陳建福 ，陳健旋 ，袁思琦 ，陳仲巍

（1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，福建 漳州 363000；2.天然化妝品福建省高校工程研究中心,廈門(mén)醫(yī)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361023）

黃瓜（Cucumis sativus L.），又名青瓜、胡瓜，為葫蘆科黃瓜屬一年生蔓生或攀緣草本植物，黃瓜營(yíng)養(yǎng)豐富，種植歷史悠久，在我國(guó)各個(gè)地方均有分布[1-2]。黃瓜主要由黃瓜籽、黃瓜肉和黃瓜皮三部分組成，其中黃瓜皮是最容易被人們忽視的部分，其含有多糖、多酚、綠原酸、氨基酸等多種天然有效營(yíng)養(yǎng)活性成分，具有生津止渴、排毒、清腸、降尿酸、護(hù)腎、養(yǎng)顏等多種功效[3-4]。其中多酚是植物的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物果、皮、葉、莖和根中，具有抗血栓、抗炎、抑菌、抗氧化、抗凝血和抗衰老等多種生物生理活性，廣泛應(yīng)用于化妝品、飼料、食品等各個(gè)領(lǐng)域中[5-6]。本文以黃瓜皮為原料，對(duì)影響黃瓜皮多酚提取率的工藝因素進(jìn)行Box-Behnken 設(shè)計(jì)與響應(yīng)面優(yōu)化，并研究了黃瓜皮多酚的抗氧化活性，為黃瓜皮多酚的提取與綜合開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃瓜，亮美1 號(hào)，購(gòu)于漳州市新華都超市，使用時(shí)將黃瓜用清水洗凈，再將黃瓜皮削下，風(fēng)干，后放于50 ℃干燥箱中烘干至恒重，粉碎后篩選備用。乙醇，食品級(jí)，河南鑫河陽(yáng)酒精有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

KQ-100TDE 型高頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1100 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

采用福林-酚法[7]，配制100 mg/L 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取一定體積的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液到容量為10 mL 的容量瓶中，再分別加入0.5 mL 福林-酚試劑，搖勻后靜置1 min，然后加入1.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的Na2CO3溶液，定容。于75 ℃反應(yīng)10 min 后置于765 nm 分光光度計(jì)下測(cè)定吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=0.084x+0.006，R2=0.999 0。

1.2.2 黃瓜皮多酚含量的測(cè)定

取一定量的黃瓜皮提取液，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法，將分光光度計(jì)波長(zhǎng)設(shè)為765 nm，測(cè)定溶液的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠計(jì)算出多酚的濃度，因而得到多酚物質(zhì)的提取率：

式中：V 為提取液體積（L）；m 為黃瓜皮質(zhì)量（g）；b 為黃瓜皮多酚質(zhì)量濃度（mg/L）。

1.2.3 黃瓜皮多酚的提取工藝

準(zhǔn)確稱取3 份1 g 的黃瓜皮制成的粉末，分別把粉末裝入100 mL 燒瓶中，按所考察的工藝條件加入設(shè)定的乙醇，后置于高頻數(shù)控超聲波清洗器中進(jìn)行提取，結(jié)束后過(guò)濾、定容，按“1.2.2”方法計(jì)算黃瓜皮多酚的提取率，結(jié)果取平均值。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 超聲溫度的篩選

準(zhǔn)確稱取1 g 的黃瓜皮粉末，加入25 mL 60%的乙醇，分別在 55、60、65、70、75 和 80 ℃的超聲波清洗器中超聲提取30 min，過(guò)濾、定容，研究不同超聲溫度對(duì)黃瓜皮多酚提取率的影響，篩選適宜的超聲溫度。

1.2.4.2 乙醇濃度的篩選

準(zhǔn)確稱取1 g 的黃瓜皮粉末，加入濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%和 90%（體積分?jǐn)?shù)）的25 mL 乙醇溶液，在65 ℃的超聲波清洗器中超聲提取30 min，過(guò)濾，定容，研究不同乙醇濃度對(duì)黃瓜皮多酚提取率的影響，篩選適宜的乙醇濃度。

1.2.4.3 液料比的篩選

準(zhǔn)確稱取1 g 的黃瓜皮粉末，分別加入10、15、20、25、30 和 35 mL 的 60%乙醇，在 65 ℃的超聲波清洗器中超聲提取30 min，過(guò)濾，定容，研究不同液料比對(duì)黃瓜皮多酚提取率的影響，篩選適宜的液料比。

