王承煜， 范亞偉， 王玨

1.山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，山西 太原（030000）； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院口腔科，山西 太原（030000）

隨著對口腔種植技術(shù)的深入研究，研究者發(fā)現(xiàn)當(dāng)種植術(shù)區(qū)具有充足的軟組織量時(shí)才能保證良好的生物學(xué)封閉，減少種植體周圍炎的發(fā)生［1］。目前，修復(fù)口腔黏膜缺損的方法有很多，然而判斷軟組織增量效果的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是自體結(jié)締組織移植［2］，但其創(chuàng)傷較大、易發(fā)生感染且需要開辟第二術(shù)區(qū)，不易被患者接受。隨著生物科技的進(jìn)步和發(fā)展，生物膜性材料逐步發(fā)展并成為臨床中常用的軟組織修復(fù)材料，其中富血小板纖維蛋白（plate?let rich fibrin，PRF）和脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM）在臨床上應(yīng)用較多，但目前兩種修復(fù)材料增量技術(shù)比較相關(guān)研究較少［3］。本實(shí)驗(yàn)主要探討PRF 和ADM 對口腔黏膜缺損的修復(fù)效果，為生物膜性材料在口腔種植中的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

3 月齡健康雄性日本大耳白兔36 只，體重2.74～3.08 kg，由太原市小店區(qū)豐澤園種養(yǎng)農(nóng)民專業(yè)合作社提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（晉）2015?0003。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動物分為4 組，每組9 只；分別為PRF 組，ADM 組，Autograft 組（自體結(jié)締組織移植組）及Control 組（空白對照組）。本研究已獲得山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 PRF 及ADM 的獲取

對PRF 組9 只兔子在耳中動脈處連接真空采血管，采血量為5 mL，以3 000 rpm 轉(zhuǎn)速離心10 min。靜置后，取出并修剪PRF 凝膠，最后用紗布擠壓法除去PRF 凝膠中的水分，塑形成PRF 膜。ADM 組采用吉特瑞?醫(yī)用膠原修復(fù)膜，修剪為直徑10 mm 的圓形膜。

1.4 制備10 mm 黏膜缺損模型以及缺損平均厚度的測定

術(shù)前8 h 對實(shí)驗(yàn)動物禁飲食，使用苯巴比妥鈉（100 mg/kg）經(jīng)腹腔注射實(shí)施麻醉，待麻醉后固定于兔臺。1%碘伏消毒，鋪單，拉開口角，暴露硬腭。在距上頜門齒8 mm 的硬腭區(qū)中央位置，用直徑為10 mm 環(huán)形切取器制備黏膜缺損，去除黏骨膜瓣形成圓形缺損區(qū)（圖1a），暴露骨面。PRF 組用4?0 絲線將對應(yīng)的PRF 間斷縫合于各自的黏膜缺損處；ADM 組用4?0 絲線將直徑10 mm 的ADM間斷縫合于各自的黏膜缺損處；Autograft 組在術(shù)區(qū)后方2.5 mm 處開辟第二術(shù)區(qū)，用10 mm 環(huán)形切取器取結(jié)締組織瓣，修剪后間斷縫合于各自的黏膜缺損處，第二術(shù)區(qū)紗布壓迫30 min 止血；Control 組黏膜缺損處使用紗布壓迫30 min 止血。術(shù)前1 h和術(shù)后連續(xù)3 d 肌肉注射青霉素鈉（100 000 U/kg），1 次/d，預(yù)防感染。游標(biāo)卡尺測量在建模時(shí)切取下的硬腭黏膜中心及外側(cè)，取平均值作為各組的硬腭黏膜厚度（圖1b）。

Figure 1 Preparation of 10 mm mucosal defect model and measurement of mucosal defect thickness圖1 制備10 mm 黏膜缺損模型及測量黏膜缺損厚度

1.5 效果評價(jià)

1.5.1 創(chuàng)面愈合率的測定 術(shù)后7、14、21 d 將四組的實(shí)驗(yàn)兔麻醉后肉眼觀察創(chuàng)面愈合情況并拍照記錄。觀察完畢后各組隨機(jī)處死3 只，利用牙周探針給定標(biāo)準(zhǔn)長度，單反相機(jī)垂直與組織創(chuàng)面進(jìn)行拍攝。ImagePlus 6.0 軟件測量愈合率。R＝（S初-S末）÷S初。R 為愈合率，S初為初始創(chuàng)面面積，S末為未愈合的創(chuàng)面面積。創(chuàng)面愈合區(qū)組織標(biāo)本行石蠟包埋切片。

