李炳坤 黃春陽 李秀楹 鄭艷青 潘開素 廖萬清 曹存巍

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，南寧 530021； 2.南寧市第四人民醫(yī)院，南寧 530023； 3.上海長征醫(yī)院皮膚性病與真菌病研究所，上海 200003)

隱球菌是自然界中威脅人類和動物生命的真菌病原體[1]。通常是人體吸入空氣中的孢子或者酵母細胞進而進入呼吸道，然后傳播到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起肺隱球菌病和隱球菌腦膜腦炎[2-3]。既往有大量的分子生物學(xué)方法已經(jīng)證明在隱球菌中存在相當(dāng)大的遺傳異質(zhì)性，且各種分子生物學(xué)技術(shù)已被用于隱球菌的基因分型研究，包括 PCRM13指紋分析、 AFLP、RAPD、 MLMT、多位點序列分型(MLST)和二代測序(NGS)分析[3-4]。格特隱球菌菌種復(fù)合體分為C.gattiisensustricto(AFLP4/VGI),C.deuterogattii(AFLP6/VGII),C.bacillisporus(AFLP5/VGIII),C.tetragattii(AFLP7/VGIV) andC.decagattii(AFLP10/VGIV)[5]。

隱球菌病主要由新生隱球菌和格特隱球菌菌種復(fù)合體感染所致，由新生隱球菌感染引起的隱球菌病全國各地均有發(fā)生，而格特隱球菌菌種復(fù)合體感染所致的隱球菌病最初被認為是一種地方性疾病，好發(fā)于熱帶地區(qū)。近年來格特隱球菌菌種復(fù)合體感染在我國報道逐年增多[6]，然而其相關(guān)研究的數(shù)據(jù)比較少，這些分離株的遺傳同一性和變異性，以及臨床分離株和全球分離株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系還有待進一步研究。本研究旨在進一步了解廣西地區(qū)格特隱球菌菌種復(fù)合體的基因型，并分析它們與全球菌株的親緣關(guān)系以及相應(yīng)的抗真菌藥物敏感性。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株

選取2014—2018年從臨床患者收集的120株隱球菌菌株，其中10株分離自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，另外1株分離自廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院。利用CGB培養(yǎng)基篩選出的11株格特隱球菌菌種復(fù)合體作為本研究的研究對象，體外抗真菌藥敏實驗質(zhì)控菌株近平滑念珠菌ATCC22019 由北京大學(xué)真菌與真菌病研究中心惠贈。

1.2 MLST和系統(tǒng)發(fā)育分析

使用新型植物基因組DNA提取試劑盒(CWBIO，中國北京)提取菌株DNA。參考ISHAM共識的MLST方案，擴增并測序了7個基因座，包括CAP59、GPD1、LAC1、IGS1、PLB1、SOD1和URA5基因[7]。對等位基因進行了分析，并根據(jù)MLST數(shù)據(jù)庫確定STs (http://mlst.mycologylab.org)。通過比對7個串聯(lián)核苷酸序列(CAP59、GPD1、LAC1、IGS1、PLB1、SOD1和URA5)，分析格特隱球菌菌種復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)育[8]。使用MEGA7分析中國臨床菌株和不同國家菌株之間的遺傳關(guān)系[8-10]，使用最大似然法和1000個重復(fù)的自舉分析生成系統(tǒng)發(fā)育樹[11，12]。

1.3 主成分(PCA)分析

利用Adegene 2.1.1軟件包R(3.4.4版)，將本研究中的格特隱球菌(AFLP4/VGI和AFLP6/VGII)與公開數(shù)據(jù)庫的格特隱球菌進行聚類分析，以探索菌株的遺傳關(guān)系和地理模式。

1.4 體外抗真菌藥敏實驗

依據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)推薦使用的微量肉湯稀釋法M27-A3方案測定臨床分離的格特隱球菌菌種復(fù)合體對氟康唑(FLC)、兩性霉素B(AMB)、5氟胞嘧啶(5FC)、伊曲康唑(ITC)、伏立康唑(VOR)和泊沙康唑(POS)以及艾沙康唑(ISA)等抗真菌藥的最小抑菌濃度(MIC)。每個菌株在不同的時間重復(fù)3次實驗。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 格特隱球菌菌種復(fù)合體感染患者臨床資料