1.2.4.4 超聲時(shí)間的篩選

準(zhǔn)確稱取1 g 的黃瓜皮粉末，加入25 mL 的60%乙醇，在65 ℃超聲波清洗器內(nèi)分別超聲10、20、30、40、50、60 min，過(guò)濾，定容，研究不同超聲時(shí)間對(duì)黃瓜皮多酚提取率的影響，篩選適宜的超聲時(shí)間。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在黃瓜皮多酚提取單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將多酚提取率作為響應(yīng)值，選取超聲溫度、乙醇濃度、液料比、超聲時(shí)間作為試驗(yàn)的4 個(gè)因素，如表1 所示，并結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)出四因素三水平試驗(yàn)，對(duì)提取黃瓜皮多酚的工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

表1 Box-Behnken 響應(yīng)面因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken response methodology

1.2.6 黃瓜皮多酚的抗氧化活性測(cè)定

1.2.6.1 ·OH 清除率的測(cè)定

取2 mL 不同質(zhì)量濃度的黃瓜皮多酚溶液，并分別加入2 mL 濃度為9 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液和1 mL 濃度為9 mmol/L 的FeSO4溶液，混合均勻后再加入0.01% H2O2溶液1 mL 反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水定容，測(cè)定溶液在510 nm 處吸光度Ai；并分別以蒸餾水代替H2O2溶液為對(duì)照組，測(cè)得吸光度Aj，以蒸餾水代替黃瓜皮多酚為空白組，測(cè)得吸光度A0，按下式計(jì)算出黃瓜皮多酚對(duì)·OH 的清除率。

·OH 清除率（%）=[1-（Ai-A）j/A0]×100

1.2.6.2 DPPH·清除率的測(cè)定

取2 mL 不同質(zhì)量濃度的黃瓜皮多酚溶液，并分別加入2 mL 濃度為0.2 mmol/L 的DPPH 溶液，混合均勻后，反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)試其在517 nm 處的吸光度Ai；取2 mL 不同質(zhì)量濃度的黃瓜皮多酚溶液，加入2 mL 乙醇，測(cè)定其在517 nm 處的吸光度Aj；取2 mL 蒸餾水加入2 mL 濃度為0.2 mmol/L 的DPPH溶液，測(cè)得吸光度A0；并以VC 作對(duì)照，按下式計(jì)算得黃瓜皮多酚對(duì)DPPH·的清除率。

DPPH·清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007 進(jìn)行存儲(chǔ)與數(shù)據(jù)分析，用Origin 8.0 進(jìn)行繪圖，用Design-Expert 8.05b 軟件進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲溫度對(duì)多酚提取率的影響

如圖1 所示，當(dāng)超聲溫度為65 ℃時(shí)，黃瓜皮多酚提取率達(dá)到最大值，超聲溫度超過(guò)65 ℃后，多酚提取率沒(méi)有繼續(xù)增加，而是開(kāi)始降低。這是因?yàn)槌暅囟鹊纳?，?huì)促進(jìn)多酚分子的熱運(yùn)動(dòng)而加快多酚物質(zhì)溶出的速度；但超聲溫度過(guò)高時(shí)，部分多酚的物質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，從而降低提取率[8]。由此，適宜的超聲溫度為 65 ℃。

圖1 超聲溫度對(duì)多酚提取率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic temperatures on the extraction yields of polyphenols

2.1.2 乙醇濃度對(duì)多酚提取率的影響

圖2 乙醇濃度多酚對(duì)提取率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentrations on the extraction yields of polyphenols

如圖2 所示，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，黃瓜皮多酚提取率達(dá)到最大值，乙醇濃度超過(guò)60%后，多酚提取率沒(méi)有繼續(xù)增加，而是開(kāi)始降低。這是因?yàn)橐掖紳舛鹊脑龃?，?huì)加快多酚和多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)之間的疏水作用力及氫鍵的斷裂，使多酚提取率上升；但乙醇濃度過(guò)大時(shí)，黃瓜皮顆粒中醇溶性物質(zhì)會(huì)加快溶出，從而阻礙多酚物質(zhì)的溶出[9]。由此，適宜的乙醇濃度為60%。

