劉建華 宋鳳鳴 袁小康 劉登彪 肖鵬發(fā) 曾偉民

（1. 湖南高嶺環(huán)保科技有限公司，湖南長沙 410153；2. 中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，湖南長沙 410083）

1 引言

采礦產(chǎn)生的尾砂通常殘留大量的重金屬并以多種形態(tài)存在，尾砂庫養(yǎng)分含量低、保水能力差，在沒有客土等輔助措施時(shí)，人工造林容易出現(xiàn)成活率低、植物易退化等現(xiàn)象［1］，已成為尾礦區(qū)生態(tài)修復(fù)的重要難題。尾礦地存在少量重金屬耐受和富集植物，這些植物及根際微生物越來越多地被研究和應(yīng)用在尾礦生態(tài)修復(fù)中。張崇邦、陳友靜、楊靜丹等［2-5］研究得出五節(jié)芒定居可顯著提高尾礦砂微生物群落多樣性、土壤微生物生物量、呼吸速率及酶活性，提高了結(jié)合態(tài)重金屬的含量，降低了陽離子交換態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)重金屬含量。吳照祥等［6］利用高通量測(cè)序研究了胡枝子復(fù)墾對(duì)江西省德興銅礦1 號(hào)尾砂庫微生物的影響，胡枝子復(fù)墾改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、功能組成以及微生物多樣性，顯著提升了信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞通信等功能基因豐度。

木賊（Equisetum hyemale L.）是典型的重金屬耐受性和指示植物，同時(shí)也是鉛鋅尾礦廢棄地自然恢復(fù)過程中常見的先鋒植物［7］。本文通過對(duì)鉛鋅尾礦區(qū)尾礦裸地和木賊定居自然恢復(fù)地土壤微生物群落進(jìn)行研究，并分析木賊定居對(duì)尾礦土壤成分和微生物多樣性的影響，以期為尾礦區(qū)生態(tài)修復(fù)提供理論參考。

2 材料與方法

2.1 研究區(qū)概況

實(shí)驗(yàn)尾砂庫位于湖南省郴州柿竹園柴山尾砂庫（113°09′E，25°47′N），靠近東河。該地區(qū)屬于中亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，年降水量一般為125～1 700 mm，無霜期長，較利于植物生長。

2.2 土壤取樣

分別在尾礦裸地和木賊定居自然恢復(fù)區(qū)域隨機(jī)選擇多個(gè)1 m×1 m 樣方，用直徑為4 cm 的土鉆按五點(diǎn)取樣法采集0～20 cm 土層，用無菌袋帶回實(shí)驗(yàn)室，用滅菌工具去除土樣中的植物和動(dòng)物殘?bào)w等雜質(zhì)，將2 種土樣的多個(gè)樣品混合成1 個(gè)樣品置于無菌離心管中，尾礦裸地土壤樣品命名為szy1，植被恢復(fù)尾礦地樣品命名為szy2。采樣后隔天即取少量土樣進(jìn)行DNA 提取，以減小環(huán)境變化對(duì)微生物群落的影響。另一部分土樣風(fēng)干、磨細(xì)過100 目篩和1 mm篩，用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)。

2.3 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

參考相關(guān)文獻(xiàn)［8-10］的方法，對(duì)2.2 土樣進(jìn)行基因組DNA 抽提和PCR 擴(kuò)增。真菌采用通用引物ITS1F/ITS2R（5′-CGTAGGTGAACCT-GCGGAAGGATC-3′），（5′-GTTCAGCGGGT-GATCCTGCCTG-3′）擴(kuò)增，細(xì)菌采用通用引物515F/907R（515F：5′-GTGCCAGCM GCCGCGG-3′；907R：5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序委托上海凌恩生物科技有限公司完成。

2.4 理化性質(zhì)測(cè)定

參考相關(guān)文獻(xiàn)［11］，對(duì)2.2 中風(fēng)干過篩土壤進(jìn)行有機(jī)質(zhì)、全N、全P、全K、全Pb、全Zn、全Cu、全Cd、DTPA-Pb、DTPA-Cd 含量測(cè)定。

2.5 數(shù)據(jù)處理及分析

基于Qiime 平臺(tái)，采用RDP classifier 貝葉斯算法，對(duì)97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在各分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。細(xì)菌比對(duì)采用Silva 數(shù)據(jù)庫，真菌比對(duì)使用Unite 數(shù)據(jù)庫，置信度閾值為0.7。

采用SPSS 軟件數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 尾礦庫尾砂基本理化性質(zhì)