1.5.2 炎癥等級的評分 在100 倍及400 倍顯微鏡下觀察各組織HE 切片組織，并給予炎癥等級評分測定。0 分：無炎癥，或有散在炎細(xì)胞；1 分：少量（＜30%）炎細(xì)胞浸潤；2 分：介于1 和3 分之間；3 分：大量（＞60%）炎細(xì)胞浸潤。具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 炎癥分級評分標(biāo)準(zhǔn)［4］Table 1 Inflammation grading score criteria［4］

1.5.3 上皮平均厚度測定 在100 倍顯微鏡下采集各組織HE 切片組織的5 幅圖像。每張圖像在10 個(gè)不同部位用Imageplus6.0 軟件測量上皮厚度，得到平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 24.0 軟件，對所有檢測指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)表示，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。炎癥等級評分采用Kruskal?Wallis 檢驗(yàn)和Mann?Whitney U 檢驗(yàn)；愈合率、上皮平均厚度采用單因素方差分析和析因設(shè)計(jì)方差分析；若總體方差齊，用Bonferroni 檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較；若總體方差不齊，則采用Games?Howell 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 黏膜缺損平均厚度

PRF 組黏膜缺損平均厚度為（2.28±0.29）mm，ADM 組為（2.21 ± 0.53）mm，Autograft 組為（2.18 ±0.16）mm，Control 組為（2.26 ± 0.20）mm；經(jīng)SNK 檢驗(yàn)，F(xiàn)＝0.13，P＝0.93，各組黏膜缺損平均厚度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 創(chuàng)面愈合率

經(jīng)Bonferroni 校正的多重比較結(jié)果顯示：①PRF 組、ADM 組與Autograft 組各時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率均高于Control 組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；②PRF 組與ADM 組在各時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率比較無顯著差異（P＞0.05）；③PRF 組、ADM 組在各時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率均低于Autograft 組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PRF 組：P7d＜0.001，P14d＜0.001，P21d＜0.001；ADM 組：P7d＜0.001，P14d＜0.001，P21d＜0.001）。見表2、圖2。

2.3 HE 染色結(jié)果

將建模時(shí)切取的硬腭黏膜做HE 染色，能在顯微鏡下看到硬腭黏膜的全部組織結(jié)構(gòu)，可以認(rèn)為缺損處無黏骨膜附著，完整切取了硬腭黏骨膜，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 各組創(chuàng)面愈合率比較Table 2 Comparison of wound healing rate in each group±s，n=3

表2 各組創(chuàng)面愈合率比較Table 2 Comparison of wound healing rate in each group±s，n=3

#：compared with Control group，P ＜0.05；*：compared with Autograft group，P ＜0.05；△：compared with ADM group，P ＜0.05；PRF：platelet rich fibrin；ADM：acellular dermal matrix；Autograft：autolo?gous connective tissue transplantation;Control:blank control

Group PRF ADM Autograft Control FP Wound healing rate（%）7 d 66.13±2.36#*64.43±2.85*#89.06±3.80#△29.63±2.31 215.047＜0.001 14 d 87.63±2.20#*86.56±1.13*#99.16±0.76#△65.23±2.90 158.569＜0.001 21 d 97.06±0.73#*95.40±1.21*#99.83±0.28#△89.03±1.38 62.636＜0.001

術(shù)后7 d：Control 組可見組織內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，組織結(jié)構(gòu)紊亂，新生血管較少；其余三組細(xì)胞開始修復(fù)，可見結(jié)締組織增值，可見新生毛細(xì)血管，炎性細(xì)胞數(shù)量較Control 組少；ADM 組結(jié)締組織排列更為規(guī)則、致密（與ADM 本身的結(jié)締組織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)系）；Autograft 仍有上皮釘突存在。術(shù)后14 d：Control 組上皮開始修復(fù)，但多處組織仍有大量炎性細(xì)胞浸潤；Autograft 組上皮呈現(xiàn)完整連續(xù)狀態(tài)；PRF 組與ADM 組仍有新生肉芽組織向表面生長，上皮不完全連續(xù)，且ADM 組上皮與PRF 組相比較厚。術(shù)后21 d：Control 組炎癥減輕，其余三組上皮完整，且厚度基本一致。見圖3。

