方嫻 姜雪嬌 侯偉欣 房鵬 張秋云

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是在引起急性肝損傷誘因的作用下，肝功能相對穩(wěn)定的慢性肝病患者急速惡化并發(fā)生肝衰竭的綜合征[1]。該病目前沒有特異性治療手段，臨床上多以抗病毒、人工肝支持治療，療效不理想，短期病死率為50%～90%[2]。肝移植是目前唯一能提高患者長期生存率的手段，但由于肝源嚴(yán)重不足，故使用受限。ACLF的發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為可能與肝細(xì)胞大量凋亡和肝細(xì)胞再生障礙不足有關(guān)[3]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，ACLF患者肝臟中缺乏有效的肝細(xì)胞復(fù)制是其死亡率較高的原因之一[4]，ACLF中肝祖細(xì)胞(hepatic progenitor cell，HPC)的激活能誘導(dǎo)肝臟進(jìn)行再生二級反應(yīng)，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖，改善肝臟損傷，避免ACLF進(jìn)一步惡化[5]。因此恢復(fù)肝臟的正常再生能力在急性發(fā)作期肝衰竭的治療中具有廣闊的前景。截?cái)嗄嫱旆绞怯扇珖嗅t(yī)錢英教授創(chuàng)制的臨床治療ACLF的有效方劑，本課題組前期研究結(jié)果提示：本方能減輕ACLF模型大鼠肝組織炎性損傷、抑制肝細(xì)胞過度凋亡，并能預(yù)防給藥后促進(jìn)肝細(xì)胞代償性增殖[6-7]。本研究在此基礎(chǔ)上觀察截?cái)嗄嫱旆綄CLF大鼠肝功能、凝血酶原活動度及肝臟病理的改善情況，考察肝細(xì)胞再生過程中的關(guān)鍵基因cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)、CDK6及關(guān)鍵蛋白DP1表達(dá)量的影響，進(jìn)一步探討證核該方通過調(diào)節(jié)cyclinD-E2F1肝細(xì)胞增殖通路相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子治療ACLF大鼠肝損傷及修復(fù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選用SPF級Wistar雄性大鼠105只，體重(180±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證編號SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)置首都醫(yī)科大學(xué)動物房，相對恒溫(25℃)，恒濕(55%)，每隔12小時光照明暗交替，每籠3只，自由攝食飲水。

1.2 干預(yù)治療藥物與主要試劑

截?cái)嗄嫱旆?組成：苦味葉下珠30 g、瓜蔞30 g、金錢草30 g、黃芪30 g、槲寄生30 g、三七6 g、生地黃20 g、莪術(shù)6 g、丹參20 g、炮附子先煎15 g)購于北京同仁堂中醫(yī)醫(yī)院中藥房，根據(jù)課題組前期研究，水煎及濃縮至4.34 g/mL，保存于滅菌玻璃瓶內(nèi)，4℃冰箱保存，使用前水浴加熱。

人血清白蛋白(貨號：A9731-5G,美國，Sigma)；D-氨基半乳糖(貨號：G0500-25G,美國，Sigma)；脂多糖(貨號：109K4075，美國，Sigma)；Anti-DP1(美國，abcam)；β-actin(美國，abcam)；RNA Prep Pure動物組織總RNA提取試劑盒、TIAN Script cDNA、Real Master Mix(SYBR Green)均購于天根生化科技有限公司；引物序列cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3、CDK4、CDK6(TaKaRa)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