實(shí)驗(yàn)尾礦庫尾砂基本理化性質(zhì)見表1。尾砂有機(jī)質(zhì)、全N、全P 整體均處于較低含量水平，木賊群落根際土壤有機(jī)質(zhì)、全N 含量顯著高于無植被尾礦裸地，尾礦裸地全Pb、全Zn、全Cu、全Cd、DTPA-Pb、DTPA-Cd 均顯著高于木賊群落根際土壤。重金屬指標(biāo)中Pb，Cd，DTPA-Pb，DTPA-Cd 含量均超過《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 15618—1995）三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（保障農(nóng)林生產(chǎn)和植物正常生長的土壤臨界值），其余指標(biāo)均符合三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

表1 實(shí)驗(yàn)尾礦庫尾砂基本理化性質(zhì)

3.2 不同類型尾礦地土壤真菌多樣性

3.2.1 不同類型尾礦地土壤真菌多樣性指數(shù)分析

2 個(gè)樣本分別獲得38 761，40 952 個(gè)真菌序列。對(duì)多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，見表2。OTU 分布顯示，木賊根際土壤樣品szy2 獲得325 個(gè)真菌OTU，而無植物尾礦砂樣品szy1 僅獲得70 個(gè)OTU，其中共有OTU 為35 個(gè)。ace，Chao 指數(shù)與OTU 基本一致。尾礦裸地樣本szy1 的真菌shannon 指數(shù)較szy2 小，simpson 指數(shù)相對(duì)較高，因此尾礦裸地真菌多樣性相對(duì)較低。

表2 樣本真菌多樣性

3.2.2 不同類型尾礦地土壤真菌序列分析

從門的多樣性來看，子囊菌、未明確分類真菌和擔(dān)子菌是鉛鋅尾礦地土壤的優(yōu)勢(shì)真菌。樣本真菌ITS序列分析見表3。Fungi-Unclassified 在2 個(gè)樣本中分別占9.84%，11.10%。子囊菌門（Ascomycota）在尾礦裸地和植被恢復(fù)尾礦地的土壤真菌中的豐度較接近，分別為79.81%，79.29%。其中，szy1 子囊菌門主要集中在散囊菌綱、座囊菌綱，豐度分別為38.65%，32.84%，而szy2 子囊菌門主要集中在糞殼菌綱（55.10%）。擔(dān)子菌門（Basidiomycota）則在樣本szy1 豐度較大（8.05%），szy1 擔(dān)子菌門集中在銀耳綱（Tremellomycetes，3.90%），szy2 擔(dān)子菌門集中在傘菌綱（Agaricomycetes，4.92%）。未明確分類真菌（Fungi-Unclassified）在樣本szy2 豐度（11.10%）大于szy1（9.84%），接合菌門（Zygomycota）在szy2 中豐度較大（3.55%），主要為Mortierellomycotina。球囊菌門（Glomeromycota）主要為共生叢枝菌根真菌，僅出現(xiàn)在樣本szy2 中，豐度為0.12%。

表3 樣本真菌ITS 序列分析

從科屬的多樣性來看，樣本szy1 的真菌主要分布在26 個(gè)科47 個(gè)屬，樣本szy2 的真菌分布在92 個(gè)科179 個(gè)屬。2 個(gè)樣本的屬水平多樣性分析見圖1。2 個(gè)樣本豐度大于1%的屬各有14 個(gè)，其中曲霉屬（Aspergillus）、側(cè)孢霉屬（Calcarisporiella）、被孢霉屬（Mortierella）為2 個(gè)樣本中共有的優(yōu)勢(shì)屬，Ascomycota-Unclassified，Lasiodiplodia，Meripilus，Arthrobotrys，Trichoderma，Didymella，Paramyrothecium僅存在于szy2 樣本。Alternaria（29.14%），Amorp hotheca（27.71%），Aspergillus（7.93%）為樣本szy1 中主要優(yōu)勢(shì)真菌，F(xiàn)usarium（33.53%）、Chaetomiaceae-Unclassified（11.40%）、Calcarisporiella（6.74%）為 樣本szy2 中主要優(yōu)勢(shì)真菌。

