趙紅舟 龍杞 劉肇恒 顧瀟楓 龐慶祿 焦揚(yáng)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性、炎癥性、間質(zhì)性肺疾病，具有進(jìn)行性、不可逆轉(zhuǎn)和致死性的特點(diǎn)。IPF在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率正在逐年增加，從診斷到死亡的平均生存時(shí)間只有2～3年[1]，5年內(nèi)的生存率不到40%[2]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)吡非尼酮和尼達(dá)尼布等抗纖維化藥物在改善IPF患者癥狀和延緩肺功能下降等方面具有一定作用，但是此類藥物價(jià)格昂貴，而且其安全性尚未得到充分證明[3]。因此，研究IPF的發(fā)病機(jī)制和治療方法，對(duì)于指導(dǎo)臨床具有重要的意義。一般認(rèn)為，特發(fā)性肺纖維化的形成機(jī)制包括肺泡上皮細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等，并在此基礎(chǔ)上釋放細(xì)胞因子等活性物質(zhì)，刺激肌成纖維細(xì)胞增殖分化，促使肺成纖維細(xì)胞灶形成和膠原沉積，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的大量合成，最終導(dǎo)致IPF[4]。

五味子為木蘭科五味子的干燥成熟果實(shí)，其皮肉甘酸，核中苦辛，皆有咸味，五味具備，故名之?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明五味子的成分主要源于木脂素類化合物，其中五味子乙素(Schisandrin B, Sch B)含量最高，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，它具有保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保肝等多種藥理作用[5-8]。眾多實(shí)驗(yàn)表明其能夠升高細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)水平，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少乳酸脫氫酶、丙二醛和活性氧的釋放，并可直接清除自由基，發(fā)揮抗氧化作用[9]。通過文獻(xiàn)整理回顧近年來關(guān)于五味子乙素對(duì)肺纖維化的基礎(chǔ)研究可以發(fā)現(xiàn)，多是集中在從抗炎機(jī)制和抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1蛋白通路等角度為切入點(diǎn)，對(duì)于其抗氧化機(jī)制的干預(yù)研究未曾探討。本實(shí)驗(yàn)從分析肺組織染色結(jié)果，以及相關(guān)的纖維化、氧化及抗氧化指標(biāo)水平的改變，研究五味子乙素對(duì)博來霉素所致的小鼠肺纖維化的干預(yù)作用，從氧化應(yīng)激與抗氧化的角度探討五味子乙素治療肺間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

C57BL6雄性小鼠24只，體重(20±2)g，購(gòu)于北京維通利華動(dòng)物技術(shù)公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0001。Sch-B(成都曼斯特生物科技有限公司，純度>98%)、注射用鹽酸博來霉素(Fresenius Kabi 6115292)、異丙醇(國(guó)藥40064360)、無水乙醇(國(guó)藥10009218)、TRIZOL(Invitrogen 10296028)、DEPC(MDL MD911875)、超純瓊脂糖(ABI-invitrogen 16500100)、SuperScript III Rt 逆轉(zhuǎn)錄儀(ABI-invitrogen 11752050)、SOD熒光定量PCR試劑盒(ABI-invitrogen 4472920)、血紅素氧合酶(Heme oxygenase，HO-1)熒光定量PCR試劑盒(ABI-invitrogen 4472920)、羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)的含量 Elisa試劑盒(Dogesce DG94697Q-96T)、血8-異前列腺素(8- Isoprostaglandin，8-iso-PGF) Elisa試劑盒(Dogesce DG94697Q-96T)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(THERMO LEGEND MICRO 21R)、分光光度計(jì)(THERMO Nanodrop lite)、移液器(Eppendorf)、熒光定量PCR儀(Applied biosystems Step One Software)、電泳儀(biorad Eps 300)、凝膠成像儀(biorad 2500)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法

根據(jù)體重將24只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和Sch-B組，每組8只，先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后在異氟烷麻醉的情況下，向模型組和Sch-B組小鼠氣管內(nèi)滴入1 mL博來霉素稀釋液(含Bleo2.5 u)造模，空白組用同法滴入等量的0.9%氯化鈉注射液。造模后第1天空白組和模型組小鼠每天按(0.01 mL/g)體重灌胃給予0.9%氯化鈉注射液，Sch-B組小鼠每天按(100 mg/kg)體重灌胃給藥，并測(cè)量體重變化，隨時(shí)調(diào)整給藥劑量，觀察各組小鼠的精神及活動(dòng)狀態(tài)，14天后頸椎脫臼處死小鼠，每組隨機(jī)抽取三只小鼠取其左肺制作石蠟切片，用于HE和Masson染色并進(jìn)行鏡下觀察；其余肺組織于液氮中速凍后存于-80℃冰箱中，進(jìn)行PCR和Elisa測(cè)定。