Figure 2 Wound healing of hard palate mucosal defects in each group圖2 各組硬腭黏膜缺損術(shù)后創(chuàng)面愈合情況

2.4 炎癥等級評分

Bonferroni 校正的Mann?Whitney U 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，①PRF 組、ADM 組、Autograft 組分別與Control 組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的炎癥等級評分比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；②PRF 組、ADM 組與Auto?graft 組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的炎癥等級評分兩兩之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.5 上皮厚度

Figure 3 HE staining of hard palate mucosa in each group after operation圖3 各組硬腭黏膜術(shù)后HE 染色

表3 各組炎癥等級評分Table 3 Inflammation grade score of each group n=3

經(jīng)Bonferroni 校正的多重比較結(jié)果顯示：①PRF 組、ADM 組與Autograft 組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的上皮厚度均比Control 組高（P＜0.05）；②ADM 組在術(shù)后7、14 d 的上皮厚度比PRF 組高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P7d＜0.001，P14d＜0.001）；③ADM 組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的上皮厚度與Autograft 組相比無顯著差異（P＞0.05）；④PRF 組在術(shù)后7、14 d 的上皮厚度均低于Autograft 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P7d＜0.001，P14d＜0.001）。見表4。

表4 各組術(shù)后上皮厚度比較Table 4 Comparison of postoperative epithelial thickness in each group ±s，n=3

表4 各組術(shù)后上皮厚度比較Table 4 Comparison of postoperative epithelial thickness in each group ±s，n=3

#：compared with Control group，P ＜0.05；*：compared with Auto?graft group，P ＜0.05；△：compared with ADM group，P ＜0.05；PRF：platelet rich fibrin；ADM：acellular dermal matrix；Autograft：autologous connective tissue transplantation;Control:blank control

Group PRF ADM Autograft Control FP Epithelial thickness（μm）7 d 129.33±17.84#*△189.77±7.13#192.60±10.93#0 154.58＜0.001 14 d 221.20±18.31#*△292.10±20.09#316.30±21.51#129.37±14.43 59.96＜0.001 21 d 278.13±8.29#280.67±6.45#291.33±1.65#232.07±10.00 38.68＜0.001

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)選擇兔作為實(shí)驗(yàn)對象，主要考慮以下原因：①兔硬腭咀嚼黏膜相對充足，且組織學(xué)結(jié)構(gòu)與人的口腔黏膜類似；②對于兔來說10 mL 采血量被認(rèn)為是安全可行的，滿足本次實(shí)驗(yàn)制備PRF 的采血要求。對實(shí)驗(yàn)動物制備軟組織缺損目前國內(nèi)外無明確統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用10 mm 的標(biāo)準(zhǔn)化器械，可認(rèn)為是具有科學(xué)性、重復(fù)性、可靠性、標(biāo)準(zhǔn)化口腔軟組織缺損動物模型，符合實(shí)驗(yàn)的條件，可以保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行［5］。

PRF 是以富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）為基礎(chǔ)研制的新一代血小板濃縮制品，是自體全血離心的產(chǎn)物，被認(rèn)為是一種自體移植物［6］。收集自體血立即3 000 rpm 離心10 min，可得到去血小板血漿、PRF 凝膠和紅細(xì)胞碎片，其分別位于離心管的上、中、下層；制備過程不添加抗凝劑和外部化學(xué)物質(zhì)。PRF 疏松的結(jié)構(gòu)能夠容納大量的血小板及生長因子，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor?β，TGF?β）和血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）等。在這些生長因子的作用下，軟組織愈合和成熟的三個(gè)關(guān)鍵步驟（血管生成、免疫和上皮覆蓋）可以被同時(shí)支持，從而大大加快軟組織的愈合［7］，因PRF 的以上特性，其被應(yīng)用于眾多領(lǐng)域中。在外科手術(shù)中，PRF 的應(yīng)用可加速愈合，減少不良反應(yīng)并改善預(yù)后［8］。PRF 被證實(shí)可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和創(chuàng)面愈合［9］。在口腔醫(yī)學(xué)中，PRF 已被證實(shí)能夠促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞的黏附、遷移及增殖，還能在愈合過程中高效地表達(dá)I 型膠原蛋白［10］。近些年來，隨著對PRF 制備流程的改良，又成功制取出了i?PRF（injectable platelet rich fibrin，i?PRF）等基于PRF 的衍生物，其可以更加有效且長期的釋放生長因子，進(jìn)一步加快了軟組織的愈合［11］。

