邱杰洪?張昌林?李田

【摘要】目的 觀察人臍帶間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基（MSC-CM）對HPV18型陽性人子宮頸癌HeLa細胞（HPV18 HeLa細胞）凋亡相關(guān)基因的調(diào)控作用，以及對HPV18 HeLa細胞凋亡的影響。方法 制備MSC-CM，設(shè)置空白組、低劑量組和高劑量組，配制相應(yīng)濃度分別為0%、20%和60%的MSC-CM處理HPV18 HeLa細胞，使用CCK-8法、克隆形成實驗檢測細胞活力和克隆形成能力;磷脂結(jié)合蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶雙染法凋亡染色和流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的變化;實時熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因mRNA表達量。結(jié)果 與空白組相比，在低劑量組或高劑量組的MSC-CM作用下，HPV18 HeLa細胞的生長活性和克隆形成能力均降低，細胞凋亡率升高（P均< 0.05），且高劑量組作用效果均比低劑量組明顯（P均< 0.05）。與空白組相比，HPV18 HeLa細胞在低劑量或高劑量組MSC-CM的作用下，HPV18 HeLa細胞中p53、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、Caspase-9、Bax的mRNA表達量升高，而B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）的mRNA表達量降低（P均< 0.05），高劑量組比低劑量組的作用效果更明顯（P < 0.05）。結(jié)論 MSC-CM能誘發(fā)HPV18 HeLa細胞凋亡，可能與p53、Caspase-3、Caspase-9、Bax以及Bcl-2等基因表達差異相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】人乳頭瘤病毒18型;宮頸癌;HeLa細胞;間充質(zhì)干細胞;細胞凋亡

Effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-conditioned medium on apoptosis of HPV18-infected HeLa cell lines Qiu Jiehong， Zhang Changlin， Li Tian. Department of Gynecology and Pelvic Floor Disorders Center， the Seven Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Shenzhen 518107， China

Corresponding author， Li Tian， E-mail： sandylitian@ 126. com

【Abstract】Objective To evaluate the effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-conditioned medium （MSC-CM） on regulating the apoptosis-related genes and determine the impact upon the apoptosis of human papillomavirus type18-infected HeLa cell lines. Methods Primary cervical cancer HeLa cells were divided into the blank， low-dose and high-dose groups. HeLa cells were cultured and treated with 0%， 20% and 60% of MSC-CM in three groups， respectively. The cell viability and clone formation ability of HeLa cells were detected by CCK-8 assay and clone formation assay. The apoptosis of HeLa cells was detected by Annexin V-Fluorescein isothiocyanate/Propidium iodide （V-FITC/PI） staining and flow cytometry. The expression levels of p53， Bax， Caspase-3， Caspase-9 and Bcl-2 mRNA in HeLa cells were quantitatively measured by RT-PCR. Results In the low- and high-dose groups， the cell viability and clone formation ability were significantly decreased， whereas the apoptosis rate was significantly elevated compared with those in the blank group （all P < 0.05）. The effects in the high-dose group were more evident than those in the low-dose group （all P < 0.05）. The expression levels of p53， Bax， Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in the low- and high-dose groups were significantly up-regulated， whereas that of Bcl-2 mRNA was significantly down-regulated compared with those in the blank group （all P < 0.05）. The effects in the high-dose group were more pronounced than those in the low-dose group （all P < 0.05）. Conclusions Under the effect of MSC-CM， the apoptosis of HPV18 cervical HeLa cells can be induced， probably associated with the differential expression patterns of p53， Bax， Bcl-2， Caspase-3 and Caspase-9 mRNA.

【Key words】Human papillomavirus type18;Cervical cancer;HeLa cell;Mesenchymal stem cells;

Apoptosis

人乳頭瘤病毒（HPV）是一種閉合雙鏈DNA病毒[1]。在HPV感染導(dǎo)致的眾多上皮病變中，子宮頸癌與HPV的持續(xù)感染高度相關(guān)[2]。目前約90%的子宮頸癌由高危型HPV感染引起，其中69.1%的子宮頸癌是由HPV16和HPV18引起的，這對全球女性的健康造成了嚴(yán)重的不良影響[3]。目前大部分HPV疫苗以預(yù)防HPV感染為主，主要保護HPV陰性人群，且不能終身預(yù)防[4]。因此，探索一種靶向清除HPV陽性子宮頸癌細胞的治療方案，成為了目前子宮頸癌防治的迫切需求。

人臍帶間充質(zhì)干細胞（MSC）是一種多能干細胞，因取材廣泛、增殖迅速，在細胞治療領(lǐng)域備受關(guān)注[5]。研究顯示，MSC能增加血循環(huán)中未成熟CD4+ T淋巴細胞數(shù)目，逆轉(zhuǎn)HIV-1持續(xù)感染的結(jié)局[6]。乙型肝炎終末期肝病患者輸注MSC，能降低HBV的病毒復(fù)制水平[7]。同時，MSC的抗癌特性引起了研究人員的關(guān)注[8]。MSC能有效抑制膽管癌細胞系的生長并在動物模型中定向遷移抑制瘤體生長[9]。另外MSC能使卵巢腫瘤的細胞周期停滯并促進其凋亡進程[10]?？梢?，MSC在病毒感染和腫瘤中發(fā)揮著重要的作用。然而目前較少報道MSC在宮頸癌中的作用，本研究通過制備MSC條件培養(yǎng)基（MSC-CM）處理人子宮頸癌HeLa細胞，探索MSC對人HeLa細胞的影響及可能機制。

