梁甲武 胡巍 屈爽 袁一方 郭斌

牙周炎導(dǎo)致的牙槽骨缺損，不僅會影響患者的口頜系統(tǒng)功能，增加義齒修復(fù)、種植體修復(fù)等臨床治療難度，還影響患者的全身健康及生活質(zhì)量[1]。因此，牙槽骨再生成為廣大患者的需求及醫(yī)生的研究熱點(diǎn)。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)因具有自我更新和多向分化潛能，成為一類優(yōu)質(zhì)的組織再生細(xì)胞來源。然而，hBMSCs在牙周炎環(huán)境中的骨再生能力是否受到影響及相關(guān)機(jī)制尚不清楚。為此，本研究體外模擬牙周炎環(huán)境，運(yùn)用芯片技術(shù)檢測正常環(huán)境與炎性環(huán)境中hBMSCs的circRNAs差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)hBMSCs在炎性環(huán)境中高表達(dá)hsa_circ_0003188。通過hsa_circ_0003188對hBMSCs成骨分化能力的影響，為改善骨組織工程效果提供理論依據(jù)，為實(shí)現(xiàn)牙槽骨再生提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

α-MEM和胎牛血清(Gibco，美國)；TNF-α(300-01A, PeproTech，美國)；BMSCs成骨誘導(dǎo)液(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)；hsa_circ_0005045過表達(dá)慢病毒(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；TriZol(Invitgen，美國)； PrimeScript RT試劑盒、SYBR PreMixExTaqTMⅡ(Takara，日本)； hsa_circ_0003188、GAPDH、ALP、OCN、RUNX2引物(上海生工生物技術(shù)有限公司)；RIPA緩沖液(Sigma，美國)；兔抗人RUNX2、兔抗人ALP、兔抗人OCN、GAPDH(Cell Signal Technology，美國)；化學(xué)發(fā)光試劑盒(amersham Biosciences, 英國)；芯片檢測(上海康成生物工程有限公司)；Western Blot成像系統(tǒng)(Tanon5500，上海天能)；倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯，日本)。

1.2 方法

1.2.1 hBMSCs分離和培養(yǎng) 采取健康志愿者的新鮮骨髓10 mL，采用密度梯度離心法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，接種在含α-MEM+10%胎牛血清、2 mmol/L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的75 mm2培養(yǎng)瓶中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。隔天換液，觀察貼壁細(xì)胞的生長情況。細(xì)胞生長至單層融合后，胰酶消化后傳代培養(yǎng)。所有患者均已知情同意，研究方案通過中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查(編號： S2019-066-01)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 對照組:常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)的hBMSCs。炎癥組(TNF-α組)：取第三代hBMSCs，并向培養(yǎng)液中加入10 ng/mL TNF-α[2]，培養(yǎng)1 周，隔天換液。

1.2.3 CircRNA的芯片檢測 分別收集炎癥組hBMSCs和對照組hBMSCs(每組3 例樣本)，并利用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA。后借助上海康成生物工程有限公司，運(yùn)用美國ArrayStar公司研發(fā)的Human Circular RNA Microarray Version 2.0芯片技術(shù)，對2 組樣本進(jìn)行芯片檢測及數(shù)據(jù)分析，篩選兩組hBMSCs差異表達(dá)的circRNAs，記錄circRNAs的上調(diào)、下調(diào)倍數(shù)(log2-Fold Change)。

1.2.4 RNA提取及實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qRCR) 用TriZol 提取總RNA，PrimeScript RT試劑盒將總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。CircRNAs和mRNAs的引物序列用Primer Premier 6.0設(shè)計，引物序列見表1。用SYBR PreMixExTaqTMII在CFX96型TM實(shí)時熒光定量RT-PCR系統(tǒng)(BioRad, 美國)上進(jìn)行RT-qRCR。CircRNAs和mRNAs的表達(dá)數(shù)據(jù)以GAPDH為內(nèi)參。用2-ΔΔCt法分析其相對表達(dá)量。

1.2.5 成骨誘導(dǎo) 取第三代hBMSCs消化離心后重懸，接種于48 孔板內(nèi)(2×103個/mL)，0.8 mL/孔；和6孔板內(nèi)(2×104個/mL)，2 mL/孔。待細(xì)胞生長至約70%時棄原培養(yǎng)基，換成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)，換液3 d/次。用加入10 ng/mL TNF-α的成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)hBMSCs 1 周，以體外模擬炎性環(huán)境下BMSCs的成骨誘導(dǎo)。隔天換液。在成骨誘導(dǎo)成功后行堿性磷酸酶(ALP)染色和von-kossa染色觀察，以及RT-qRCR檢測，對BMSCs的成骨分化能力進(jìn)行評估。