2.1.3 液料比對(duì)多酚提取率的影響

如圖 3 所示，當(dāng)液料比為 25∶1（mL/g）時(shí)，黃瓜皮多酚提取率達(dá)到最大值，液料比超過(guò)25∶1（mL/g）后，多酚提取率沒(méi)有繼續(xù)增加，而是開(kāi)始降低。這是因?yàn)殡S著液料比的增加，溶劑和原料之間的接觸面積也會(huì)增加，使多酚更多地溶解出來(lái)；但液料比過(guò)大時(shí)，溶劑和原料已經(jīng)充分結(jié)合，多余的溶劑會(huì)使過(guò)多雜質(zhì)溶出，而導(dǎo)致提取率下降，同時(shí)，考慮到降低能耗、減少溶劑用量、降低原料等各方面的因素[10]，選擇適宜的液料比為 25∶1（mL/g）。

圖3 液料比對(duì)多酚提取率的影響Fig.3 Effects of liquid-to-material ratios on the extraction yields of polyphenols

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

如圖4 所示，當(dāng)超聲時(shí)間為30 min 時(shí)，黃瓜皮多酚提取率達(dá)到最大值，超聲時(shí)間超過(guò)30 min 后，多酚提取率沒(méi)有繼續(xù)增加，而是開(kāi)始降低，這是因?yàn)樵谝欢ǔ晻r(shí)間范圍內(nèi)，多酚逐漸溶出，多酚提取率增大，但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，超聲波的熱效應(yīng)導(dǎo)致多酚中相關(guān)不穩(wěn)定組分的降解，使得提取率降低[11]，由此，適宜的超聲時(shí)間為30 min。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic times on the extraction yields of polyphenols

2.2 響應(yīng)面工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以黃瓜皮多酚提取率為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇超聲溫度（A）、乙醇濃度（B）、液料比（C）和超聲時(shí)間（D）為影響因素，得出試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

利用Design-Expert 8.05b 軟件對(duì)表2 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，可得多酚提取率為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y=10.28+0.052A+0.19B+0.17C+0.21D-0.015AB+0.053AC-0.097AD-0.12BC-0.12BD-0.10CD-0.35A2-0.37B2-0.36C2-1.04D2

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，以此檢驗(yàn)各因素對(duì)多酚提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可得，回歸模型的F=25.04，P＜0.000 1，表明模型極顯著。失擬項(xiàng)P=0.934 2＞0.05，表示差異不顯著，具有較好的擬合性，由隨機(jī)的誤差引起小偏差；該方程模型的決定系數(shù)R2=0.961 6，證明有96%以上的試驗(yàn)值可以利用該模型來(lái)分析與預(yù)測(cè)。綜上分析可知該回歸模型的擬合度高，響應(yīng)面值和各因素之間關(guān)系都能夠被較好地描述出來(lái)，因此可用該回歸模型來(lái)代替試驗(yàn)對(duì)黃瓜皮多酚的提取率進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析。各因素對(duì)響應(yīng)值的影響不同，不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，其中一次項(xiàng)B、C、D 及二次項(xiàng) A2、B2、C2和 D2對(duì)響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01），其余項(xiàng)均影響不顯著。

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析

為進(jìn)一步分析超聲溫度、乙醇濃度、液料比和超聲時(shí)間對(duì)黃瓜皮多酚提取率的影響，通過(guò)Design-Expert 8.05 b 軟件繪制出響應(yīng)面和等高線圖，如圖5～10 所示。圖中顯示固定所考察因素中的任意兩個(gè)因素時(shí)，另兩個(gè)因素交互作用的影響。從響應(yīng)面中的曲面坡度和等高線中線的疏密程度可以反映出所考察工藝之間交互作用的強(qiáng)弱，即響應(yīng)面曲面的坡度越陡，傾斜度越高，等高線形狀越趨向橢圓，等高線密度越大，表示該交互作用越顯著[12]。對(duì)圖5～10 進(jìn)行分析可知，響應(yīng)面曲面傾斜度最大，等高線密度最大的是乙醇濃度和超聲時(shí)間的交互作用圖，說(shuō)明乙醇濃度和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響最顯著；同理分析，可以得到四個(gè)因素之間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著程度順序?yàn)椋築D＞BC＞CD＞AD＞AC＞AB。