材料與方法

一、細胞來源及主要試劑

人臍帶MSC購自博雅干細胞公司，HPV18型陽性人子宮頸癌HeLa細胞（HPV18 HeLa細胞）購自美國ATCC細胞庫，細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶購自美國 Corning 公司，DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液均購自美國 Gibco公司，MSC專用胎牛血清購自BI公司。CCK-8試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。磷脂結(jié)合蛋白Ⅴ（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）雙染法凋亡試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。Trizol RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光實時定量（qRT）-PCR試劑盒均購自北京天根生物科技有限公司。

二、細胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含100 U/ml 青霉素， 100 μg/ml鏈霉素）培養(yǎng) HPV18 HeLa 細胞;本研究采用F3～F6代的MSC進行實驗，使用含10%胎牛血清的低糖DMEM/F12 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，置于37℃含5% CO2、濕度為95%的環(huán)境中培養(yǎng)，2 ～ 3 d 傳代1次。當(dāng)細胞長至80% ～ 90%時，利用含0.25%胰酶進行常規(guī)傳代。

三、MSC-CM對HPV18 HeLa細胞活性與增殖檢測

1. MSC-CM的制備

將1×106的MSC（F3代）接種于培養(yǎng)瓶中，待12 h細胞貼壁后，采用無血清DMEM/F12饑餓培養(yǎng)72 h，并收集其培養(yǎng)上清，300×g、離心10 min后，將上清通過針筒式濾膜過濾器（0.22 μm，水系）過濾得到MSC培養(yǎng)上清，并用磷酸鹽緩沖液（PBS）和DMEM培養(yǎng)液將MSC培養(yǎng)上清配制成濃度為0%、20%以及60%的MSC-CM。

2. CCK-8實驗

將4×103個/孔的HPV18 HeLa細胞接種于96孔板中，設(shè)置空白組、低劑量組和高劑量組，每組設(shè)置5個重復(fù)實驗孔，分別加入0%、20%和60% 的MSC-CM培養(yǎng)，48 h后通過CCK-8試劑盒對HeLa細胞的活力進行測定，對各組吸光度（OD）值進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗采用至少3批不同批次的MSC，且每批次實驗至少重復(fù)3次。

3. 細胞集落形成實驗

取對數(shù)生長期細胞HPV18 HeLa細胞，胰蛋白酶消化制備單細胞懸液，設(shè)置空白組、低劑量組和高劑量組，細胞以 800個/孔接種于6孔板中，待細胞培養(yǎng)12 h貼壁后，分別加入0%、20%和60%的 MSC-CM，每組細胞各設(shè)5個重復(fù)孔，以37℃、5% CO2培養(yǎng)7 ～ 9 d后，PBS 沖洗1次，用甲醇固定 20 min，結(jié)晶紫染色 15 min，拍照，并計數(shù)集落數(shù)，進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗采用不同批次的MSC，且每批次實驗至少重復(fù) 3 次。

4. 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

設(shè)置空白組、低劑量組和高劑量組，分別使用0%、20%和60%的MSC-CM處理HPV18 HeLa細胞，48 h后收集3組的細胞樣品制備細胞懸液，然后各加入100 μl結(jié)合緩沖液重懸細胞，再向細胞懸液中加入FITC標(biāo)記的Annexin V和PI各5 μl，混勻后避光孵育 30 min，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗采用不同批次的MSC，且每批次的實驗至少重復(fù)3次，每組收集5份重復(fù)樣本。

5. qRT-PCR探索MSC促進HeLa細胞凋亡的凋亡基因差異

按前述實驗方案準(zhǔn)備0%、20%和60% MSC-CM處理48 h的HPV18 HeLa細胞樣品，即空白組、低劑量組和高劑量組的HPV18 HeLa細胞樣品，依據(jù)天根生物科技公司提供的試劑盒說明書提取細胞總RNA，并利用qRT-PCR檢測凋亡相關(guān)分子p53、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、Caspase-9、Bax、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）的表達，并通過2-??Ct法進行相對定量分析，評價在不同濃度的MSC-CM下HPV18 HeLa細胞凋亡的比例。實驗采用3批以上不同批次的MSC且每批次實驗至少重復(fù)3次。實驗中所涉及的基因?qū)?yīng)的引物序列如表1所示。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 8.0.2進行作圖。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以進行描述，2組數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗;多組數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、MSC-CM對HPV18 HeLa細胞活力與增殖的影響