表1 RNA引物

1.2.6 Western blot檢測 用RIPA緩沖液裂解hBMSCs，并提取裂解液。用BCA蛋白測定法檢測樣本的蛋白濃度。將每個樣品的40 μg蛋白加到10%SDS-PAGE上，分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜用5%牛血清白蛋白封閉2 h，并與兔抗人RUNX2(1∶1 000稀釋)、兔抗人ALP(1∶1 000稀釋)、兔抗人OCN(1∶1 000稀釋) GAPDH(1∶10 000稀釋)抗體孵育4 ℃過夜。TBST洗滌3 次后, 加入對應(yīng)二抗室溫孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光試劑盒孵育蛋白條帶，并通過成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。

1.2.7 慢病毒轉(zhuǎn)染 hsa_circ_0003188過表達(dá)慢病毒委托上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建，取生長狀態(tài)好的第三代hBMSCs，消化后接種于6 孔板(1×105/孔)中，24 h后更換培養(yǎng)基，并分別加入25.00 μL慢病毒空載體(Lenti-Vector)(MOI=50)和6.62 μL慢病毒hsa_circ_0003188(Lent-hsa_circ_0003188)(MOI=50)，以及各孔板加入促轉(zhuǎn)染P液40 μL/mL。轉(zhuǎn)染10 h后更換為完全培養(yǎng)基，72 h后利用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達(dá)情況，后提取RNA, 通過RT-qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.2.8 生物信息學(xué)分析 使用TargetScan，miRDB和miRWalk 3.0生物信息學(xué)網(wǎng)站對hsa_circ_0003188的下游miRNAs及其靶基因進(jìn)行預(yù)測，并通過對靶基因的功能分析，初步探討hsa_circ_0003188參與調(diào)控BMSCs成骨分化的機(jī)制。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 炎性環(huán)境抑制hBMSCs成骨分化

成骨誘導(dǎo)14 d后的ALP染色結(jié)果顯示，與未成骨誘導(dǎo)的hBMSCs相比，對照組hBMSCs染色較深，成骨能力較強(qiáng)。而與對照組hBMSCs相比，炎癥組hBMSCs的染色明顯較淺，成骨能力較弱(圖1)。成骨誘導(dǎo)21 d后的von-kossa染色結(jié)果顯示，對照組hBMSCs有明顯的礦化結(jié)節(jié)形成，而炎癥組hBMSCs的礦化結(jié)節(jié)形成明顯少于對照組(圖1)。因此，炎癥組hBMSCs成骨分化能力明顯低于對照組，提示體外模擬的炎性環(huán)境抑制hBMSCs成骨分化能力。

2.2 hsa_circ_0003188在炎癥組hBMSCs中高表達(dá)

對收集自對照組和炎癥組hBMSCs的RNA進(jìn)行Human Circular RNA Microarray Version 2.0芯片檢測，結(jié)果顯示，與對照組相比，炎癥組hBMSCs有1 266 個circRNAs表達(dá)上調(diào), 1 029 個circRNAs表達(dá)下調(diào)(|Fold change|>2,P<0.05)(圖2)。其中hsa_circ_0003188上調(diào)倍數(shù)較高，上調(diào)倍數(shù)為4.39 倍。RT-qPCR結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，hsa_circ_0003188在炎癥組hBMSCs中的表達(dá)水平顯著高于對照組(圖3)。

2.3 hsa_circ_0003188過表達(dá)慢病毒抑制hBMSC成骨分化

hBMSCs分別轉(zhuǎn)染Lenti-Vector和Lent-hsa_circ_0003188 72 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞帶有GFP綠色熒光，轉(zhuǎn)染率超過70%(圖4)。RT-qPCR結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染Lenti-Vector的hBMSCs相比，轉(zhuǎn)染Lent-hsa_circ_0003188的hBMSCs中hsa_circ_0003188的表達(dá)水平顯著升高(圖5)。

圖1 3 組的hBMSCs的ALP染色圖

圖2 2 組hBMSCs的CircRNAs表達(dá)的聚類分析和火山圖 圖3 RT-qPCR檢測2 組hBMSCs的hsa_circ_0003188的表達(dá)

圖4 轉(zhuǎn)染效果觀察

圖5 細(xì)胞內(nèi)hsa_circ_0003188的表達(dá)水平

將轉(zhuǎn)染Lenti-Vector和Lent-hsa_circ_0003188成功的hBMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，并在14 d后行ALP染色觀察，和21 d后行von-kossa染色觀察。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染Lenti-Vector的hBMSCs相比，hBMSCs轉(zhuǎn)染Lent-hsa_circ_0003188后，ALP染色較淺，礦化結(jié)節(jié)生成較少(圖6)。此外，過表達(dá)hsa_circ_0003188導(dǎo)致ALP、RUNX2和OCN等成骨相關(guān)基因在mRNA水平(圖7)及蛋白水平表達(dá)下降(圖8)。綜上所述，hsa_circ_0003188抑制hBMSCs成骨分化能力。