低溫離心機(jī)(Hettich，Universal 320R)；全自動多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3，美國Thermo)；梯度RT PCR儀(Bio-Rad，美國)；垂直電泳儀(Bio-Rad，美國)；Fujifilm成像系統(tǒng)(LAS3000，日本)；超細(xì)勻漿器(Fluko，F(xiàn)6/10)；高速離心機(jī)(Sigma，1-14，美國)；全自動生化分析儀(Hitachi，7600)；凝血分析儀(Beckman Coulter，ACL-TOP700)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組、ACLF大鼠模型的建立及給藥 隨機(jī)選擇5只大鼠作為正常組，其余100只Wistar大鼠根據(jù)文獻(xiàn)[8]方法建立ACLF大鼠模型，予皮下注射人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)0.5 mL，4次后眼眶采血檢測是否致敏，取人血白蛋白抗體陽性大鼠予尾靜脈注射HSA，每只0.5 mL，一周兩次，連續(xù)注射6周，正常組每次予等量生理鹽水注射。隨后對100只造模組大鼠行肝活檢，取肝纖維化Ⅲ級以上大鼠繼續(xù)尾靜脈注射，2周后肝硬化模型成功60只。將60只同時予以D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)(400 mg/kg)聯(lián)合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(100 μg/kg)腹腔注射，死亡30只，最終ACLF大鼠成模30只。將30只成模大鼠分為截?cái)嗄嫱旆?、10、15天組及模型5、10、15天組，每組5只。截?cái)嗄嫱旆浇M在成模24小時后予截?cái)嗄嫱旆綕饧鍎┻B續(xù)灌胃5、10、15天，1次/天，依照課題組前期研究將給藥體積定為5 mL/kg，模型組與正常組予等量生理鹽水，各組灌胃后于5、10、15天分別平行摘取右葉統(tǒng)一部份置10%福爾馬林，其余肝組織剪碎于液氮中凍存，放入-80℃冰箱保存。

1.4.2 各組大鼠血漿凝血酶原活動度(prothrombinase activity ,PTA)、血清肝功能檢測 大鼠腹主動脈取血12 mL，3 mL置于肝素鈉抗凝管內(nèi)，4℃，3000 r/min，離心20分鐘分離血漿，靜置1小時后于凝血分析儀檢測血漿PTA，上層血清置于10 mL真空采血管全自動生化分析儀測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total Bilirubin，TBIL)含量。

1.4.3 觀察肝組織病理改變 每組選擇5只大鼠取肝右葉相同部位組織，磷酸緩沖鹽溶液涮洗后放置10%福爾馬林溶液中固定12～24小時，進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色。Pannoramic scan全自動切片掃描儀進(jìn)行明場下全幅圖像掃描，利用CaseViewer2.3導(dǎo)出圖片，觀察各組大鼠肝組織的結(jié)構(gòu)和病理改變。

1.4.4 Real-Time PCR法檢測cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3、CDK4、CDK6 mRNA的表達(dá) 根據(jù)動物組織總RNA提取試劑盒的說明書驟將肝組織稱量、裂解、研磨提取總RNA。取2 μL樣品在酶標(biāo)儀上檢測其純度及濃度，保留A260/A280在1.8～2.2的樣品繼續(xù)逆轉(zhuǎn)錄，方法依照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行。將逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA作為擴(kuò)增模板，在反應(yīng)體系中加入所得目的基因cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3、CDK4、CDK6和內(nèi)參對照基因β-actin的引物，在反應(yīng)條件為95℃(15分鐘)、95℃(10秒)、60℃(20秒)、72℃(30秒)下循環(huán)40次進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。將該模板和內(nèi)參的CT值拷貝并存為線性關(guān)系，數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。各基因引物序列，詳見表1。

表1 各基因引物序列

1.4.5 蛋白免疫印跡法檢測各組組織DP1蛋白表達(dá) -80℃冰箱取出肝組織，按比例加入配制好的蛋白裂解液(由蛋白提取液、蛋白酶抑制劑、PMSF按比例混合)，充分勻漿。30分鐘后，4℃，12000 r/min離心15分鐘取上清液，按照BCA蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量，并測定蛋白濃度，水浴至蛋白變性。每支取30 μg上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1小時，一抗(1∶100)4℃過夜，TBST洗膜后，二抗(1∶10000)室溫孵育1小時，洗膜后顯影成像，Image J計(jì)算灰度值比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 截?cái)嗄嫱旆綄Ω鹘M大鼠血漿PTA檢測結(jié)果比較

