陳芳浩 何奕德 李哲 閆寧 宋文 張玉梅

巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)對(duì)種植體植入后的炎癥轉(zhuǎn)歸和后期骨結(jié)合的形成具有重要的調(diào)節(jié)作用[1-2]，主要是通過向M1/M2不同方向極化實(shí)現(xiàn)的，其中M2型巨噬細(xì)胞分泌促進(jìn)組織愈合的細(xì)胞因子，有利于新骨形成[3]。地塞米松(Dex)是糖皮質(zhì)激素類小分子藥物，也是公認(rèn)的巨噬細(xì)胞M2極化的強(qiáng)效藥物[4]。

DNA水凝膠是近些年來研究較為熱門的凝膠材料，其三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可容納大量的水和藥物分子，是良好的藥物緩釋載體[5]。然而前期報(bào)道的DNA凝膠是利用雙鏈DNA骨架中的帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，與帶正電荷的納米硅片之間的靜電作用交聯(lián)形成DNA物理水凝膠[6]。然而納米硅片來源有限，在體內(nèi)蓄積可能產(chǎn)生毒性。殼聚糖(CS)是天然的陽(yáng)離子高分子材料，體內(nèi)可降解，生物相容性良好。本研究推測(cè)，采用殼聚糖替換納米硅酸鹽作為交聯(lián)劑也可與DNA形成凝膠，且具備更為優(yōu)良的應(yīng)用前景。

本研究旨在合成一種新型的、良好生物相容性的DNA-CS水凝膠，加載于鈦納米管表面及管腔中以遞送Dex，通過免疫熒光染色和RT-qPCR檢測(cè)M1、M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86、CD163[7]在蛋白和基因水平的表達(dá)情況，探索其對(duì)巨噬細(xì)胞極化方向的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

純鈦試件(10 mm × 10 mm × 1 mm，寶雞弘森鈦制品有限責(zé)任公司)； 400～7000目碳化硅砂紙(勇士，德國(guó))； 40%氫氟酸、85%磷酸、丙酮、無水乙醇、冰乙酸(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；殼聚糖(相對(duì)分子質(zhì)量100～300 kDa，ACROS，北京伊諾凱科技有限公司)；地塞米松(北京索萊寶科技有限公司)；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(HyClone，美國(guó))；CCK-8試劑盒、Triton X-100、Hoechst 33342(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞(ATCC，美國(guó))；大鼠抗小鼠CD86抗體、Alexa Flour標(biāo)記驢抗大鼠二抗(Abcam, 英國(guó))；兔抗小鼠CD163抗體、ATTO標(biāo)記羊抗兔二抗、絮狀鮭魚精雙鏈DNA(Sigma, 美國(guó))； TRIzol RNA 提取試劑(Invitrogen，美國(guó))；Prime ScriptTMRT Master Mix、SYBR?Premix Ex TaqTMII(Takara，日本)。

1.2 主要儀器

陽(yáng)極氧化電源(香港龍威)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(BioTek，美國(guó))；雙級(jí)旋片式真空泵(北京飛越)； S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(Hitachi，日本)；ATR FT-IR(Shimadzu，日本)；激光共聚焦顯微鏡(尼康A(chǔ)1 plus，日本)；CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))。

1.3 DNA-CS水凝膠的制備及表征

將鮭魚精雙鏈DNA溶解于去離子水中，37 ℃恒溫過夜，形成2%DNA水溶液。90℃水浴加熱45 s，37 ℃恒溫保持2 h，形成DNA預(yù)凝膠。將等體積的0.5% CS溶液加入DNA預(yù)凝膠中，混勻10 s，37℃恒溫過夜，形成DNA-CS水凝膠。采用掃描電鏡、紅外光譜進(jìn)行表征檢查。

1.4 鈦納米管表面DNA-CS凝膠加載及Dex釋放

凝膠制備中加入CS溶液的同時(shí)加入Dex，使其在終凝膠中的濃度為1 mg/mL，形成負(fù)載Dex的水凝膠。取200 μL混勻的水凝膠滴加于鈦納米管[8]表面(NT+Dex@Gel)，在真空箱中抽真空3 min，37 ℃恒溫過夜。使用濃度為1 mg/mL的Dex溶液，等體積滴加于鈦納米管表面，作為對(duì)照組(NT+Dex)。SEM觀察表面及縱剖面形貌。將負(fù)載Dex的鈦片(NT+Dex、NT+Dex@Gel)置于24 孔板中，每孔加入1 mL PBS，置于37 ℃恒溫?fù)u床上，每隔一定時(shí)間取出100 μL，再補(bǔ)充等體積的新鮮PBS，在240 nm處測(cè)其吸光度值進(jìn)行定量。

