袁爍 陳敏紅 鄧高丕

中醫(yī)認(rèn)為輸卵管妊娠的發(fā)病機(jī)理與少腹素有瘀滯、沖任不暢、胞絡(luò)受阻、孕卵移行受到阻滯、不能順利進(jìn)入胞宮有關(guān)，故中醫(yī)對(duì)輸卵管妊娠的治療是以化瘀消癥殺胚為大法。宮外孕I號(hào)方(丹參、赤芍、桃仁)作為治療異位妊娠的方劑，從1956年開(kāi)始應(yīng)用于臨床[1]。研究團(tuán)隊(duì)在宮外孕I號(hào)方的基礎(chǔ)上，加上了從現(xiàn)代藥理研究角度對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞具有抑制作用的紫草[2]、天花粉[3]組成化瘀消癥復(fù)方。在前期開(kāi)展了一系列復(fù)方治療輸卵管妊娠的機(jī)制探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化瘀消癥復(fù)方可通過(guò)誘導(dǎo)FAS/FASL、Bcl-2/Bax凋亡通路[4-5]，促進(jìn)相關(guān)蛋白的表達(dá)增加，而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡程序；或通過(guò)對(duì)雌孕激素發(fā)揮拮抗作用[6]，對(duì)溶解輸卵管蛻膜、引起絨毛及蛻膜組織的性質(zhì)改變產(chǎn)生干擾；或通過(guò)干預(yù)細(xì)胞周期進(jìn)程，上調(diào)增殖抑制率[7]；或呈濃度、時(shí)間依賴性地影響FAK信號(hào)通路表達(dá)，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞遷移力[8]，進(jìn)而起到抑制滋養(yǎng)細(xì)胞活性，阻滯輸卵管妊娠進(jìn)展的目的。本實(shí)驗(yàn)基于前期研究基礎(chǔ)，著眼于PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，旨在探索化瘀消癥復(fù)方對(duì)輸卵管妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡、侵襲影響的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

化瘀消癥復(fù)方由紫草、天花粉、赤芍、丹參、桃仁各15 g組成，藥物購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部；甲氨蝶呤(廣東嶺南制藥有限公司；批號(hào)：472004)；LY294002(RE-Vectec；批號(hào)：WXBC0225V)；雷帕霉素(rapamycin,Rapa)(RB-sigma；批號(hào)：92M4616V)；胎牛血清(Biological Industries；批號(hào)：1435272)；DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibico；批號(hào)：8114362)；0.25%胰蛋白酶(Gibico；批號(hào)：1616025)；HBSS(1×)(Gibico；批號(hào)：C-0130)；Hanks(10×)(Sigma；批號(hào)：RNBC1413)；一抗p-AKT(R&D；批號(hào)：AF887)；一抗p-雷帕霉素靶蛋白(mammalian taget of rapamycin,mTOR)(Cell Signaling；批號(hào)：2983S)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(上海貝博生物公司；批號(hào)：BB130031)；Transwell板(Corning；批號(hào)：3422)；Matrigel膠(Corning；批號(hào)：354277)。

主要儀器：CO2培養(yǎng)箱：英國(guó) NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC 公司；低/高速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀：美國(guó) CELLOMETER 公司；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀：美國(guó) Beckman 公司；脫色搖床：海門市其林貝爾公司；倒置熒光顯微鏡：日本 Nikon EclipseTi-s；流式細(xì)胞儀：美國(guó) Beckman 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

手術(shù)中取輸卵管妊娠部位典型的絨毛組織，剪碎后進(jìn)行體外培養(yǎng)，差異貼壁法分離純化，傳代至第四代，進(jìn)行細(xì)胞鑒定，細(xì)胞抗波形蛋白(Vimentin)陰性，抗角蛋白(Cytokeratin 18，CK18)陽(yáng)性者為符合實(shí)驗(yàn)要求的滋養(yǎng)細(xì)胞[9]。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿25 cm2培養(yǎng)瓶底90%時(shí)傳代，用PBS清洗2次，加入1 mL 0.25%胰酶的消化液進(jìn)行消化，37℃孵育3～5分鐘，鏡下觀察90%以上細(xì)胞懸浮，吸出細(xì)胞懸浮液置于15 mL離心管中800 r/min離心5分鐘，棄上清。用含10%胎牛血清的DMEM/F12重懸，按1∶2比例接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 化瘀消癥復(fù)方及各組培養(yǎng)液制備