ADM 是通過特殊處理，去除了所有細(xì)胞成分的一種組織移植物。由于這些機(jī)械加工的生物支架能快速結(jié)合到生物組織中，因此被廣泛應(yīng)用于各種外科手術(shù)中，且已被提議作為治療口腔黏膜創(chuàng)傷的一種方法。ADM 處理過程為去除含角蛋白的表皮后，處理真皮層以去除所有的脫氧核糖核酸，而不破壞膠原基質(zhì)，故ADM 具有充分的空間供宿主細(xì)胞浸潤、促進(jìn)新生血管形成和加速上皮形成［12］。Xu 等［13］的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ADM 對于兔硬腭軟組織缺損可刺激輕微的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)出快速的上皮化和血管重建，并伴有VEGF 和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transporter type 1，GLUT1）的增加，促進(jìn)缺損部位的組織生長。無論是在牙周整形或是口腔種植手術(shù)中，ADM 都顯示出了與結(jié)締組織移植物（connective tissue graft，CTG）相當(dāng)?shù)难例l退縮減少和軟組織厚度增加，而且能獲得與CTG 相同的舒適度［14］。目前國外對ADM 的使用較為廣泛，應(yīng)用于眾多領(lǐng)域，如外科、乳腺外科、燒傷整形科等；在口腔治療中應(yīng)用于頜面外科、牙周科、口腔種植科等。然而在國內(nèi)，ADM 仍未被廣泛使用，在口腔治療中僅被應(yīng)用于牙周手術(shù)，充當(dāng)上皮下結(jié)締組織瓣［15］。

在本實(shí)驗(yàn)中，筆者比較了ADM、PRF 和自體結(jié)締組織移植物對黏膜缺損的修復(fù)效果，結(jié)果顯示，與PRF 相比，ADM 在術(shù)后2 周以內(nèi)的上皮厚度增量方面更具有優(yōu)勢，但在3 周后，PRF 與ADM 的上皮厚度增量效果無顯著差異。ADM 對上皮厚度增量的影響主要涉及以下機(jī)制：①ADM 具有的纖維三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠起調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)、促進(jìn)作用，為宿主成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等的和增生提供網(wǎng)狀空間，局部形成新生血管和上皮，容納并支撐細(xì)胞的生長；②PRF 降解期為2～3 周，而ADM 在體內(nèi)可存在數(shù)月，更有利于萎縮組織的再生，更適合應(yīng)用于牙周科對于牙齦退縮的治療；③ADM 可以和人體結(jié)締組織實(shí)現(xiàn)整合，有利于ADM 的固定。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ADM 可以獲得與CTG 接近的軟組織增量效果。但是ADM 仍然存在不足之處：①雖然有證據(jù)表明ADM 移植可以取得與CTG相似的結(jié)果［16］，但是最近的一項(xiàng)長達(dá)15 年的臨床研究結(jié)果顯示，盡管ADM 長期的美學(xué)效果較優(yōu)，但效果并不如結(jié)締組織移植物穩(wěn)定，存在少量的組織萎縮［17］；②在創(chuàng)面愈合初期，ADM 組與血液提取物組相比CD68 陽性細(xì)胞較少，且CD31 染色顯示創(chuàng)口邊緣處新生血管較少［18］；③ADM 組與宿主自生的結(jié)締組織仍有差異，在ADM 內(nèi)可觀察到毛細(xì)血管和小血管［19］；④ADM 很難完全去除所有細(xì)胞殘余物。隨著技術(shù)的不斷改善，新的方法不斷應(yīng)用到ADM 的制備中，ADM 的安全性在不斷提高，但其仍有疾病傳播的理論風(fēng)險(xiǎn)，這是所有異體移植制劑都存在的問題。

【Author contributions】Wang CY performed the experiments and wrote the article. Fan YW designed the study and reviewed the article.Wang J directed the data collection and analysis. All authors read and approved the final manuscript as submitted.