2.4 生物學(xué)功能預(yù)測

根據(jù)上?？党缮锕こ逃邢薰緦Σ町惐磉_(dá)譜中circRNAs下游miRNAs的預(yù)測結(jié)果，以及Targetscan，miRDB和miRWalk 3.0的聯(lián)合運(yùn)用，得到符合要求的ceRNA關(guān)系對。使用Cytoscape v 3.6.1軟件將篩選后的ceRNA繪制成circRNA-miRNA-mRNA關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，并對hsa_circ_0003188可能發(fā)揮作用的ceRNA通路進(jìn)行預(yù)測。

圖6 hBMSCs轉(zhuǎn)染后礦化檢測

圖7 轉(zhuǎn)染后的hBMSCs ALP,OCN,RUNX2的mRNA表達(dá)水平

圖8 轉(zhuǎn)染后的hBMSCs RUNX2、OCN、ALP的蛋白水平的表達(dá)

3 討 論

牙周炎是一種由牙菌斑引起的多種因素影響的慢性炎癥性疾病。牙周炎若不及時治療，則會導(dǎo)致牙周支持組織(牙周膜，牙骨質(zhì)和牙槽骨)發(fā)生不可逆損傷，甚至牙齒脫落[3]。牙周炎引起的牙槽骨喪失會嚴(yán)重影響患者的口頜系統(tǒng)功能，增加種植和修復(fù)的難度。近年來的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)表明，組織工程骨有望成為一種理想的骨修復(fù)方式，恢復(fù)患者骨缺損區(qū)的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能。干細(xì)胞由于具有多向分化及自我更新能力，多種干細(xì)胞被用于骨組織工程領(lǐng)域。例如牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)、牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)、牙囊干細(xì)胞(dental follicle stem cells,DFSCs)等均有研究報道可誘導(dǎo)骨形成，促進(jìn)骨再生[4-6]，BMSCs更是被認(rèn)為經(jīng)典的“多能”種子細(xì)胞，以BMSCs為研究對象的骨組織工程研究成果更加豐富且成熟。CircRNAs是一類反向剪接形成的共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼RNA[7]。根據(jù)序列來源circRNAs分為外顯子環(huán)狀RNA、內(nèi)含子環(huán)狀RNA以及外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA。由于circRNA的特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其具有高度保守性，組織特異性，且不易被RNA酶降解[8-9]。隨著對circRNAs功能的深入研究，研究人員發(fā)現(xiàn)某些circRNAs分子可通過表面的miRNA反應(yīng)原件(miRNA response elements, MREs)選擇性吸附miRNAs[10]，進(jìn)而影響下游靶基因表達(dá)，以及調(diào)控RNA結(jié)合蛋白，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，參與蛋白質(zhì)翻譯等功能。目前，已有研究報道circRNAs對干細(xì)胞的自我更新及多向分化能力具有調(diào)控作用。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)hBMSCs成骨分化后各階段與未成骨誘導(dǎo)的hBMSCs之間的circRNAs差異表達(dá)譜，且circIGSF11通過調(diào)控miR-199b-5p促進(jìn)hBMSCs成骨分化。Ouyang等[12]利用微陣列分析獲得骨不連患者與正常骨折愈合患者的hBMSCs的circRNAs差異表達(dá)譜，并篩選鑒定出 hsa_circ_0074834可以促進(jìn)hBMSCs的成骨分化及骨缺損的修復(fù)。但是，由于BMSCs的來源及研究方向不同，不同研究中所報道的BMSCs成骨分化相關(guān)的circRNAs存在差異。

為更加符合實(shí)際臨床需求，本研究以hBMSCs為研究對象，通過Human Circular RNA Microarray Version 2.0芯片檢測和生物信息學(xué)分析，篩選出正常環(huán)境與炎性環(huán)境培養(yǎng)的hBMSCs差異表達(dá)circRNAs--hsa_circ_0003188。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)得知：hsa_circ_0003188在炎性環(huán)境hBMSCs中高表達(dá)，且抑制其成骨分化。之后，聯(lián)合運(yùn)用TargetScan、miRDB和miWalk 3.0等算法對hsa_circ_0003188的ceRNA機(jī)制進(jìn)行預(yù)測。但關(guān)于hsa_circ_0003188在hBMSCs成骨過程中的具體作用機(jī)制有待后期實(shí)驗(yàn)的開展。因此，hsa_circ_0003188的發(fā)現(xiàn)為深入研究hBMSCs的成骨分化機(jī)制，改善骨組織工程效果提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床上實(shí)現(xiàn)牙槽骨再生提供了治療新靶點(diǎn)。