依次以0%、20%和60%的MSC-CM分別處理3組HPV18 HeLa細胞48 h后，高劑量組和低劑量組的HPV18 HeLa細胞的OD值均低于空白組（P均< 0.05），且高劑量組的OD值低于低劑量組（P < 0.05）。另外，高劑量組和低劑量組的HPV18 HeLa細胞的克隆形成能力明顯比空白組降低（P均< 0.05），而且高劑量組的克隆形成數(shù)少于低劑量組（P < 0.05），見表2、圖1。

二、MSC-CM對HPV18 HeLa細胞凋亡的影響。

低劑量組和高劑量組的HPV18 HeLa細胞的凋亡率分別為（8.41±3.52）%和（31.80±9.58）%，均高于空白組（0.19±0.01）%（P均< 0.05）。高劑量組的HPV18 HeLa細胞凋亡率高于低劑量組（P < 0.05），見表3、圖2。

三、MSC通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因mRNA表達促進HPV18 HeLa細胞的凋亡

低劑量組和高劑量組的HPV18 HeLa細胞中，p53、Caspase-3、Caspase-9以及Bax mRNA相對表達量均高于空白組（P均< 0.05），而Bcl-2的mRNA相對表達量均低于空白組（P均< 0.05），且高劑量組的作用效果比低劑量組更明顯（P均< 0.05），見圖3。

討論

人臍帶來源的MSC是典型的低分化多能干細胞之一，與骨髓MSC、脂肪MSC、人羊膜來源的MSC等相比，具有更低免疫原性，而且新生兒臍帶來源豐富，人臍帶來源的MSC在體外更容易擴增，更容易推廣其臨床應(yīng)用[2]。MSC有定向歸巢的特性，即定向遷移到機體發(fā)生損傷或炎癥的組織，而人體內(nèi)的腫瘤，被稱為“過度愈合”的傷口。研究表明，MSC會被腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞分泌的細胞因子吸引到腫瘤基質(zhì)[10]。所以MSC對腫瘤組織具有很強的定向遷移的能力，即MSC的腫瘤歸巢性。這為MSC靶向治療腫瘤或MSC作為藥物載體治療腫瘤，提供了廣闊的應(yīng)用前景。

MSC的抗腫瘤作用在肝癌、卵巢癌和乳腺癌等方面得到驗證[11-13]。Qiao等（2004年）報道，人MSC的抗腫瘤發(fā)生作用是通過MSC的旁分泌作用實現(xiàn)的[14]。所以本研究提取MSC的培養(yǎng)上清，制備MSC-CM，初步探索MSC-CM對HPV18 HeLa細胞的影響，并揭示其中的分子機制。結(jié)果顯示，在MSC-CM的作用下，HPV18 HeLa細胞的生長受到影響，這為人臍帶MSC在HPV所致的子宮頸病變以及子宮頸癌的治療提供了可靠的實驗證據(jù)。同時，子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與持續(xù)數(shù)年的HPV慢性感染密切相關(guān)[14]。研究顯示，HPV誘導(dǎo)子宮頸癌的中心環(huán)節(jié)就是E6與p53之間的相互作用，p53的失活是導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化的主要原因[15]。Chen等（2014年）研究顯示，HPV的遺傳序列整合入子宮頸上皮細胞后，HPV 編碼的E6蛋白，可與P53蛋白結(jié)合，從而導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定性增加，阻礙細胞的自發(fā)性凋亡，最終導(dǎo)致細胞永生化[17]。除此之外，Bcl-2蛋白家族在細胞程序性死亡中起著非常重要的作用。Bcl-2蛋白家族主要通過改變線粒體外膜通透性從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。在Bcl-2家族中，Bax通過寡聚化在線粒體外膜形成孔道，改變線粒體的通透性，使線粒體內(nèi)容物釋放，引發(fā)細胞內(nèi)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，如細胞色素C從線粒體釋放后，可與Caspase-9組成凋亡體，使Caspase-3的表達上調(diào)，從而誘導(dǎo)細胞凋亡，因此Caspase-3、Caspase-9和Bax基因也被稱為促凋亡基因，然而Bcl-2則可阻斷上述通路，抑制Bax的促凋亡進程，Bcl-2也因此被稱為抗凋亡基因[16]。本研究通過qRT-PCR實驗證實，MSC能有效上調(diào)p53、Caspase-3、Caspase-9和Bax等促凋亡基因的表達，而且有效抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達，從而促進HPV18 HeLa細胞的凋亡。

綜上所述，人臍帶MSC通過旁分泌作用上調(diào)p53、Caspase-3、Caspase-9和Bax等促凋亡基因的表達，而且有效抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達，從而促進HPV18 HeLa細胞的凋亡，為MSC治療HPV感染相關(guān)的癌癥病變提供新思路。然而MSC在其他類型HPV所導(dǎo)致的癌癥病變中的作用，仍需進一步深入探討，以期為MSC對HPV的防治應(yīng)用提供更科學(xué)的依據(jù)。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-11-05）

（本文編輯：林燕薇）