2.3 最佳工藝條件的確定與驗(yàn)證

利用軟件對(duì)所建立的模型進(jìn)行分析，得到黃瓜皮多酚的最佳提取工藝為：超聲溫度65.36 ℃，乙醇濃度 62.10%，液料比 25.96∶1（mL/g），超聲時(shí)間 30.76 min，此條件下多酚提取率預(yù)測(cè)值為10.33 mg/g。考慮操作的方便性，選取超聲溫度65 ℃，乙醇濃度62%，液料比 26∶1（mL/g）、超聲時(shí)間 31 min 進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。在此修改后的最佳工藝條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，所測(cè)多酚提取率的平均值為（10.29±0.14）mg/g，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.39%，證明了回歸模型的有效性，由此可以說(shuō)明應(yīng)用響應(yīng)面法所得到的提取工藝的參數(shù)可行性強(qiáng)、可靠性高。

圖5 超聲溫度與乙醇濃度的交互作用對(duì)多酚提取率的影響Fig.5 Interaction effects of ultrasonic temperatures and ethanol concentrations on the extraction yields of polyphenols

圖6 超聲溫度與液料比的交互作用對(duì)多酚提取率的影響Fig.6 Interaction effects of ultrasonic temperatures and liquid-to-material ratios on the extraction yields of polyphenols

圖7 超聲溫度與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)多酚提取率的影響Fig.7 Interaction effects of ultrasonic temperatures and ultrasonic times on the extraction yields of polyphenols

圖9 乙醇濃度與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)多酚提取率的影響Fig.9 Interaction effects of ethanol concentrations and ultrasonic times on the extraction yields of polyphenols

圖10 液料比與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)多酚提取率的影響Fig.10 Interaction effects of liquid-to-material ratios and ultrasonic times on the extraction yields of polyphenols

2.4 黃瓜皮多酚的抗氧化活性

2.4.1 黃瓜皮多酚對(duì)·OH 的清除作用

如圖11 所示，利用黃瓜皮多酚對(duì)·OH 清除作用來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化能力。從圖中可知，隨著黃瓜皮多酚和VC 質(zhì)量濃度的升高，其對(duì)·OH 的清除率均不斷增大，當(dāng)黃瓜皮多酚質(zhì)量濃度為350 mg/L 時(shí)，對(duì)·OH 清除率達(dá)到85.74%，說(shuō)明黃瓜皮多酚具有較強(qiáng)的·OH清除能力，黃瓜皮多酚和VC 對(duì)·OH 清除率的IC50分別為116.60 mg/L 和97.59 mg/L，說(shuō)明黃瓜皮多酚具有較好的抗氧化活性。

圖11 黃瓜皮多酚和VC 對(duì)·OH 的清除作用Fig.11 Scavenging effects on·OH of polyphenols and VC

2.4.2 黃瓜皮多酚對(duì)DPPH·的清除作用

圖12 黃瓜皮多酚和VC 對(duì)DPPH·的清除作用Fig.12 Scavenging effects on DPPH·of polyphenols and VC

如圖12 所示，利用黃瓜皮多酚對(duì)DPPH·清除作用來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化能力。從圖中可知，隨著黃瓜皮多酚和VC 質(zhì)量濃度的升高，對(duì)DPPH·的清除率均不斷增大，當(dāng)黃瓜皮多酚質(zhì)量濃度為140 mg/L 時(shí)，對(duì)DPPH·清除率達(dá)到82.15%，說(shuō)明黃瓜皮多酚具有較強(qiáng)的DPPH·清除能力，黃瓜皮多酚和VC 對(duì)DPPH·清除率的IC50分別為57.41 mg/L 和47.68 mg/L，說(shuō)明黃瓜皮多酚具有較好的抗氧化活性,且抗氧化活性與多酚濃度呈正相關(guān)。

3 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助法提取黃瓜皮多酚，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法分析，建立了多酚提取率和考察工藝之間的回歸模型，優(yōu)化得出提取多酚的最佳工藝條件為：超聲溫度65 ℃，乙醇濃度62%，液料比 26∶1（mL/g），超聲時(shí)間 31 min，在此條件下得到的多酚提取率為（10.29±0.14）mg/g，與預(yù)測(cè)值（10.33 mg/g）相對(duì)誤差為0.39%，證明了回歸模型的有效性，說(shuō)明應(yīng)用響應(yīng)面法所得到的提取工藝參數(shù)可行性強(qiáng)、可靠性高。黃瓜皮多酚對(duì)·OH 和DPPH·清除率的IC50值分別為116.60 mg/L 和57.41mg/L，表明黃瓜皮多酚具有較好的抗氧化活性，且抗氧化活性與多酚濃度呈正相關(guān)，該研究為將黃瓜皮多酚開(kāi)發(fā)成天然抗氧劑提供理論基礎(chǔ)。