圖1 微生物群落

木賊定居對(duì)尾礦砂真菌屬水平分布影響較大。樣本szy1 中豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)屬如Alternaria，Amorphotheca，F(xiàn)ungi-Unclassified，Aspergillus，Guehomyces，Serendipita，Gibellulopsis，Trichocomaceae-Unclassified，Penicillium，Cladosporium，Curvularia，Pleosporales-Unclassified 等在szy2 中豐度均顯著下 降， 而 Fusarium，Chaetomiaceae -Unclassified，F(xiàn)ungi-Unclassified， Calcarisporiella，Ascomycota-Unclassified，Mortierella，Lasiodiplodia，Meripilus，Nectriaceae -Unclassified，Arthrobotrys，Trichoderma，Didymella，Paramyrothecium 等在樣本szy2 中豐度顯著升高。樣本szy2 中球囊菌門叢枝菌根真菌主要為內(nèi)養(yǎng)囊霉屬（Entrophospora），豐度為0.11%。

3.3 不同類型尾礦地土壤細(xì)菌多樣性

3.3.1 不同類型尾礦地土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)分析

細(xì)菌的OTU 分布顯示，2 個(gè)樣本獲得556，989個(gè)OTU，其中共有OTU 為464 個(gè)。在覆蓋率大于97%的情況下，樣本szy2 的OTU 數(shù)、shannon 指數(shù)高于樣本szy1。simpson 指數(shù)低于樣本szy1，表明樣本szy2 細(xì)菌多樣性相對(duì)較高，見表4。

表4 樣本細(xì)菌多樣性

3.3.2 不同類型尾礦地土壤細(xì)菌序列分析

從門的多樣性來看，樣本szy1 細(xì)菌分布于23個(gè)門，樣本szy2 分布于25 個(gè)門。除Nitrospinae，Bacteria-norank 僅分布于szy2 外，其他門在2 個(gè)樣本中均有分布。變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）是研究區(qū)土壤中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群，在2 個(gè)樣本中合計(jì)均占60%以上豐度。樣本細(xì)菌16S rDNA 序列分析見表5。Gammaproteobacteria 在szy1 中豐度高于szy2，而Alphaproteobacteria，Betaproteobacteria，Deltaproteobacteria 在szy2 中豐度較高。厚壁菌中Bacilli 在szy1 中豐度較大，Clostridia 在szy2 中豐度較大。厚壁菌門（23.93%）、浮霉?fàn)罹T（3.29%）、硝化螺旋菌門（1.97%）、疣微菌門（1.23%）、廣古菌門（1.43%）等在樣本szy1 中的優(yōu)勢(shì)菌屬在szy2 中豐度下降，而樣本szy2 中綠彎菌門（7.55%）、擬桿菌門（7.49%）、放線菌門（7.32%）、芽單胞菌門（5.71%）、酸桿菌門（4.11%）菌屬豐度較szy1 有大幅升高。

表5 樣本細(xì)菌16S rDNA 序列分析

從科屬的多樣性來看，樣本szy1 的細(xì)菌主要分布于152 個(gè)科、308 個(gè)屬；樣本szy2 的細(xì)菌主要分布于164 個(gè)科、318 個(gè)屬。2 個(gè)樣本的屬相對(duì)豐度分布見圖2。樣本szy1，szy2 分別有25，27個(gè)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)屬，除Bellilinea（2.77%）僅分布在樣本szy2 外，其他屬在2 個(gè)樣本中均有分布。共有優(yōu)勢(shì)屬包括Lactococcus，Bacillus，Gemmatimonas，Sulfuricaulis，Dongia，Sulfurifustis，Azoarcus，Nitrospira，Burkholderia，Acidobacterium，Acidithiobacillus，Pelobacter，Holophaga 等。szy1 中豐度大于5%的優(yōu)勢(shì)屬包括Lactococcus（10.93%）、Sulfuricaulis（7.69%）、Bacillus（6.83%）、Serratia（5.44%），而szy2 中豐度大于5%的優(yōu)勢(shì)屬僅有Gemmatimonas（5.70%）?？梢姌颖緎zy1 中菌屬的豐度比例相對(duì)集中，樣本szy2 細(xì)菌的屬水平分布相對(duì)均衡，樣本szy2 細(xì)菌多樣性相對(duì)較高。

圖2 細(xì)菌群落

木賊定居對(duì)細(xì)菌屬水平分布影響較大，如樣本szy1 和szy2 中優(yōu)勢(shì)硫細(xì)菌屬分別為Sulfuricaulis（7.69%）和Sulfurifustis（3.64%）。Lactococcus，Sulfuricaulis，Bacillus，Serratia，Dongia，Methylobacillus，Planctomyces，Nitrospira，Burkholderia，Xanthomonas，Solirubrobacter，Skermanella，Acidithiobacillus，Holophaga，Methanobacterium，Streptococcus，Sporomusa，Pseudomonas，Ohtaekwangia 等 在 樣 本szy1 中 豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)屬在樣本szy2 中豐度顯著降 低， 而Gemmatimonas，Sulfurifustis，Azoarcus，Pelobacter，Bellilinea，Acidobacterium，Sphingomonas，Chitinophaga，Massilia，Sphingobacterium，Sacchariba -cillus， Anaeromyxobacter， Chloroflexus， Stella，Bdellovibrio，Steroidobacter，Geobacter，Cytophaga 在樣本szy2 中豐度升高。

