程斯婷 趙以軍 廖明軍

（湖北工業(yè)大學資源與環(huán)境工程學院河湖生態(tài)修復及藻類利用湖北省重點實驗室，湖北武漢 430068）

1 引言

浮游細菌是水生態(tài)系統中的次級生產力，在浮游微生物食物網中扮演不可或缺的角色［1］。浮游病毒是水生態(tài)系統中最豐富的一種生物，能裂解宿主、控制宿主數量以及調節(jié)宿主的群落結構組成，介導基因的水平轉移，對于種群的遺傳物質、生態(tài)系統功能以及生物地球化學循環(huán)都有重要影響［2］。因此，對浮游細菌和病毒的準確快速計數對于研究水生生態(tài)學非常重要。目前，使用較多的計數方法有熒光顯微鏡計數法（EFM）和流式細胞儀計數法（FCM）等，前者對水樣保存條件要求簡單，可在-20 ℃保存2 周以上［3-4］，計數結果準確率較高，但是計數所需時間較長，效率相對較低；后者計數快速，準確性高，廣泛應用于生物細胞、浮游植物、細菌和病毒［5-8］。盡管FCM結果明顯，但樣品保藏不當極易造成計數結果誤差偏大，甚至造成結果偏低50%～80%［9］。目前FCM 計數樣品保藏多采用Brussaard 等人提出的方法［9］，即新鮮樣品添加終濃度為0.5%的戊二醛固定15～30 min 后，在液氮下速凍，然后放入-80 ℃冰箱長期保存。Brussaard 等人證實-80 ℃低溫保藏前的液氮速凍能夠保證所有被測樣品計數結果的穩(wěn)定性，但其結果也同時顯示在沒有液氮前處理的情況下，仍然有部分比例的樣品（3/7）經-80 ℃長期保藏而計數結果沒有明顯下降［9］。這提示適用于FCM 的病毒樣品保藏方法還有進一步細化探討的空間，不同環(huán)境來源的樣品所適用的保藏條件可進一步研究確定，特別是對于保藏條件受限的野外樣品而言，研究合適有效的保存條件對于確保實驗結果的可靠性至關重要。

本文以三峽水庫香溪河庫灣水樣為檢測對象，以EFM 為參照，研究了改變樣品保存溫度情況下利用FCM 計數浮游病毒和浮游細菌的可能性，為豐富淡水浮游微生物計數方法提供支持。

2 材料與方法

2.1 實驗材料與保存方法

2019 年2 月25 日至2019 年3 月19 日期間采集了香溪河庫灣的表層水樣（XK：110°47′32.4″E，31°07′21.3″N；SY：110°45′41.5″E，30°58′2.1″N；XY：110°46′3.4″E，30°57′36.1″N；00：110°46′25.9″E，30°58′43.1″N；01：110°46′26.5″E，31°00′4.6″N；02：110°45′44.6″E，31°01′29.7″N；03：110°45′41.5″E，31°03′19.3″N；04：110°45′43.1″E，31°03′32.9″N；06：110°47′26.5″E，31°08′2.6″N；07：110°46′50.3″E，31°09′23.6″N；08：110°46′54.9″E，31°10′12.1″N）。

樣品采集后添加戊二醛至終濃度為0.5%進行固定，并迅速放入-20 ℃暫存2 周，之后轉入-80 ℃長期保存，計數前將樣品于37 ℃下解凍。

2.2 主要儀器和試劑

儀器：生物顯微鏡（Leica DM4000B）；流式細胞儀（BD FACSCaliburTMFlow Cytometer）。

試劑：SYBR Gold、SYBR Green I、PBS、對苯二胺、甘油、Tris EDTA 緩沖液、鞘液。

2.3 方法

使用流式細胞儀對浮游細菌和病毒的計數操作方法如下［10］：由于流式細胞儀檢測樣品適宜豐度為105～106個/mL，檢測浮游細菌豐度的樣品可不經過稀釋，檢測浮游病毒豐度的樣品需適當稀釋。對于浮游細菌的檢測，黑暗下加入SYBR Green I 至終濃度為1 ∶100 00，在40 ℃的水浴鍋中避光加熱10 min，待冷卻至室溫時上樣于流式細胞儀中檢測。檢測浮游病毒時，用經過0.02 μm 過濾器的Tris EDTA 緩沖液（pH 約為8.0）對樣品進行稀釋（稀釋倍數為10 或50 倍），稀釋后添加SYBR Green I 至終濃度為1 ∶200 00，在水浴鍋中80 ℃下避光加熱10 min，待其冷卻至室溫時上樣檢測。

使用熒光顯微鏡對浮游細菌和病毒的計數操作方法如下［11］：取適當稀釋的樣品1 mL，加入熒光染料SYBR Gold（終濃度為0.25%），避光染色15 min后用孔徑為0.02 μm、直徑為13 mm 的氧化鋁濾膜（Whatman Anodisc）過濾，然后向濾膜上滴加1 滴抗褪色劑（1∶1 體積比甘油-PBS 溶液中添加0.1%質量含量對苯二胺配置而成），制片后在10×100 倍的油鏡下利用藍色激發(fā)光觀察，根據熒光強度、顆粒大小區(qū)分細菌與病毒，隨機計數5 個視野中不同顆粒的數量，計數結果取平均值后根據稀釋倍數、視野面積、過濾面積計算浮游細菌與病毒的豐度，計算公式如下：