1.3 肺組織病理學(xué)觀察

1.3.1 HE染色觀察肺組織炎性程度 先將組織樣本進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，隨后將組織切片放入載玻片上用40℃溫水浸泡，隨后將切片先后放入二甲苯和無水乙醇中浸泡10分鐘，再將其置于85%的乙醇中浸泡5分鐘，待充分水化后將組織樣本切片用PBS溶液浸泡清洗，再用移液法吸取蘇木素染色液，每個(gè)組織切片滴加100 μL，充分染色10分鐘，。用1%的鹽酸乙醇將組織切片分化，然后用雙蒸水將組織切片沖洗干凈。將促藍(lán)液加入組織切片中，反藍(lán)結(jié)束后先用清水進(jìn)行清洗。向組織樣本切片中加入伊紅染液3分鐘，染色完畢后，將組織切片分別用濃度為80%、95%以及無水乙醇進(jìn)行梯度脫水。將脫水后的組織樣本切片使用二甲苯浸泡8分鐘，使用中性樹膠封片，行顯微鏡下觀察。肺泡炎性分級(jí)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Szapiel等方法[10]：0級(jí)：無肺泡炎，記0分；1級(jí)：輕度肺泡炎，鏡下觀察可見肺泡隔浸潤(rùn)增厚，但病變范圍不超過全肺20%，肺泡結(jié)構(gòu)未見明顯改變，記1分；2級(jí)：中度肺泡炎，肺泡炎癥病變面積占全肺的20%～50%，肺泡結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，記2分；3級(jí)：重度肺泡炎，病變范圍超過全肺面積的50%，肺泡腔可見炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞，記3分。

1.3.2 Masson染色觀察肺組織纖維化程度 先將組織樣本進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，再用4%多聚甲醛固定切片，脫蠟后入重鉻酸鉀—醋酸液1小時(shí)，水洗后染Regaud氏蘇木素10分鐘，再次充分水洗后，用2%鹽酸酒精分化，流水沖洗至藍(lán)黑色，加入1%麗春紅酸性品紅液染色5分鐘；隨后用蒸餾水進(jìn)行水洗，加入1%磷鉬酸水溶液媒染5分鐘；然后入1%醋酸液分色1分鐘，最后進(jìn)行脫水處理并用中性樹膠封固，行鏡下組織觀察。用Image-J軟件對(duì)Masson染色結(jié)果進(jìn)行圖像處理分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野(×200)，評(píng)價(jià)肺纖維化程度，肺纖維化百分比=肺纖維化面積/肺組織面積×100%。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)SOD、HO-1

取100 mg右肺組織加入1 mL的Trizol，電動(dòng)勻漿，冰上反應(yīng)30分鐘后轉(zhuǎn)移到1.5 mL無菌無酶EP管中。按照哺乳動(dòng)物蛋白R(shí)NA提取試劑盒說明書提取各組總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR一步法熒光定量PCR試劑盒定量分析HO-1、SOD的表達(dá)。計(jì)算出樣品的△CT值，以比較域值法將其與同一樣本內(nèi)參基因β-actin的△CT值做相應(yīng)對(duì)比。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定8-iso-PGF、HYP

先在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 μL，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測(cè)樣品10 μL。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，輕輕晃動(dòng)混勻。再用封板膜封板后置37℃溫育約30分鐘，將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用，然后揭掉封板膜，棄去液體，甩干后每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次后拍干。每孔分別加入顯色劑A50 μL和顯色劑B50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色約10分鐘，再加入終止液50 μL。以空白空調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織HE染色炎癥評(píng)分比較

空白組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔正常，無明顯水腫、炎癥或纖維化的表現(xiàn)；與空白組相比，模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡腔萎縮消失，肺泡間隔明顯增厚，部分肺間質(zhì)被纖維細(xì)胞替代，有明顯的肺間質(zhì)纖維化形成，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡炎癥評(píng)分相比空白組明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，Sch-B組小鼠肺泡破壞和間隔增厚程度較輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，肺間質(zhì)纖維化程度較輕，肺泡結(jié)構(gòu)破壞程度和炎癥程度明顯減輕(P<0.01)，但Sch-B組的炎癥程度和纖維化程度明顯高于空白組(P<0.01)。見表1、圖1。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色情況(×200)

2.2 各組小鼠肺組織Masson染色纖維化定量分析

空白組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)正常，藍(lán)染區(qū)域較少；與空白組相比，模型組小鼠的肺組織肺泡結(jié)構(gòu)明顯被破壞，伴有肺泡融合，肺間質(zhì)、支氣管壁和肺泡隔被藍(lán)染區(qū)域的面積明顯增加，間質(zhì)膠原增生沉積呈彌漫性、片狀、束狀樣改變，有明顯的膠原纖維形成，肺纖維化程度明顯(P<0.01)；與模型組相比，Sch-B組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)破壞程度較輕，肺間質(zhì)、支氣管壁和肺泡隔被藍(lán)染區(qū)域的面積有所減少，膠原纖維的形成和膠原沉積面積均減少(P<0.01)，但Sch-B組的膠原沉積面積明顯高于空白組(P<0.01)。見下表1、圖2。

圖2 各組小鼠肺組織Masson染色情況(×200)