紫草、天花粉、赤芍、丹參、桃仁各15 g，取2 劑共150 g，加入8倍藥物體積純水，2次煮沸，過(guò)濾，將所得濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮。將復(fù)方水煎劑溶于無(wú)血清的 DMEM/F12，過(guò) 0.22 μm 濾膜。配成低劑量組2.5 mg/mL、中劑量組5 mg/mL、中藥高劑量組10 mg/mL的無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液。將甲氨蝶呤溶于無(wú)血清的DMEM/F12，過(guò)0.22 μm濾膜，配制成濃度為1 mg/mL的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液。將LY294002[胞磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidy linositol 3-kinase,PI3K)抑制劑]溶于無(wú)血清的 DMEM/F12，過(guò)0.22 μm濾膜，配制成濃度100 μmol/mL的無(wú)血清 DMEM 培養(yǎng)液。 將LY294002(PI3K抑制劑)溶于無(wú)血清的 DMEM/F12，過(guò)0.22 μm 濾膜，配制成濃度100 μmol/mL的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液。將Rapa(mTOR抑制劑)溶于無(wú)血清的DMEM/F12，過(guò)0.22 μm濾膜，配制成濃度300 μmol/mL的無(wú)血清 DMEM 培養(yǎng)液。以上培養(yǎng)液配置后置于-20℃保存。

1.4 分組與藥物干預(yù)方法

將滋養(yǎng)細(xì)胞分為空白組、中藥低、中、高劑量組、LY294002組和Rapa組?？瞻捉M：繼續(xù)予DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；中藥低、中、高劑量組：分別以2.5 mg/mL、 5 mg/mL、10 mg/mL的無(wú)血清 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)；西藥組：以甲氨蝶呤濃度為 1 mg/mL的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；LY294002組：以LY294002(PI3K抑制劑)濃度為100 μmol/mL的無(wú)血清 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)；Rapa組：以Rapa(mTOR抑制劑)濃度為300 μmol/mL的無(wú)血清 DMEM 培養(yǎng)液。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

6孔板細(xì)胞種植密度為 1×105細(xì)胞/孔，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%時(shí), 加入空白組、中藥低、中、高劑量組、西藥組、LY294002組、Rapa組的培養(yǎng)液各2.5 mL，培養(yǎng) 72小時(shí)。用 PBS 洗滌 2 次，加入適量胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞懸液，1000 r/min 4℃低溫離心 5分鐘，棄上清；加入預(yù)冷的 PBS 洗滌 2 次后每管加入 400 μL Binding Buffer 重懸后，加入 5 μL錨定蛋白 V-異硫氰酸熒光素(AnnexinV-FITC)，4℃避光孵育 15分鐘后加10 μL 碘化丙啶(PI) 4℃避光孵育15分鐘，混勻上流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.6 Transwell 體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

Matrigel基質(zhì)膠準(zhǔn)備，冰上操作鋪膠，將生長(zhǎng)為對(duì)數(shù)期的輸卵管妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞用胰酶消化，PBS稀釋成 5×105細(xì)胞/mL 的濃度，待用；于Transwell 板中的每個(gè)下室添加 DMEM/F12 培養(yǎng)液(含 10%胎牛血清)，加入空白組、中藥低、中、高劑量組、西藥組、LY294002組、Rapa組的培養(yǎng)液各2 mL，混合均勻，上室內(nèi)進(jìn)行接種，培養(yǎng)72小時(shí)后進(jìn)行固定、臺(tái)盼藍(lán)染色、細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測(cè)藥物與通路抑制劑對(duì)通路蛋白的影響

