薛 棟 李夢宇 丁寶忠 宋相孔 夏修良

1.山東省濱州市人民醫(yī)院普外一科，山東濱州 256610；2.山東省濱州市人民醫(yī)院普外三科，山東濱州 256610；3.山東省濱州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東濱州 256610

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的內(nèi)分泌腫瘤，約85%以上[1]的甲狀腺癌屬于此類型。近年來，PTC 發(fā)病率呈上升趨勢，甚至部分微小乳頭狀癌患者在就診時就發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的標志事件[3]。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Slug在EMT 中發(fā)揮主要作用，而EMT 又促進侵襲轉(zhuǎn)移[4]。內(nèi)分泌癌和口咽鱗癌組織中Slug蛋白高表達，并且與腫瘤患者的不良預后有關(guān)[5-6]。波形蛋白（Vimentin）和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）是EMT 標志蛋白[7]，間葉細胞能表達Vimentin 與間葉表型轉(zhuǎn)變有關(guān)。眾所周知，具有高侵襲性的細胞高表達Vimentin，當成纖維細胞中的Vimentin 基因被敲除后細胞遷移力明顯下降[8]。結(jié)腸癌中Vimentin 高表達，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是一個不良預后因素[9]。但PTC 中關(guān)于Slug 和Vimentin蛋白的聯(lián)合研究報道較少。本研究重點探討Slug 和Vimentin 與PTC 臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，旨在為探索PTC 侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制打下基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年1月～2020年1月濱州市人民醫(yī)院的103例PTC患者的癌組織標本作為研究組，其中男31例，女72例；年齡15～73歲，平均（42.5±6.8）歲；腫瘤位于單側(cè)78例，位于雙側(cè)25例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（第八版）[10]TNM分期標準，其中Ⅰ期43例，Ⅱ期34例，Ⅲ期19例，Ⅳ期7例。分別將性別（男vs.女）、年齡（＜55歲vs.≥55歲），腫瘤直徑（≤10 mm vs.＞10 mm）、腫瘤部位（單側(cè)vs.雙側(cè)）、多灶性（無vs.有）、TNM（Ⅰ+Ⅱ期vs.Ⅲ+Ⅳ期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無vs.有）、腺外侵犯（無vs.有）進行分組研究。選取同期的42例PTC患者的癌旁甲狀腺組織作為參照組。納入標準：①符合PTC 病理診斷標準；②術(shù)前未行放化療或免疫治療；③術(shù)中留取腫瘤組織或者癌旁組織；④患者或家屬知情并簽署知情同意書。排除標準：①轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌；②長期使用免疫抑制劑等藥物。所有標本預先行HE染色重新確診，統(tǒng)計PTC 臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 試劑

鼠抗人Slug 單抗和鼠抗人Vimentin 單抗采購于Santa Cruz 公司，工作濃度為1∶200；Envision 試劑盒由Dako 公司提供；陰性對照選用磷酸鈉鹽緩沖液（PBS）。

1.3 免疫組化步驟

選取含腫瘤組織的蠟塊，由病理科醫(yī)師重新進行病理診斷證實，石蠟塊連續(xù)4 μm 切片、脫蠟、梯度乙醇處理。采取枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）熱抗原修復，分別加入Slug 及Vimentin 一抗，添加二抗、DAB 染色（注意染色時間）、蘇木素復染、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。鏡下觀察染色效果，PBS 作為陰性對照。

1.4 結(jié)果的判定

參考文獻[11]的分級方法，兩種蛋白陽性染色在顯微鏡下均表現(xiàn)為黃色、棕黃色甚至褐色。病理科專家于200倍視野下隨機選取5個視野（每個視野＞200個細胞），按陽性細胞所占百分比及染色的強度進行判定，分別為0分（無染色）、1分（淡黃）、2分（棕黃）、3分（棕褐）。陽性細胞比例算分：≤10%為1分，＞10%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。染色強度與染色陽性細胞比例評分相乘，≥3 判為陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用率表示，比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC 中Slug 和Vimentin陽性表達

Slug蛋白主要表達于細胞核（圖1，封三），Vimentin蛋白主要表達于細胞質(zhì)（圖2，封三）。Slug 與Vimentin分別在細胞核和細胞質(zhì)呈棕黃或者棕褐色表達，癌旁組織中無表達或局部灶狀表達。PTC組織中Slug 的陽性率為76.7%，而癌旁組織中Slug 的陽性率為26.2%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PTC組織中Vimentin的陽性率為72.8%，癌旁組織中Vimentin 的陽性率為21.4%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 Slug陽性染色