11名臨床患者中。其中有10名隱球菌腦膜炎(CM)和1名肺隱球菌病(PC)患者。男女比例為8∶3，平均年齡為38.0±7.8歲(29～54歲)，職業(yè)以農(nóng)民為主。10例CM患者中，常見的臨床表現(xiàn)為頭痛、發(fā)熱、嘔吐和惡心。PC(GX0717)患者以胸痛為主要癥狀。只有1名患者(GX0080)既往診斷為系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，并接受了皮質(zhì)類固醇治療。然而，其他患者沒有檢測到顯著的免疫異常。所有患者均無中國境外旅行史。

根據(jù)美國傳染病學(xué)會(IDSA)指南和中國專家對隱球菌性腦膜炎診斷和治療的共識，誘導(dǎo)期經(jīng)過2種(AMB和FLC)或3種(AMB、FLC和5FC)抗真菌藥物的聯(lián)合治療，多數(shù)患者癥狀明顯緩解。盡管進行了抗真菌治療，但仍有1名患者因無明顯改善而放棄治療后死亡(GX0147)。

2.2 MLST和系統(tǒng)發(fā)育分析

通過對11株格特隱球菌菌種復(fù)合體的MLST分析，發(fā)現(xiàn)5株為AFLP4/VGI，6株為AFLP6/VGII (見圖1、2，見表1)。在AFLP4/VGI和AFLP6/VGII中分別檢測到5種和3種不同的序列類型(STs)，所有的AFLP4/VGI菌株在遺傳上是不同的(見圖1)，其中GX0079與其他的AFLP4/VGI菌株有顯著差異。而AFLP6/VGII分離株分為三大類群(ST169、ST129、ST309)，ST169和ST129均有1個以上的分離株(表1)。

圖1 最大似然法構(gòu)建中國廣西11株格特隱球菌菌種復(fù)合體(藍色)與18株參考菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，圖中每個分支的 bootstrap支持度均高于70% 圖2 最大似然法構(gòu)建中國廣西6株AFLP6/VGII基因型的格特隱球菌菌種復(fù)合體(紅色)與全球AFLP6/VGII基因型格特隱球菌菌種復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)育樹。標準參考菌株C. gattii s.s.(WM179), C. bacillisporus(WM161), C. tetragattii(WM779)和C. decagattii(IHEM14941)為外群。加拿大及美國西北太平洋西地區(qū)暴發(fā)感染的菌株呈藍色。圖中分支的 bootstrap支持度高于70%用粗體表示

表1 中國廣西地區(qū)臨床分離的格特隱球菌菌種復(fù)合體序列類型、基因型

通過對我國和全球AFLP6/VGII分離株遺傳分析表明，中國4個分離株(GX0104、GX0105、GX0147和GX0476)與來自巴西的AFLP6/VGII菌株(LMM293和ILA3279)聚類分布; 臨床分離株(GX0903和GX0717)與來自西班牙(CCA242OLD)、新加坡(DF12341)、美國(B8973)和法國(IP2003/125)等地區(qū)的AFLP6/VGII菌株聚類分布，表明這些菌株之間在遺傳上具有更近的親緣關(guān)系。盡管這些分離株沒有與在加拿大和美國的暴發(fā)中報道的高毒力菌株(AFL6A/VGIIa R265和AFL6C/VGIIc A6M-R38)高度相似，但系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，GX0476菌株與來自美國俄勒岡州的AFL6C/VGIIc(A6M-R38)群體為姊妹關(guān)系。

2.3 中國和全球分離株的比較

基于多位點序列分型的的主成分分析(PCA)用于評估中國和全球分離株之間的遺傳關(guān)系。數(shù)據(jù)顯示AFLP4/VGI中存在大約41.8%的遺傳變異性(PC1 30.0%，PC2 11.8%，見圖3)。AFLP6/VGII 為35%的遺傳變異性 (PC1 17.9%，PC2 17.1%，見圖4)，且在AFLP6/VGII分離株中，4個AFLP6/VGII分離株似乎來自南美洲。以上主成分分析未按來源對格特隱球菌菌種復(fù)合體進行分組，這與系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果相一致。

2.4 抗真菌藥物敏感性

表2的MICs顯示，所有菌株對常用抗真菌藥物均無耐藥性。根據(jù)臨床療效，AMB、FLC和5FC的2種或3種藥物聯(lián)合治療是有效的。AFLP4/VGI和AFLP6/VGII菌株對這7種抗真菌藥物敏感性無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