3.4 微生物多樣性影響因素分析

從Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果來看，pH 與真菌和細(xì)菌ace，shannon 指數(shù)無顯著相關(guān)性，見表6。有機(jī)質(zhì)、全N 與真菌和細(xì)菌ace，shannon 指數(shù)在0.01水平顯著相關(guān)。全Zn、全Cu、全Cd、DTPA-Pb、DTPA-Cd 與真菌和細(xì)菌ace，shannon 指數(shù)在0.01水平顯著相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)均為負(fù)值；全Pb 與真菌shannon 指數(shù)和細(xì)菌Chao 在0.01 水平顯著負(fù)相關(guān)，與真菌Chao、細(xì)菌shannon 指數(shù)在0.05 水平顯著相關(guān)。

表6 微生物多樣性指數(shù)與土壤成分相關(guān)性分析

4 討論

木賊定居對(duì)尾礦砂真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大，顯著提高了真菌多樣性。木賊根際土壤中散囊菌綱、座囊菌綱豐度較尾礦裸地下降，而糞殼菌綱豐度增加，故木賊定居導(dǎo)致土壤中植物病原菌豐度上升。但糞殼菌綱中Fusarium 等優(yōu)勢(shì)真菌同時(shí)也是木質(zhì)素和纖維素降解菌，故這些優(yōu)勢(shì)真菌對(duì)植物枯落物的分解同時(shí)也有利于土壤有機(jī)質(zhì)含量增 加。Alternaria，Aspergillus，F(xiàn)usarium，Mortierella，Penicillium，Cladosporium 等尾礦砂優(yōu)勢(shì)真菌均為重金屬耐性真菌，與多數(shù)研究結(jié)論［12-14］一致。Amorphotheca，Calcarisporiella，Chaetomiaceae-Unclassified等雖尚未有研究證明為重金屬耐性真菌，但其能適應(yīng)超標(biāo)鉛鎘離子脅迫環(huán)境，表明對(duì)鉛鎘存在一定耐受性。

木賊定居同樣提高了尾礦砂細(xì)菌多樣性，但Lactococcus，Bacillus，Gemmatimonas，Sulfuricaulis，Dongia，Sulfurifustis，Azoarcus，Nitrospira 等仍是尾礦地優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，表明這些菌群對(duì)鉛、鎘有一定耐性，與研究結(jié)論［15-17］一致。樣本優(yōu)勢(shì)菌中均存在硫氧化菌（Sulfur-Oxidizing Prokaryotes，SOP），這類細(xì)菌可通過生物氧化與產(chǎn)酸作用將難溶性的重金屬從固相溶出而成為可溶性的金屬離子［18］，導(dǎo)致重金屬DTPA提取態(tài)含量上升。Sulfuricaulis，Sulfurifustis 等SOP在2個(gè)樣本中分別占9.34%，5.00%，Thiobacillus，Thiobacters 等各占1.45%，1.43%，與木賊定植區(qū)域重金屬DTPA 值更低的實(shí)際情況一致。異化金屬還原菌（Dissimilatory Metal Reduction Bacteria，DMRB）和參與脫硫反應(yīng)的硫酸鹽還原菌（Sulfate-Reducing Prokaryotes，SRP）可有效固化尾礦重金屬［18-19］，Geobacter，Pelobacter，Anaeromyxobacter 等DMRB 豐度 在 szy2 中 增 大，Desulfobulbus，Desulfofrigus，Desulfuromonas 等SRP 在szy2 中的總豐度（0.437%）高于szy1（0.396%），與木賊定植區(qū)域重金屬總量更低的實(shí)際情況一致。

細(xì)菌多樣性變化還反映出木賊定居對(duì)土壤氮循環(huán)的顯著影響。固氮弧菌Azoarcus 在樣本szy1 中豐度為1.82%，在szy2 中的豐度增加至3.03%。而Bradyrhizobium，Rhizobium，Azorhizobium，Mesorhizobium 等主要根瘤菌屬總豐度則從樣本szy1 的0.38%升高至樣本szy2 中的1.51%。硝化細(xì)菌Nitrospira 則反之，豐度從樣本szy1 中1.96%降低至szy2 中1.08%。具反硝化能力的Lactococcus，Serratia，Methylobacillus，Planctomyces，Pseudomonas 等［20］szy1 的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌同樣在szy2 中豐度顯著降低，表明木賊定居尾礦促進(jìn)了固氮微生物繁殖、抑制硝化和反硝化作用，有利于生物固氮和降低土壤氮素?fù)p失。