1.5 CCK-8檢測(cè)

選擇小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，將試樣分成3 組：NT、NT+Gel、NT+Dex@Gel組，分別置于24 孔板底，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔。將RAW264.7按照3×104細(xì)胞/孔接種至鈦試樣表面。培養(yǎng)至1、3、5 d時(shí)換用含10% FBS、10% CCK-8的無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，吸取上清用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

1.6 免疫熒光染色

試樣表面細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.2% Triton X-100透化10 min，1%胎牛血清室溫封閉30 min；使用一抗(大鼠抗小鼠CD86抗體、兔抗小鼠CD163抗體，稀釋比均為1 ∶500)4 ℃孵育過夜，之后用熒光二抗(Alexa Flour標(biāo)記驢抗大鼠二抗、ATTO標(biāo)記羊抗兔二抗，稀釋比分別為1 ∶300、1 ∶200)室溫孵育2 h, Hoechst復(fù)染細(xì)胞核，PBS漂洗后封片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 RT-qPCR檢測(cè)

試樣表面細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，Trizol法提取總RNA，按照 cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTMRT Master Mix)的反轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR?PremixExTaqTMII和CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增cDNA并檢測(cè)M1、M2極化標(biāo)志物CD86、CD163的mRNA表達(dá)水平。管家基因選取GAPDH。相關(guān)基因的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 DNA水凝膠的表征

2.2 鈦種植體表面DNA水凝膠涂層的構(gòu)建

加載凝膠后可見納米管口覆蓋有凝膠薄層，部分遮擋了原有的納米陣列形貌(圖2A)，側(cè)面觀察管口處管壁表面覆蓋有凝膠，其外形由銳利變得圓鈍，管壁增厚，管腔中沉積有從管口延伸至管底的凝膠(圖2B)。

將Dex標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與其在240 nm處的吸光度值進(jìn)行線性擬合，并繪制Dex的校準(zhǔn)曲線(圖3A)。NT+Dex、NT+Dex@Gel組的體外釋放曲線如圖3B示，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)凝膠涂層組Dex的釋放速度減慢，延長(zhǎng)了半數(shù)釋放量的天數(shù)。

圖1 掃描電鏡下DNA預(yù)凝膠(A)、終凝膠(B)的表面形貌，孔徑統(tǒng)計(jì)(C)和紅外光譜圖(D)

圖2 掃描電鏡下鈦納米管管口(A)及縱剖面形貌(B)

2.3 修飾后鈦種植體表面細(xì)胞相容性檢測(cè)

細(xì)胞活性測(cè)試CCK-8結(jié)果如圖4示。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞增殖呈上升趨勢(shì)，含凝膠組未見抑制細(xì)胞增殖作用。第1、5 天時(shí)，NT+Dex@Gel組的細(xì)胞活性顯著強(qiáng)于NT組。

圖3 Dex標(biāo)準(zhǔn)曲線(A)、體外釋放曲線(B)

2.4 修飾后鈦種植體表面對(duì)巨噬細(xì)胞極化方向的影響

細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，通過免疫熒光染色將CD86(M1)、CD163(M2)和細(xì)胞核進(jìn)行染色，激光共聚焦顯微鏡觀察(圖5A)，與NT、NT+Gel組相比，NT+Dex@Gel組細(xì)胞的CD86熒光強(qiáng)度非常弱、CD163的熒光強(qiáng)度非常強(qiáng)。對(duì)免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析(圖5B)，顯示NT+Dex@Gel組細(xì)胞的CD86平均熒光強(qiáng)度顯著降低，CD163平均熒光強(qiáng)度顯著升高。

圖4 RAW264.7細(xì)胞增殖(CCK-8實(shí)驗(yàn))

細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，RT-qPCR檢測(cè)M1、M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86、CD163的mRNA表達(dá)水平(圖6)。與NT、NT+Gel組相比，NT+Dex@Gel組中CD86的mRNA表達(dá)水平顯著降低，而CD163的mRNA表達(dá)水平顯著升高，與免疫熒光染色結(jié)果的變化趨勢(shì)一致。