我們的研究表明，中國廣西地區(qū)的格特隱球菌菌種復(fù)合體感染是由C.gattiis.s. (AFLP4/VGI)和C.deuterogattii(AFLP6/VGII)引起，且擁有不同的MLST基因型。盡管本次研究的AFLP6/VGII與暴發(fā)的高毒力基因型AFL6A/VGIIa(R265)和AFL6C/VGIIc(A6M-R38) 在基因上并不完全相似，但它們與全球其他AFLP6/VGII菌株有親緣關(guān)系，例如巴西(LMM293和ILA3279)、新加坡(DF12341)和西班牙(CCA242OLD)。AFLP6/VGII菌株基因組具有遺傳多樣性，并且在C.deuterogattii菌株的亞基因型(AFLP6A/VGIIa和AFLP6C/VGIIc)中存在較大的基因型變異性，特別是巴西的AFLP6/VGII菌株[14]，雖然本研究的樣本量小，但大多數(shù)格特菌株在遺傳上呈多樣性。這種可變性可能是由于特殊的生態(tài)相互作用、適應(yīng)和進化機制所致。隱球菌物種能夠適應(yīng)不同的生態(tài)位和溫度，它們可以通過微進化，進而在宿主和環(huán)境中適應(yīng)[15]。

本研究的臨床數(shù)據(jù)顯示，除了1名系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外，幾乎所有患者均無明顯的免疫缺陷，這與以往報道的格特隱球菌菌種復(fù)合體通常感染具有免疫活性宿主這一觀點是一致的[6]。大多數(shù)患者在聯(lián)合治療后明顯緩解，1名患者(GX0147)因無明顯改善而放棄治療后去世。然而，抗真菌藥物敏感性試驗表明，本研究中的菌株對抗真菌藥物沒有耐藥性，最低抑菌濃度值均在敏感范圍內(nèi)[16-18]。提示這些菌株未表現(xiàn)出耐藥性，但其他因素可能影響治療效果。

圖3 中國廣西地區(qū)AFLP4/VGI菌株和全球的AFLP4/VGI菌株的主成分分析圖 圖4 中國廣西地區(qū)AFLP6/VGII菌株和全球的AFLP6/VGII菌株的主成分分析圖

表2 中國廣西地區(qū)11株格特隱球菌菌種復(fù)合體的抗真菌藥物敏感實驗

隱球菌可以通過樹木和木材產(chǎn)品的進出口、氣流、水流、及生物源(如鳥類)等傳播[19]。與常見于野生/寵物鳥類糞便(尤其是鴿子糞便)及其污染的土壤中的新生隱球菌不同，格特隱球菌菌種復(fù)合體更喜歡生長在潮濕的樹皮、樹洞和野生樹木(包括桉樹等)附近的土壤[20]。風(fēng)和氣流傳播格特隱球菌菌種復(fù)合體的證據(jù)是有限的，但是在加拿大和印度的陽性樹木周圍空氣樣本中分離出真菌[19]。廣西位于中國南部，屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候[21]，可能有利于格特隱球菌菌種復(fù)合體的生長和繁殖。在這項研究中，大多數(shù)患者是農(nóng)民，且都接觸過上述植物和土壤(尤其是桉樹)，但都沒有前往格特隱球菌菌種復(fù)合體流行區(qū)域的旅行史(主要是加拿大、南美和澳大利亞等的流行區(qū))，這表明他們的隱球菌感染是接觸當(dāng)?shù)丨h(huán)境而導(dǎo)致的[23]。廣西格特隱球菌菌種復(fù)合體的遺傳多樣性也表明了多重獨立起源的可能性。結(jié)合本研究的系統(tǒng)發(fā)育分析，我國部分菌株與巴西菌株有親緣關(guān)系。這可以追溯到從其他地方進口的木材/幼苗，如南美洲和澳大利亞[23]。但仍需要從樹木、土壤和野生動物的環(huán)境中進一步分離和調(diào)查，以明確廣西格特隱球菌菌種復(fù)合體的感染源。

在全球范圍內(nèi)，與新生隱球菌感染相比，格特隱球菌菌種復(fù)合體感染相對較少(11.4%VS88.6%)[24]，然而，最近的研究表明，該菌的感染經(jīng)常被誤診或漏診[25]。同樣，其在中國的感染數(shù)量也可能被低估。與國內(nèi)其他省份的數(shù)據(jù)相比[26-27]，廣西格特隱球菌菌種復(fù)合體感染發(fā)生率約為9% (11/120)，大部分感染是由AFLP6/VGII引起的，因此，這需要進行更多的流行病學(xué)調(diào)查和研究。