圖1 Slug陽性染色

圖2 Vimentin陽性染色

2.2 Slug 和Vimentin 與PTC患者病理參數(shù)之間的關(guān)系

不同TNM分期、腺體是否外侵與是否伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 中的Slug 和Vimentin陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。分期較晚、伴有腺體外侵犯、有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 中的Slug 和Vimentin蛋白陽性率較高。不同年齡、不同性別、腫瘤不同部位和是否多灶性組的患者的Slug 和Vimentin陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

2.3 Slug 和Vimentin表達相關(guān)性

本研究入組的PTC組織中的Slug 和Vimentin蛋白均表現(xiàn)為陽性者49例，表現(xiàn)均為陰性者13例，Slug蛋白表達和Vimentin蛋白表達呈正相關(guān)（r=0.523，P=0.031）。

3 討論

甲狀腺癌在全世界內(nèi)均呈明顯上升的態(tài)勢，目前居中國女性惡性腫瘤第四位。PTC 病例近年來呈現(xiàn)出越來越年輕化的趨勢，且易發(fā)生引流區(qū)域的頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，約有70%[12]的PTC患者在確診時就發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，給廣大人民群眾造成巨大的社會和經(jīng)濟負擔，因此關(guān)于PTC 侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制亟待解決。

EMT是特殊的病理現(xiàn)象，指上皮轉(zhuǎn)變成間葉表型的病理過程，上皮來源惡性腫瘤形成中都要經(jīng)歷這個過程[13]。Slug 能抑制E-cadherin 的表達和促進EMT發(fā)生，且與分化程度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤惡性侵襲密切有關(guān)，是患者臨床預后不佳的重要因子[6，14]。有研究報道，結(jié)直腸癌（CRC）中35.17%（51/145）的患者表達Slug，癌旁組織中7.59% （11/145）表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且高表達Slug 的CRC患者生存期明顯少于低表達Slug 患者[15]。最新的研究顯示，食管癌和癌旁組織中Slug 基因的陽性表達率分別為68.53%、31.46%，且Slug蛋白陽性表達率與組織分化、腫瘤浸潤的深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）[16]。本研究顯示，Slug在PTC 和癌旁組織的表達率分別為76.7%，26.2%（P＜0.05），提示Slug 促進了PTC 的發(fā)生、發(fā)展。本研究還顯示，Slug 的陽性表達率與不同的年齡、性別、腫瘤的直徑、腫瘤所在部位和多灶性差異無統(tǒng)計學意義，而與腫瘤的TNM分期、腺體外侵和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示Slug 在PTC 侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。

表1 Slug 及Vimentin 在不同甲狀腺組織中的表達（例）

表2 Slug 及Vimentin表達與PTC 臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n（%）]

惡性腫瘤在侵襲轉(zhuǎn)移中普遍存在EMT。一旦上皮細胞間的連接發(fā)生異常變化，E-cadherin表達下降，Vimentin 增加，細胞架構(gòu)發(fā)生改變，繼而腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移[7]。PTC 細胞在侵襲轉(zhuǎn)移中存在EMT 現(xiàn)象[17]。有報道顯示，Vimentin 在鼻咽癌中的陽性率為24.6%，提示Vimentin 與患者預后有關(guān)[18]。眼瞼皮脂腺癌中的Vimentin表達與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理學分級和預后有關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示，PTC 中的Vimentin高表達，Vimentin表達與臨床病理特征如性別、年齡、腫瘤的直徑、腫瘤所在部位、多灶性差異無統(tǒng)計學意義，而與腺體外侵、臨床TNM分期及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Slug 和Vimentin 呈正相關(guān)。Slug 和Vimentin 在PTC 中存在高表達的現(xiàn)象提示兩者參與了PTC 惡性侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，PTC 中的Slug 和Vimentin 高表達，且其均與患者TNM分期、腺體外侵和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切有關(guān)。推斷Slug 可能促進了Vimentin表達，引起腫瘤細胞間黏附能力明顯下降，最后導致甲狀腺乳頭狀癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移，這為甲狀腺乳頭狀癌的靶向診療提供了新依據(jù)。