結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠血漿PTA隨時間演進(jìn)明顯降低，且有顯著差異(P<0.01)，在15天時達(dá)到最低點(diǎn)。與同一時間模型組相較，截?cái)嗄嫱旆浇M大鼠血漿PTA均有上調(diào)趨勢，且截?cái)嗄嫱旆?0天、15天組差異明顯(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 截?cái)嗄嫱旆綄Ω鹘M大鼠血漿PTA結(jié)果比較

2.2 截?cái)嗄嫱旆綄Ω鹘M大鼠血清肝功能檢測結(jié)果比較

結(jié)果顯示，與正常組相較，模型組大鼠血清肝功能ALT、AST、TBIL隨時間進(jìn)展顯著升高(P<0.01)，符合ACLF大鼠模型表現(xiàn)。與同一時間模型組相較，截?cái)嗄嫱旆浇M血清ALT、AST、TBIL均有不同程度下調(diào)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表3。

表3 截?cái)嗄嫱旆綄Ω鹘M大鼠血清肝功能結(jié)果比較

2.3 截?cái)嗄嫱旆綄Ω鹘M大鼠肝組織HE染色病理的影響

正常組大鼠肝臟組織 HE 染色顯示肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，匯管區(qū)形態(tài)完整，肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核居中，未見炎細(xì)胞浸潤和間質(zhì)反應(yīng)性增生。模型5天組大鼠肝組織可見匯管區(qū)纖維組織增生，肝細(xì)胞胞漿疏松化氣球樣變，肝竇受壓變窄，門管區(qū)和肝小葉內(nèi)有不同程度的炎細(xì)胞浸潤和嗜酸性小體形成，且肝細(xì)胞壞死灶隨時間延長范圍逐漸擴(kuò)大。模型10天組可見點(diǎn)狀、碎屑狀壞死，庫普弗細(xì)胞增生。模型15天組可見彌漫性大塊壞死，纖維組織將肝小葉分割包繞成假小葉，纖維間隔變寬且薄厚不均，網(wǎng)狀纖維支架塌陷。與同一時間點(diǎn)模型組相比，截?cái)嗄嫱品浇M肝組織損傷程度較輕，截?cái)嗄嫱旆?0天組可見壞死細(xì)胞鄰近有再生的肝細(xì)胞，核大且染色較深，假小葉內(nèi)細(xì)胞排列較規(guī)則。截?cái)嗄嫱旆?5天組可見大面積的肝細(xì)胞溶解但網(wǎng)狀纖維支架尚存。見圖1。

2.4 截?cái)嗄嫱旆綄Ω鹘M大鼠肝組織中cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3、CDK4、CDK6 mRNA表達(dá)的影響

PCR檢測結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組5天組cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3、CDK4、CDK6 mRNA表達(dá)量升高，隨著時間的進(jìn)展，表達(dá)量逐漸降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與同一時間模型組相比，截?cái)嗄嫱旆浇Mcyclin D1、cyclin D2、cyclin D3、CDK4、CDK6 mRNA表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)，其中截?cái)嗄嫱旆?0天組差異最為顯著(P<0.01)，且截?cái)嗄嫱旆?5天組各基因表達(dá)量與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表4。

注：A:正常組；B:模型5天組；C:模型10天組；D模型15天組；E:截?cái)嗄嫱旆?天組；F:截?cái)嗄嫱旆?0天組；G:截?cái)嗄嫱旆?5天組。

表4 截?cái)嗄嫱旆綄Ω鹘M大鼠cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3、CDK4、CDK6 mRNA的相對表達(dá)量