6孔板細(xì)胞種植密度為 1×105細(xì)胞/孔，加入空白組、中藥低、中、高劑量組、西藥組、LY294002組、Rapa組的培養(yǎng)液各2.5 mL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)72小時(shí)細(xì)胞，采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)每組細(xì)胞 p-Akt，p-mTOR蛋白的表達(dá)：上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜 (濕轉(zhuǎn)) 、封閉，加入一抗(1∶1000)，洗滌，加入二抗反應(yīng)，洗滌，配制ECL化學(xué)發(fā)光底物與膜共孵育1分鐘, 放入化學(xué)發(fā)光成像分析儀內(nèi), 自動(dòng)曝光, 洗片，灰度值分析，計(jì)算相對(duì)蛋白含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡率比較

與空白組對(duì)比，各組細(xì)胞凋亡率均上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥高劑量組較空白組、中藥低劑量組、中劑量組的細(xì)胞凋亡率上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈濃度依賴性。中藥高劑量組較西藥組的細(xì)胞凋亡率上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與LY294002組、Rapa組對(duì)比，中藥高劑量組的細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.2 各組細(xì)胞侵襲能力比較

與空白組對(duì)比，各組的過(guò)膜細(xì)胞數(shù)均減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥高劑量組較中藥低劑量、中劑量組過(guò)膜細(xì)胞數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈濃度依賴性。與西藥組、Rapa組對(duì)比，中藥高劑量組的過(guò)膜細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與LY294002組對(duì)比，中藥高劑量組的過(guò)膜細(xì)胞數(shù)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2、表2。

注：A：空白組； B：中藥低劑量組；C：中藥中劑量組；D：中藥高劑量組；E：西藥組；F：LY294002組；G：Rapa組。

注：A：空白組； B：中藥低劑量組；C：中藥中劑量組；D：中藥高劑量組；E：西藥組；F：LY294002組；G：Rapa組。

表2 各組細(xì)胞侵襲力比較

2.3 各組細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與空白組對(duì)比，各組的p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥高劑量組較中藥低、中劑量組，p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈濃度依賴性。與LY294002組對(duì)比，中藥高劑量組、西藥組細(xì)胞中 p-Akt 蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Rapa組對(duì)比，中藥高劑量組、西藥組p-mTOR蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；詳見(jiàn)圖3、表3。

注：A：空白組； B：中藥低劑量組；C：中藥中劑量組；D：中藥高劑量組；E：西藥組；F：LY294002組；G：Rapa組。

表3 各組磷酸化 Akt、mTOR蛋白比較

3 討論

妊娠時(shí)，由凋亡引起的程序化細(xì)胞死亡，對(duì)母胎界面的種植與蛻膜化意義重大，適度的細(xì)胞凋亡促進(jìn)了胚胎種植所需的血管形成，這種與凋亡相關(guān)的微妙變化，被認(rèn)為對(duì)胚胎的正常發(fā)育起到正向的促進(jìn)作用[10]。適度的調(diào)控是關(guān)鍵，若滋養(yǎng)細(xì)胞中關(guān)于凋亡與增殖的平衡遭到破壞，導(dǎo)致過(guò)度凋亡的發(fā)生，影響胚胎在著床部位的種植，可能是誘發(fā)流產(chǎn)增加的原因[11]。對(duì)輸卵管妊娠治療結(jié)局的期待，恰恰是與宮內(nèi)正常妊娠相反的。