木賊作為先鋒植物能在尾礦定居并逐漸擴(kuò)大種群，主要依靠孢子傳播和分蘗進(jìn)行繁衍，而重金屬離子對(duì)多數(shù)蕨類孢子萌發(fā)及配子體發(fā)育有不良影響［21-22］，故Entrophospora，Azoarcus 等植物共生菌可能在木賊定植前期孢子萌發(fā)、配子體發(fā)育和幼苗耐受污染中起作用。許多根際微生物均可進(jìn)入植物體成為內(nèi)生菌，謝霞研究了Bacillus，Sphingomonas，Staphylococcus 屬多株龍葵內(nèi)生菌對(duì)銅鋅的生物淋洗效應(yīng)［23］，驗(yàn)證了內(nèi)生菌與根際菌有著相同的重金屬修復(fù)機(jī)制。木賊植株內(nèi)是否存在與根際細(xì)菌類似的內(nèi)生菌，是否對(duì)木賊對(duì)重金屬的強(qiáng)耐受性以及囤積重金屬有影響，尚有待進(jìn)一步研究。

環(huán)境因子與微生物多樣性相關(guān)性分析顯示，有機(jī)質(zhì)、全N 與微生物數(shù)量及多樣性顯著相關(guān)，重金屬含量與微生物數(shù)量及多樣性顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，與多數(shù)研究結(jié)論一致［24-25］，表明有機(jī)質(zhì)和全N 含量與微生物數(shù)量及多樣性可相互促進(jìn)和協(xié)同發(fā)展，高重金屬含量會(huì)對(duì)微生物數(shù)量和多樣性產(chǎn)生抑制，同時(shí)微生物多樣性的增長有利于重金屬含量降低。故在尾礦生態(tài)修復(fù)實(shí)踐中，應(yīng)對(duì)尾礦砂進(jìn)行改良，補(bǔ)充有機(jī)質(zhì)和氮素營養(yǎng)，提高土壤微生物數(shù)量和多樣性，也可引入重金屬鈍化功能微生物菌劑，接種叢枝菌根真菌、共生固氮菌等，降低脅迫和提高植物對(duì)重金屬的耐受性。同時(shí)，人工植被恢復(fù)中可多引入木賊等鄉(xiāng)土草本先鋒植物，推行草本先行、灌草結(jié)合和人工修復(fù)與自然演替相結(jié)合的恢復(fù)模式。

5 結(jié)論

（1）子囊菌、未明確分類真菌和擔(dān)子菌是鉛鋅尾礦地土壤的優(yōu)勢(shì)真菌。木賊定居導(dǎo)致散囊菌綱、座囊菌綱豐度下降，糞殼菌綱豐度增加。Alternaria，Amorphotheca，Aspergillus 為尾礦裸地中主要優(yōu)勢(shì)真菌，F(xiàn)usarium，Chaetomiaceae-Unclassified，Calcarisporiella 為木賊根際土壤主要優(yōu)勢(shì)真菌。

（2）木賊定居改變了尾礦砂細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性。變形菌門、厚壁菌門、放線菌門是研究區(qū)土壤中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群，Lactococcus，Bacillus，Gemmatimonas，Sulfuricaulis，Dongia，Sulfurifustis，Azoarcus，Nitrospira 等是尾礦地優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。

（3）有機(jī)質(zhì)、全N 與真菌和細(xì)菌ace，shannon 指數(shù)顯著相關(guān)，重金屬含量與真菌和細(xì)菌ace，shannon指數(shù)顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。木賊定居提高了尾礦砂中微生物的種類和多樣性，有利于有機(jī)質(zhì)和氮素營養(yǎng)成分的積累和降低重金屬含量；同時(shí)木賊根部可富集吸收土壤中游離態(tài)重金屬離子，木賊群落自然恢復(fù)發(fā)揮了較好的植物-微生物協(xié)同修復(fù)效應(yīng)。在尾礦生態(tài)修復(fù)實(shí)踐中可引入木賊等鄉(xiāng)土草本先鋒植物，同時(shí)補(bǔ)充有機(jī)質(zhì)和氮素營養(yǎng)，或引入功能微生物菌劑和接種植物共生菌等，強(qiáng)化生態(tài)修復(fù)效果。