2.5 截?cái)嗄嫱旆綄Ω鹘M大鼠肝組織中DP1蛋白表達(dá)的影響

蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，與正常組相較，模型5天組DP1蛋白表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨時間進(jìn)展模型組表達(dá)量呈逐漸降低趨勢。與同一時間點(diǎn)模型組相較，截?cái)嗄嫱旆?0天組DP1的表達(dá)量明顯上調(diào) (P<0.05)，截?cái)嗄嫱旆?5天組DP1的表達(dá)量較10天組有所降低，但與同一時間點(diǎn)的模型組比較差異仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表5、圖2。

注：A:正常組;B: 截?cái)嗄嫱旆?天組;C: 截?cái)嗄嫱旆?0天組;D:截?cái)嗄嫱旆?5天組;E:模型5天組;F:模型10天組;G:模型15天組。

表5 截?cái)嗄嫱旆綄Ω鹘M大鼠DP1蛋白相對表達(dá)量灰度值比較

3 討論

ACLF發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前被認(rèn)為其與機(jī)體內(nèi)的特殊的免疫、炎癥反應(yīng)，免疫系統(tǒng)失衡等相關(guān)，受到損傷的肝細(xì)胞釋放損傷相關(guān)模式分子，進(jìn)一步釋放促炎癥因子等因素，造成肝臟過度的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞的過度凋亡[9]。但慢加急性肝衰竭具有潛在可逆性，有研究表明肝祖細(xì)胞與星狀細(xì)胞存在顯著相關(guān)性，具有干細(xì)胞功能所需的信號傳導(dǎo)途徑，可誘導(dǎo)肝細(xì)胞再生，逆轉(zhuǎn)ACLF惡化[10]。

全國名中醫(yī)錢英教授認(rèn)為：ACLF的中醫(yī)病機(jī)多為“濕熱疫毒”損傷機(jī)體，充斥三焦，氣機(jī)不暢，久則生瘀，肝絡(luò)瘀阻，正虛邪陷，具有“毒瘀與正虛交織”的特點(diǎn)，并創(chuàng)立了截?cái)嗄嫱旆絒11]，意在清熱祛濕、解毒散瘀以治標(biāo)，調(diào)補(bǔ)肝脾腎以治本，扶正與祛邪并用，同調(diào)肝體與肝用。方中生黃芪、槲寄生補(bǔ)氣益衛(wèi)，滋補(bǔ)肝腎，顧護(hù)正氣，提高機(jī)體免疫力，從而激發(fā)肝細(xì)胞再生復(fù)制；苦味葉下珠、瓜蔞、金錢草具有抗病毒、抗炎等作用，可有效降低ALT、AST水平，保護(hù)肝細(xì)胞膜正常流動性與完整性[12-13]，從而起到保肝功效；丹參、莪術(shù)可化瘀通絡(luò)，改善外周循環(huán)，具有調(diào)節(jié)組織恢復(fù)與再生能力[14]；三七、生地、黑附片可以調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫，調(diào)補(bǔ)陰陽，補(bǔ)腎以調(diào)肝，幫助恢復(fù)肝組織形態(tài)及功能。

