紀(jì)曉楠 李 勇 李恩杰

遼寧省本溪市中心醫(yī)院普外科，遼寧本溪 117000

乳腺癌是最常見(jiàn)的危害女性健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占人類(lèi)所有惡性腫瘤發(fā)病率的7%～10%，并且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。乳腺癌早期臨床癥狀不典型，因此，部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，并伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，情況不容樂(lè)觀。微小RNA（miRNA）是一種內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度為19～24 個(gè)核苷酸[2]。miRNA 可以與靶基因的3’UTR 區(qū)以不完全互補(bǔ)的方式結(jié)合，發(fā)揮其生物學(xué)作用，如抑制蛋白質(zhì)翻譯等[3]。研究發(fā)現(xiàn)[4]，miRNA-155（miR-155）在多種腫瘤細(xì)胞中均呈高表達(dá)狀態(tài)，如胃癌、結(jié)腸癌等，并且其參與癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。潘虹等[3]認(rèn)為，miR-155 可能在乳腺癌細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體（HER）家族，包括HER-1、HER-2、HER-3 和HER-4。目前，HER-2 已經(jīng)成為乳腺癌治療的靶點(diǎn)[5]。HER-3 也具有多重生物學(xué)功能，如參與細(xì)胞增殖及分化過(guò)程。有研究顯示[6]，HER-3可以促進(jìn)某些腫瘤生長(zhǎng)，進(jìn)一步加重腫瘤的惡性程度，如肺癌、胃癌。miR-155 與HER-3 在乳腺癌細(xì)胞中均呈高表達(dá)，但兩者在乳腺癌中的具體作用機(jī)制還不明確。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-155 與HER-3 在乳腺癌中的表達(dá)并分析與臨床資料之間的關(guān)系，探究?jī)烧咴谌橄侔┌l(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年3 月—2019 年8 月遼寧省本溪市中心醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）收治的乳腺癌患者87 例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)活檢病理或術(shù)中病理檢查確診為乳腺癌；②首次診斷乳腺癌，且從未接受過(guò)任何抗腫瘤治療；③臨床病理治療完整，且簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他系統(tǒng)惡性腫瘤，如肺癌、胃癌等；②患有免疫功能缺陷?；颊呔鶠榕裕荒挲g36～66 歲，平均（50.4±3.72）歲；≥50 歲53 例，＜50 歲34 例；腫瘤分化程度：中低分化49 例，高分化38 例；TNM 分期：Ⅰ期30 例，Ⅱ期23 例，Ⅲ期23 例，Ⅳ期11 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56 例；腫瘤直徑＜2 cm 32 例，≥2 cm 55 例；月經(jīng)初潮年齡＜13 歲42 例，≥13 歲45 例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)（qRT-PCR）檢測(cè)miR-155 的表達(dá) 收集活檢或術(shù)中獲取的乳腺癌組織及癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞5 cm），冷凍保存并立即送檢。取100 mg 組織標(biāo)本，應(yīng)用Trizol 法提取總RNA（試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，生產(chǎn)批號(hào)：20160217），使用紫外分光光度儀檢測(cè)RNA 濃度，符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA凍存?zhèn)溆?。使用RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國(guó)QIAGEN 公司，生產(chǎn)批號(hào)：20160211）將提取出的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，U6 作內(nèi)部參考。反應(yīng)條件為37℃60 min，95℃5 min。反應(yīng)體系為：0.15 μL dNTP，1 μL 逆轉(zhuǎn)錄酶，1.5 μL 10×RT 緩沖液，0.188 μL RNase 抑制劑，1 μL RNA，3μL miR-155/U6 RT 引物和8.162 μL NFH2O。qPCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，再變性1 min，60℃45 s，72℃延伸40 個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10 min。反應(yīng)體系為：10 μL 2×SYBR Green，1 μL 20×TaqDNA聚合酶，1.33 μL miR-155/U6 RT 產(chǎn)物和7.67 μL H2O。引物序列：miR-155，F(xiàn)：5’-AACTTGTAAACTCCCTCGACTG-3’，R：5’-CCTTACGTGACCTGGAGTCG-3’；U6，F(xiàn)：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，R：5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’；GAPDH，F(xiàn)：5’ -CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC -3’，R：5’ -ATC CG-TTGACTCCGACCTTCAC-3’。每個(gè)樣本至少重復(fù)3 次，最后采集熒光信號(hào)，結(jié)果以2-ΔΔCt來(lái)計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)化miR-155 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 免疫組化檢測(cè)HER-3 蛋白的表達(dá)情況 將獲取的乳腺癌及癌旁組織甲醛固定并經(jīng)石蠟包埋后，使用切片機(jī)切成厚度為5 μm 的切片，依次經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟、無(wú)水乙醇梯度水化及PBS 清洗。再將切片浸泡在枸櫞酸緩沖液中，100℃加熱10 min 室溫冷卻，PBS 清洗。使用3% H2O2室溫孵育切片10 min，滴加一抗（美國(guó)ABCam 公司，生產(chǎn)批號(hào)：20160112），室溫孵育1 h，清洗后滴加二抗（北京ZSGB-BIO 公司，生產(chǎn)批號(hào)：20160202），室溫孵育0.5 h，DAB 顯色5 min，蘇木精復(fù)染3 min，乙醇再次梯度水化，最后樹(shù)脂封片。由專(zhuān)業(yè)病理醫(yī)師顯微鏡鏡檢（200×），選取20 個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，0～5%記0 分，＞5%～25%記1 分，＞25%～50%記2 分，＞50%～100%記3 分；按細(xì)胞染色強(qiáng)度，未著色0 分，淺黃色1 分，棕黃色2 分，黃褐色3 分。將以上兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘[6]，0～2 分為陰性，3～5 分為+，6～8 分為++，9 分為+++。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織中miR-155 與HER-3 的表達(dá)情況

