椎間盤細胞衰老基因表達的影響

文獻報道，椎間盤衰老細胞 (senescent cells,SnCs) 可以引起細胞DNA 損傷、炎癥反應、造成細胞基質(zhì)分解代謝和合成代謝失平衡等加速細胞衰老退變[19]。其中P53-P21-Rb 和P16-Rb 信號通路被激活，是調(diào)控細胞衰老的重要通路[20]。衰老細胞內(nèi)P53-P21-Rb 和P16-Rb 信號通路被激活，導致細胞復制停止在G1 期和抑制CDK4、CDK6 導致Rb 和Hb 的低磷酸化狀態(tài)引起細胞衰老。Liu 等[21]Western Blot 檢測小鼠異時聯(lián)體共生年輕與年老小鼠聯(lián)體后腎臟組織中P16 蛋白表達量比年輕與年輕小鼠同時聯(lián)體時升高。本研究RT-qPCR 檢測發(fā)現(xiàn)老年小鼠椎間盤組織mRNA 中衰老基因P16 及P21 基因的表達較年輕小鼠明顯升高。異時聯(lián)體共生組 (Y-O)椎間盤組織P16、P21 的蛋白表達明顯較同時聯(lián)體共生組 (Y-Y) 升高，與文獻報道一致。因此，異時聯(lián)體共生，老年小鼠血液環(huán)境可以加速衰老基因的表達。

3.老年血液循環(huán)因素對椎間盤組織基質(zhì)代謝的影響

椎間盤 (intervertebral disc, IVD) 主要由上下椎板、外圍纖維環(huán)及內(nèi)部髓核組成，其主要成分為糖胺聚糖 (glycosaminoglycans, GAG)、I 和II 型膠原蛋白 (collagen) 及聚蛋白多糖 (proteoglycan) 為基礎組成[22]。聚糖蛋白聚糖 (aggrecan)是椎間盤組織基質(zhì)的重要成分，隨著椎間盤衰老會出現(xiàn)纖維化、蛋白水解及水分含量下降導致aggrecan 含量減少[23]。本研究IF 檢測異時聯(lián)體后Y-O 組椎間盤中aggrecan 含量較Y-Y 組減少，導致椎間盤基質(zhì)含水量減少、彈性下降，加速細胞凋亡。金屬蛋白酶與腫瘤細胞遷移、細胞外基質(zhì)降解和細胞凋亡相關(guān)，椎間盤組織衰老與金屬蛋白酶MMP13、ADAMTS4表達呈正相關(guān)。與此同時金屬蛋白酶MMP13 及ADAMTS4 可以加快細胞外基質(zhì)降解，ADAMTS4可以酶切aggrecan 多個結(jié)合位點，降解蛋白多糖核心結(jié)構(gòu)[24]。異時聯(lián)體共生老年血液循環(huán)因素可以使年輕小鼠椎間盤MMP13、ADAMTS4蛋白表達升高，促進年輕小鼠椎間盤組織老化，但其具體機制仍需要進一步研究。

綜上所述，異時聯(lián)體共生模型通過血液循環(huán)因素，可以影響小鼠脊柱椎間盤組織的衰老退變，老年小鼠血液循環(huán)因素可以加速年輕小鼠椎間盤組織衰老。全身血液環(huán)境通過椎間盤組織營養(yǎng)物質(zhì)吸收與交換，調(diào)控椎間盤外周基質(zhì)的分解與合成代謝的平衡、促進自噬、氧自由基清除及干細胞修復等方面影響脊柱椎間盤組織的衰老進程。因此，在治療椎間盤退變的同時不僅需要考慮椎間盤局部因素，也需要考慮全身血液循環(huán)因素對椎間盤組織的影響。另外，需要進一步研究血液循環(huán)因素影響脊柱椎間盤衰老的作用機制及具體通路的分子調(diào)控關(guān)系。