3 討 論

DNA水凝膠是一種以DNA為骨架分子形成的三維親水性網(wǎng)絡(luò)，按其交聯(lián)方式可分為物理水凝膠和化學(xué)水凝膠。物理交聯(lián)是由分子間的非共價(jià)相互作用產(chǎn)生的，包括互補(bǔ)DNA之間的氫鍵作用、金屬與DNA的配位作用，以及DNA與陽(yáng)離子(聚)電解質(zhì)之間的靜電作用等。例如Xing等[9]證實(shí)可以完全通過堿基配對(duì)構(gòu)建純凈的DNA水凝膠。與化學(xué)交聯(lián)相比，物理交聯(lián)制備過程相對(duì)簡(jiǎn)單，結(jié)合力較弱，避免了毒性交聯(lián)劑的使用，因此具有良好的生物相容性和生物降解性。本研究中我們首先擬探明殼聚糖分子能否替代納米硅酸鹽與DNA交聯(lián)形成凝膠，其依據(jù)在于殼聚糖分子帶有大量正電，與帶負(fù)電的DNA分子可發(fā)生靜電結(jié)合，事實(shí)上已有大量的研究將殼聚糖作為基因轉(zhuǎn)染載體轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)粒DNA分子，主要包括基于殼聚糖的納米粒[10]以及殼聚糖凝膠[11]等。通過特定分子量范圍的殼聚糖以及濃度、混合方式等參數(shù)的篩選優(yōu)化，成功制備出質(zhì)地均一、粘度可控和具有可注射性的DNA水凝膠。

圖5 M1、M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86、CD163的免疫熒光染色(A)和半定量分析(B)

圖6 RAW264.7細(xì)胞中的CD86、CD163的mRNA表達(dá)水平

植入材料表面加載水凝膠是實(shí)現(xiàn)材料表面特定生物活性的重要途徑，通過水凝膠中藥物的高效負(fù)載，可直接實(shí)現(xiàn)特定的生物功能。例如De Giglio等[12]在鈦種植體表面制備了聚丙烯酸酯基水凝膠加載環(huán)丙沙星的復(fù)合涂層，利用抗生素直接實(shí)現(xiàn)抗菌特性。然而單純的物理吸附加載量有限，與基底的結(jié)合較弱。本研究中首先在鈦基底表面構(gòu)建了納米管結(jié)構(gòu)[8]，利用真空抽吸[13]的方法將凝膠注入到納米管的管腔中，SEM觀察可見管腔內(nèi)被凝膠充滿。該方法充分發(fā)揮了納米管腔的高容積作用，顯著提高了凝膠的加載量，從而提高了地塞米松的濃度，并實(shí)現(xiàn)了一定緩釋的特點(diǎn)。

本研究中制備的凝膠修飾鈦種植體表面在常用的巨噬細(xì)胞系RAW264.7中未產(chǎn)生細(xì)胞毒性，且負(fù)載Dex后具有一定的促進(jìn)增殖作用。這表明Dex可能對(duì)巨噬細(xì)胞具有一定的促增殖作用[14]。巨噬細(xì)胞在種植體植入早期通過分泌趨化因子和細(xì)胞因子，在組織修復(fù)與改建中發(fā)揮重要作用，M2向分化程度影響著炎癥轉(zhuǎn)歸及組織再生修復(fù)的進(jìn)展，且其極化方向具有可塑性。本研究將地塞米松包裹在DNA水凝膠中，可顯著誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向M2方向極化。與NT組相比，NT+Gel組的CD163在基因水平表達(dá)升高，但蛋白水平表達(dá)差異不明顯，這可能是因?yàn)闄z測(cè)的時(shí)間點(diǎn)不夠全面，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間或許基因和蛋白的變化規(guī)律會(huì)趨于一致。也可能是在轉(zhuǎn)錄后的翻譯水平存在其他調(diào)控機(jī)制，使得最終在蛋白水平?jīng)]有表達(dá)升高，這需要更深入的研究?？梢酝茰y(cè)，這種M2方向極化的作用在體內(nèi)可以減輕材料表面的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織的快速修復(fù)。另一方面，Dex還具有強(qiáng)效的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的能力[15]，是體外成骨誘導(dǎo)的重要因子之一，Dex的局部應(yīng)用可能對(duì)細(xì)胞向成骨方向分化也具有積極意義。

綜上所述，利用DNA與殼聚糖之間的靜電作用形成水凝膠，加載于鈦納米管的管腔中，提高了地塞米松的載藥量及緩釋效果，具有良好的生物相容性，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化，從而為實(shí)現(xiàn)早期骨結(jié)合創(chuàng)造了有利條件。