乳腺癌組織中miR-155 的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.452±0.083），高于癌旁組織的（0.125±0.026），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=35.067，P ＜0.001），見(jiàn)圖1。乳腺癌組織中HER-3 的陽(yáng)性表達(dá)率為70.11%（61/87），高于癌旁組織的31.03%（27/87），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.578，P ＜0.001），細(xì)胞染色結(jié)果見(jiàn)圖2（封四）。

圖1 乳腺癌組織及癌旁組織miR-155 電泳圖

2.2 乳腺癌組織中miR-155 和HER-3 的表達(dá)與患者臨床資料之間的關(guān)系

不同腫瘤細(xì)胞分化程度、TNM 分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中miR-155、HER-3 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 乳腺癌組織miR-155 與HER-3 的表達(dá)相關(guān)性分析

Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示，miR-155 與HER-3的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.576，P ＜0.05）。

3 討論

乳腺癌是引起女性死亡的第二大惡性腫瘤[7]。近年來(lái)，隨著醫(yī)療水平進(jìn)步飛快，部分乳腺癌患者可以實(shí)現(xiàn)早診斷、早治療，提高了患者的生存率。但是，現(xiàn)有的乳腺癌生物標(biāo)志物的診斷性能仍然存在缺陷，比如癌胚抗原，雖然廣泛應(yīng)用于乳腺癌的監(jiān)測(cè)，但其敏感性較低[8]。因此，積極尋找有效的乳腺癌生物學(xué)指標(biāo)對(duì)于乳腺癌的診斷及治療有著重要的意義。