既往研究表明，肝臟細(xì)胞在處于非病理狀態(tài)下為靜止期(G0)。細(xì)胞周期中的第一個間隔期(G1)為確定細(xì)胞是否要啟動DNA復(fù)制的關(guān)鍵期。cyclin D作為G1期調(diào)節(jié)因子可成為生長因子的靶標(biāo)，它依賴于細(xì)胞外信號進(jìn)行表達(dá)，可將細(xì)胞外的信號整合到核心細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑中，并激活CDK4/6，形成cyclin D-CDK復(fù)合物,誘導(dǎo)細(xì)胞過渡至S期。且cyclin D為不穩(wěn)定蛋白(半衰期約10～20分鐘)，當(dāng)細(xì)胞受到生長因子刺激時，cyclin D的表達(dá)才能得以維持[15-16]。cyclin D由三個不同但密切相關(guān)的亞家族(D1，D2和D3)組成，每種D型細(xì)胞周期蛋白都可以激活CDK4和CDK6，D2和D3也可以與CDK2功能性相互作用，且D1和D2基因的啟動子包含典型的E2F家族識別位點(diǎn)[17]。當(dāng)細(xì)胞被提示進(jìn)入增殖期時，cyclin D-CDK4與cyclin D -CDK6復(fù)合物的最重要功能是在G1中期至晚期磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)，并中和pRb的抗增殖活性[18]，同時隔離p27(CDK抑制劑)。在靜止期時DP1-E2F DNA異二聚體與pRb結(jié)合處于轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài)，cyclin D-CDK4/6復(fù)合物在磷酸化pRB的同時，DP1-E2F異二聚體的轉(zhuǎn)錄活性得以釋放，成功誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入S期[19]?？梢哉f，E2F1增殖通路介導(dǎo)的cyclin D-CDK4/6復(fù)合物釋放DP1轉(zhuǎn)錄因子引發(fā)了肝細(xì)胞從G1期過渡到S期特異性轉(zhuǎn)錄模式的分子開關(guān)，啟動了肝細(xì)胞再生復(fù)制。

本研究結(jié)果顯示：在療效評價指標(biāo)方面，與同一時間模型組大鼠相較，各治療組大鼠ALT、AST、TBIL顯著下降，PTA明顯升高；肝組織HE染色病理觀察，可見炎細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞壞死情況均較輕，雖然有間質(zhì)反應(yīng)性增生和假小葉形成，但網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)尚存，有利于肝細(xì)胞復(fù)制及恢復(fù)組織形態(tài)及功能。在機(jī)制研究指標(biāo)方面，模型組5天時cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3 、DP1表達(dá)量較正常組明顯升高，但隨時間進(jìn)展，表達(dá)量逐漸降低，15天組表達(dá)量基本趨于正常組。截?cái)嗄嫱旆?0天、15天組cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3、CDK4、CDK6、DP1表達(dá)量較同一時間模型組均有不同程度上調(diào)(P<0.05)。推測其原因是因?yàn)橛捎诩毙怨艉蟾渭?xì)胞大量損傷，刺激肝細(xì)胞開始短暫的代償性增殖，但D型細(xì)胞周期蛋白為不穩(wěn)定蛋白，在缺乏生長因子的長期刺激下，cyclin D逐漸降低表達(dá)，減緩釋放E2F家族蛋白DP1，細(xì)胞周期停滯。此時肝細(xì)胞代償增殖的能力不足于抵抗肝細(xì)胞過度凋亡則會導(dǎo)致肝衰竭。有研究表明cyclin D-CDK4/6復(fù)合物的活性首先在G1中期被檢測到，在G1/S轉(zhuǎn)變附近達(dá)到最大值，并在增殖細(xì)胞中保持高值[20]。因此截?cái)嗄嫱旆?0天、15天組各轉(zhuǎn)錄因子的高表達(dá)表明截?cái)嗄嫱旆竭B續(xù)給藥能加快ACLF大鼠肝細(xì)胞從G1期向S期的過渡，幫助肝細(xì)胞進(jìn)入持續(xù)增殖狀態(tài)從而扭轉(zhuǎn)肝衰竭的進(jìn)程。截?cái)嗄嫱旆浇M方較為復(fù)雜，有效藥理成分尚不完全清楚，推測其作用可能與該方刺激D型周期蛋白上游生長因子有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

綜上，截?cái)嗄嫱旆娇赏ㄟ^上調(diào)cyclin D-E2F1信號通路上cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3、CDK4、CDK6基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄因子DP1表達(dá)量，加速肝細(xì)胞再生復(fù)制，保持持續(xù)穩(wěn)定的增殖，從而改善肝功能，減輕凝血障礙，扭轉(zhuǎn)肝衰竭進(jìn)程，為臨床推廣運(yùn)用該方提供了新的理論依據(jù)。