輸卵管妊娠時(shí)，受精卵在非子宮體腔著床，絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)揮侵襲種植局部——輸卵管管壁的能力，種植場(chǎng)所同樣有細(xì)胞凋亡與增殖的發(fā)生。由于輸卵管的環(huán)境異于宮腔環(huán)境，凋亡調(diào)節(jié)的平衡狀態(tài)受到影響，比如抗凋亡蛋白的大量存在，導(dǎo)致不加控制的滋養(yǎng)細(xì)胞的存活、增殖[12]，加之輸卵管的管壁菲薄，對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞漸進(jìn)性的侵襲耐受性差，最終出現(xiàn)輸卵管管壁破裂，腹腔內(nèi)出血的結(jié)局。研究團(tuán)隊(duì)前期已對(duì)化瘀消癥復(fù)方的作用機(jī)制做出初步探索[4-9]，而PI3K/Akt/mT0R信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性是本實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是一條可調(diào)控眾多信號(hào)因子，與細(xì)胞增殖、分化、血管生成、胚胎發(fā)育和腫瘤侵襲的精細(xì)調(diào)節(jié)相關(guān)的通路，其介導(dǎo)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲借助的是生長(zhǎng)因子的效能[13]。在這條信號(hào)通路中，Akt是最關(guān)鍵的因子[14]，尤其表現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制與對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)方面。當(dāng)PI3K受到上游信號(hào)刺激后，激活下游的Akt，引起Akt磷酸化，激活下游的mTOR[15]，進(jìn)而影響各種細(xì)胞行為。目前的研究發(fā)現(xiàn)該信號(hào)通路在滋養(yǎng)細(xì)胞種植過(guò)程中有舉足輕重的作用：PI3K /Akt信號(hào)通路作為介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、侵襲與凋亡發(fā)生的靶通路而廣泛地應(yīng)用于與妊娠相關(guān)的疾病研究[16]。研究表明，增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路的表達(dá)，可以提高Bcl-2的相對(duì)表達(dá)水平；降低Bax和Bim的表達(dá)水平，由此推斷PI3K/Akt信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[17]。促進(jìn)PI3K/AKT/mTOR通路的激活，正向促進(jìn)了滋養(yǎng)細(xì)胞的入侵以及對(duì)氧化應(yīng)激的抑制；抑制其表達(dá)可逆轉(zhuǎn)上述影響[18]。在滋養(yǎng)細(xì)胞中，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白水解活性，影響基質(zhì)金屬蛋白酶9和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1的比值變化，可能通過(guò)AKT通路[19]和mTOR信號(hào)通路[20]，刺激細(xì)胞粘附和增殖，并增加侵襲性。mTOR作為自噬相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，若其蛋白及磷酸化的表達(dá)被靶向抑制，可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生和受損細(xì)胞遷移，因而影響胎盤功能障礙的發(fā)生[21]。以上研究結(jié)果表明，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路及其相關(guān)蛋白的表達(dá)活性，與滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、侵襲呈正相關(guān)，與滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)。該通路活性的增強(qiáng)，對(duì)正常宮內(nèi)妊娠種植，是正向促進(jìn)作用；而輸卵管妊娠則反之。

化瘀消癥復(fù)方由天花粉、紫草、赤芍、桃仁、丹參組成，臨床與基礎(chǔ)研究均表明其乃治療輸卵管妊娠的有效方劑[8,22]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化瘀消癥復(fù)方促進(jìn)輸卵管妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡率的增加，并抑制輸卵管妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲，均與藥物濃度呈量-效關(guān)系；化瘀消癥復(fù)方抑制p-Akt與p-mTOR的表達(dá)，與通路抑制劑的作用結(jié)果相似。檢測(cè)磷酸化的蛋白即檢測(cè)處于活性狀態(tài)的蛋白，與分子功能更直接相關(guān)，可直接反映PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活性程度。以上結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡、侵襲的趨勢(shì)相一致[23-24]。

由本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果推論，化瘀消癥復(fù)方治療輸卵管妊娠的可能機(jī)制是：干預(yù)上游的PI3K，使Akt磷酸化水平的表達(dá)下調(diào)，阻斷下游多種抗凋亡效應(yīng)分子的活化，調(diào)控 mTOR蛋白磷酸化水平的低表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯得不到有效啟動(dòng)，減弱了維持細(xì)胞生長(zhǎng)與存活的信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)微環(huán)境中細(xì)胞凋亡狀態(tài)的平衡。輸卵管局部細(xì)胞凋亡的增加，使滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲活性受到抑制，改善對(duì)輸卵管的無(wú)限制侵襲，從而起到“殺胚”的作用。