表1 乳腺癌組織中miR-155 與HER-3 的表達(dá)與患者臨床資料之間的關(guān)系

miRNA 是一種短鏈且單鏈的RNA，是各種細(xì)胞增殖分化過(guò)程中的重要的調(diào)節(jié)因子[9]。有研究顯示[10]，某些miRNA 可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程，可能會(huì)促進(jìn)癌癥的惡性程度。miR-155 是一種致癌基因，在多種腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)。Liu 等[11]認(rèn)為，乳腺癌中miR-155 的表達(dá)水平是正常乳腺組織中的5 倍。這與本研究結(jié)果有相同之處。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miR-155 的表達(dá)水平高于癌旁組織（P ＜0.05）。其原因可能為miR-155 上調(diào)其靶基因HDAC2 的表達(dá)，而后者可以抑制酪氨酸激酶受體2（ErbB2）轉(zhuǎn)錄，ErbB2 可以抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，miR-155 的高表達(dá)使機(jī)體實(shí)現(xiàn)代償性地抑制腫瘤細(xì)胞增殖和惡性進(jìn)展的作用[12]。本研究結(jié)果顯示，不同腫瘤細(xì)胞分化程度、TNM 分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中miR-155 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。JAKSTAT 是最重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一，而miR-155 可以下調(diào)SOCS1 表達(dá)并激活JAK-STAT 信號(hào)通路，使其與某些與腫瘤相關(guān)的炎癥因子如白細(xì)胞介素-6、脂多糖等表達(dá)增加，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程[13]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMP）16 屬于MMP 家族，是調(diào)節(jié)腫瘤遷移和侵襲的重要細(xì)胞因子。有研究發(fā)現(xiàn)[14]，MMP16 除了參與正常的生理過(guò)程外，還參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，例如胚胎發(fā)育和組織重塑。miR-155通過(guò)上調(diào)MMP16 的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移及轉(zhuǎn)移過(guò)程。FOX3a 是miR-155 的靶基因，F(xiàn)OX3a 可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程，當(dāng)miR-155 抑制FOX3a 的表達(dá)時(shí)，間接抑制了腫瘤細(xì)胞凋亡的過(guò)程，使得腫瘤惡性程度增高，TNM 分期升高[15]。

HER-3 是HER 家族的一員，其染色體位置為12q13。HER-3 由跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)和胞外區(qū)組成[16]。通常情況下，HER-3 需要與家族中其他成員結(jié)合形成二聚體才能發(fā)揮其自身作用。有文獻(xiàn)報(bào)道[17]，HER-3可以與磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、黏附及遷襲。高表達(dá)狀態(tài)的HER-3 可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，甚至可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞地侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中HER-3 的表達(dá)水平高于癌旁組織（P ＜0.05）。其原因可能為HER-3 與家族成員HER-2 結(jié)合后，與PI3K 結(jié)合并激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等過(guò)程[18]。本研究結(jié)果顯示，不同腫瘤細(xì)胞分化程度、TNM 分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中HER-3 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。機(jī)制可能為HER-3 可以抑制血管生成素-1 與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，使得腫瘤生長(zhǎng)分化功能降低，進(jìn)一步使腫瘤分化等級(jí)降低，腫瘤惡性程度增高[19-20]。HER-3 的過(guò)表達(dá)，激活了Ras/Raf/MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，當(dāng)信息傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，使得基因轉(zhuǎn)錄增加，加快了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移過(guò)程[21]。HER-3 表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期加快，腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移，并使上皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，使得腫瘤細(xì)胞逃離原病灶，轉(zhuǎn)移至其他組織中，進(jìn)一步使得TNM 分期升高[22]。本研究結(jié)果顯示，miR-155 與HER-3 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.576，P ＜0.05），miR-155 的表達(dá)水平會(huì)隨著HER-3 蛋白表達(dá)的升高而升高，提示兩者在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同作用，共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及浸潤(rùn)的過(guò)程，但兩者具體協(xié)同作用機(jī)制目前依然未能確切，有待后續(xù)增加大樣本量繼續(xù)探究。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-155 與HER-3 的表達(dá)與腫瘤TNM 分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有望在乳腺癌的診斷及治療過(guò)程中提供可靠的科學(xué)依據(jù)。但兩指標(biāo)在乳腺癌發(fā)生過(guò)程中的具體作用機(jī)制還需要多中心的研究進(jìn)一步探討。