式中，A 為浮游細菌或病毒的豐度，個/mL；n 為單個顯微視野中浮游細菌或病毒的平均數量，個；Sm為濾膜面積，mm2；Sf為顯微視野面積，mm2；d為計數樣品的稀釋倍數，倍。

2.4 數據處理與分析方法

采用SPSS V.21 統計分析軟件，針對樣品中浮游細菌與病毒豐度的EFM 和FCM 檢測數據，利用Wilcoxon signed-rank 檢驗方法來觀察2 種方法的計數有無差異，P＜0.05 時差異具有統計學意義。

3 結果

分別用熒光顯微鏡和流式細胞儀計數浮游細菌和病毒豐度，結果見表1。

表1 EFM 與FCM 計數浮游細菌和病毒豐度結果 個/mL

由表1 可知，EFM 與FCM 計數的浮游細菌豐度分別為（0.08～2.19）×106個/mL 和（0.16～4.10）×106個/mL，均值分別為（0.98±0.10）×106個/mL 和（0.85±0.13）×106個/mL；EFM 與FCM 計數的浮游病毒豐度分別為（0.13～3.04）×107個/mL 和（0.04～6.02）×107個/mL，均值分別為（1.09±0.16）×107個/mL 和（2.40±0.37）×107個/mL。

2 種方法對浮游細菌計數的Wilcoxon signedrank 檢驗結果中，Z=-1.842，P=0.065，認為FCM 與EFM 對于香溪河水樣中浮游細菌的計數差異無統計學意義；而對浮游病毒計數的Wilcoxon signed-rank檢驗結果中Z=-4.704，P=0.000，認為FCM 與EFM對于香溪河浮游病毒的計數差異具有統計學意義，表明用FCM 進行香溪河水樣中浮游病毒的計數結果比EFM 顯著偏高，具體見表2。

表2 EFM 與FCM 分別對浮游細菌和病毒計數的Wilcoxon 檢驗結果

利用Pearson 相關性分析可知，EFM 和FCM 法對病毒的計數結果具有極顯著正相關性（r=0.979，P＜0.01），見表3。

表3 EFM 與FCM 計數浮游病毒的Pearson 相關系數

4 討論

EFM 和FCM 用于計數香溪河樣品中浮游細菌豐度時結果相近，差異無統計學意義（P＞0.05）。2 種計數方法使用的染料對染色效率的差異影響不大，SYBR Green Ⅰ與SYBR Gold 染色效率大致相同［12］。有研究顯示，SYBR Green Ⅰ在FCM 中相比SYBR Gold 更具有優(yōu)勢，但在顯微鏡下長時間激發(fā)會在亮度和持續(xù)熒光方面有不利影響［4］。另外，多數細菌粒徑處于正常范圍內，熒光信號較強，易辨認，使2 種方法的計數細菌豐度結果沒有顯著差異。誤差存在的主要原因可能來源于操作者造成的差異［13］，因為天然水樣中浮游細菌群落較復雜，熒光顆粒大小與強弱的界限不夠明晰，存在部分粒徑較小熒光微弱的細菌顆粒，導致計數偏差，人為計數差異一般在5%～20%內［14］。

對香溪河樣品中浮游病毒計數時，EFM 和FCM計數的結果差異具有統計學意義，FCM 計數結果高于EFM（P＜0.01）。不同計數病毒的方法之間具有差異，通常有一種方法會產生較高病毒豐度的結果［15］。以往研究中檢測自然水體的病毒豐度會出現FCM計數相對EFM 偏高的結果，如Marie 等［16］對自然水體如地中海和太平洋水樣的病毒計數結果顯示，FCM 計數相較于EFM 計數高達1.5 倍；Chen 等［17］對沿海和湖泊水樣的病毒計數結果顯示，FCM 比EFM 計數高達1.3 倍。本研究中FCM 計數病毒豐度比EFM 高0.2～3.1 倍（平均值為2.0±0.1 倍），與上述研究基本接近，說明本研究中FCM 計數結果可信。FCM 計數病毒豐度顯著高于EFM，可從2 個角度解釋原因：一是在EFM 中利用顯微鏡照片計數時，由于病毒未處于完全相同的焦點平面下，可能會存在失焦的病毒不可見導致計數偏低［4］；二是FCM 計數中在添加染料SYBR Green I 后于80 ℃的高溫下加熱，熱處理可能會令病毒衣殼變性使染料滲透，染色的病毒百分比增加［16］。對FCM 和EFM 的病毒計數結果分析顯示，兩者具有強正相關性，表明FCM 能夠穩(wěn)定計數溫和冷凍香溪河庫灣樣品中的浮游病毒。

本研究中樣品采用溫和冷凍的方式保存，沒有用到液氮速凍，但FCM 計數結果并未出現病毒豐度下降50%～80%的現象［9］。這表明在FCM 計數浮游病毒方法中，液氮速凍并非所有環(huán)境樣品保存的必須條件，這對條件有限的實驗室開展浮游病毒研究意義重大。

5 結論

FCM 與EFM 計數溫和冷凍香溪河樣品中浮游細菌豐度的結果沒有顯著差異；FCM 計數溫和冷凍香溪河樣品中浮游病毒豐度的結果比EFM 獲得的結果高2.0±0.1 倍，并未出現病毒豐度下降50%～80%的現象。上述結果證實，FCM 計數溫和冷凍香溪河樣品中浮游細菌和浮游病毒豐度結果可靠，液氮冷凍并非FCM 計數浮游病毒和浮游細菌豐度的必須條件。研究結果拓寬了利用FCM 計數香溪河浮游微生物的環(huán)境條件范圍。