表1 各組小鼠肺泡炎性評(píng)分和肺纖維化面積百分比比較

2.3 各組小鼠SOD和HO-1水平測(cè)定結(jié)果

與空白組小鼠相比，模型組小鼠SOD和HO-1水平均明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，Sch-B組小鼠SOD和HO-1水平均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與空白組小鼠相比降低均不明顯(P>0.05)，表明五味子乙素可以提高SOD和HO-1水平，具有抗氧化的作用，經(jīng)干預(yù)后，Sch-B組小鼠的SOD含量和HO-1的相對(duì)表達(dá)量基本恢復(fù)至對(duì)照組水平。見表2。

表2 各組小鼠肺SOD和HO-1水平比較

2.4 各組小鼠HYP和8-iso-PGF水平測(cè)定結(jié)果

與空白組小鼠相比，模型組小鼠HYP水平明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，Sch-B組小鼠HYP水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明五味子乙素能顯著抑制HYP的合成，減少肺間質(zhì)膠原的形成，從而減輕纖維化的程度，但Sch-B組與空白組相比HYP水平明顯升高(P<0.01)。與空白組小鼠相比，模型組小鼠8-iso-PGF水平明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，Sch-B組小鼠8-iso-PGF水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明五味子乙素能減少8-iso-PGF的含量，從而減輕氧化反應(yīng)的程度,但Sch-B組與空白組相比8-iso-PGF水平明顯升高(P<0.01)。見下表3。

表3 各組小鼠HYP和8-iso-PGF水平比較

3 討論

目前研究認(rèn)為肺纖維化的形成過程與肺泡上皮細(xì)胞的損傷有關(guān)，在氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等基礎(chǔ)之上，大量的細(xì)胞因子等活性物質(zhì)被釋放，刺激肌成纖維細(xì)胞的增殖和分化，促使肺成纖維細(xì)胞灶形成和膠原蛋白沉積，然后大量合成ECM，最終形成IPF[11]。其中氧化與抗氧化關(guān)系的失衡通常被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)氧化損傷進(jìn)而導(dǎo)致肺纖維化的重要因素之一[12]，活性氧的增加可引起氧化損傷,還能激活纖維化的相關(guān)信號(hào)通路，最終導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞異常增生、新生血管形成、細(xì)胞外膠原沉積等纖維化樣改變，機(jī)體內(nèi)的各種抗氧化大分子、小分子和酶的活性，可反映機(jī)體清除活性氧基團(tuán)及分子的能力，能客觀反映抗氧化能力的強(qiáng)弱。

SOD和HO-1分別反映了機(jī)體清除氧自由基和對(duì)組織氧化損傷的保護(hù)能力[9，13]，可通過抗氧化應(yīng)激的機(jī)制減輕肺組織纖維化，這種保護(hù)作用可能與通過抑制活性氧基團(tuán)及分子的產(chǎn)生、抑制促纖維化因子纖溶酶原激活物的表達(dá)有關(guān)，在延緩肺損傷、肺纖維化、肺腫瘤等肺部疾病的發(fā)病過程中有著重要的作用。HYP則直接反映肺纖維化的程度，肺間質(zhì)纖維化的特征表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)在肺組織內(nèi)的過多沉積，肺纖維化初期各種生物活性因子誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞合成、分泌大量膠原蛋白成分，使肺間質(zhì)膠原明顯增加，構(gòu)成了肺纖維化的病理學(xué)基礎(chǔ)，作為膠原特有成分的HYP可動(dòng)態(tài)反應(yīng)肺纖維化的病變進(jìn)展情況。8-iso-PGF是前列腺素的異構(gòu)體，是自由基對(duì)脂質(zhì)(如脂膜的不飽和脂肪酸)造成自由基損傷后的特定產(chǎn)物，有研究證明8-異前列腺素可通過凝血酶/前列腺TP受體誘導(dǎo)大鼠氣道高反應(yīng)性，是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激程度的生物學(xué)指標(biāo)[14-15]。

本研究的病理切片結(jié)果表明，與模型組相比，五味子乙素可以減輕小鼠肺泡炎癥程度和肺纖維化程度，表明其具有一定的抗纖維化作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示五味子乙素能明顯升高肺組織中SOD和HO-1水平、降低HYP和8-iso-PGF水平，表明其可能通過減輕氧化反應(yīng)和提高抗氧化水平的作用來發(fā)揮抗肺纖維化的作用。

周平安教授根據(jù)幾十年的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，認(rèn)為五味子在治療肺纖維化等方面有較好的療效，在此基礎(chǔ)上查閱文獻(xiàn)得知，其主要成分五味子乙素具有抗炎、抗氧化等多種藥理作用，此前關(guān)于五味子乙素的研究多是集中在肝纖維化、腎纖維化等方面，尚未從抗氧化的角度研究對(duì)肺纖維化的干預(yù)作用，因此，本課題組選用五味子乙素作為研究對(duì)象，探討其對(duì)肺纖維化的干預(yù)作用。

綜上所述，五味子乙素可能通過提高組織抗氧化水平、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制膠原纖維的合成，達(dá)到抑制和延緩肺纖維化進(jìn)展的目的，減輕肺纖維化的程度，深入研究其作用機(jī)制可為五味子的臨床應(yīng)用奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。