劉婷婷 張鑫藝 隋小宇 陳剛 王慧玉 張杰 孫輯凱 徐濤

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，齊齊哈爾，161006)

離子液體以其獨(dú)特的性質(zhì)，作為一種“綠色溶劑”用于植物活性成分的萃取分離，具有潛在優(yōu)勢(shì)。離子液體目前主要應(yīng)用于合成、催化、萃取等領(lǐng)域，近年來，基于離子液體的固液萃取技術(shù)在植物化學(xué)研究領(lǐng)域越來越受到關(guān)注[1]，已發(fā)展應(yīng)用于生物堿[2]、黃酮類[3-4]、香豆素[5]、木脂素類[6]等藥用植物活性成分的萃取分離過程。

盡管離子液體在很多萃取研究中體現(xiàn)出優(yōu)于傳統(tǒng)萃取溶劑的性質(zhì)，但其不足之處也十分明顯[7]。首先，純離子液體的黏度大，與傳統(tǒng)萃取過程相比，其萃取過程中的混合和傳質(zhì)性能會(huì)顯著下降。向離子液體中添加分子溶劑作為稀釋劑，通過離子—分子相互作用及溶劑化效應(yīng)可有效削弱離子間的相互作用及其微觀聚集結(jié)構(gòu)，顯著降低體系的黏度，促進(jìn)傳遞過程的進(jìn)行[8-9]。目前的研究多采用離子液體-水復(fù)合溶劑實(shí)現(xiàn)活性物質(zhì)的固液萃取[10-13]，水作為共溶劑，降低離子液體的黏度，提高了溶劑的擴(kuò)散能力。但離子液體-水復(fù)合溶劑對(duì)植物原料的滲透性較差，分散速度緩慢。

選用纖維素酶作用于植物材料，降解構(gòu)成細(xì)胞壁的物質(zhì)，破壞細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，減小傳質(zhì)阻力，從而有利于有效成分的提取。而咪唑類離子液體中加入纖維素酶，纖維素酶可以降解纖維素、果膠而破壞植物細(xì)胞壁，從而使提高子液體的擴(kuò)散能力。其意義在以下幾方面體現(xiàn)：①纖維素酶能夠有效破壞植物細(xì)胞壁，減小溶劑擴(kuò)散阻力；②纖維素酶破壞細(xì)胞壁會(huì)使細(xì)胞內(nèi)成分溶解、混懸于溶劑中，利于提取分離；③節(jié)約時(shí)間和溶劑；④提高了離子液體滲透能力。而這其中首要工作是要保證纖維素酶在離子液體-水中的酶活力。測(cè)定纖維素酶酶活的方法有化學(xué)法(底物、產(chǎn)物分析)、熒光法、同位素測(cè)定法和電化學(xué)法[14-15]。本研究采用熒光分析法考查咪唑類離子液體中纖維素酶的熒光活性。熒光光譜分析法的主要優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、選擇性高、干擾小、試樣量小，相比于化學(xué)法操作簡便[16]。利用熒光光譜法分析不同1-烷基-3-甲基咪唑類離子液體水溶液中纖維素的酶活力，為離子液體的選擇和利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。此外，離子液體已廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化領(lǐng)域[17]，在預(yù)處理過程中，借助纖維素酶的水解作用，有效提高纖維素的降解效率[18-20]。本研究結(jié)果也將為該領(lǐng)域中的纖維素酶的酶學(xué)特性提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

纖維素酶，以羧甲基纖維素鈉為底物的酶活≥1×106U/g，銀川市和氏璧生物技術(shù)有限公司；11種咪唑類離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氫氟硼酸鹽[Bmim]BF4，溴化1-辛基-3-甲基咪唑[Omim]Br溴化1-己基-3-甲基咪唑[Hmim]Br, 1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽[Bmim]NO3，溴化1-乙基-3-甲基咪唑[Emim]Br, 1-丁基-3-甲基咪唑?qū)妆交撬猁}[Bmim]MBS, 1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽[Bmim]HSO4, 氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑[Amim]Cl, 氯化1-芐基-3-甲基咪唑[Bzmim]Cl, 氯化1-丁基-3-甲基咪唑[Bmim]Cl, 溴化1-丁基-3-甲基咪唑[Bmim]Br, 上海成捷化學(xué)有限公司，使用時(shí)未經(jīng)進(jìn)一步純化，去離子水為實(shí)驗(yàn)室自制。熒光光譜儀LS-45/55, 美國PerkinElmer。

1.2 纖維素酶的熒光光譜

配制質(zhì)量濃度為2 g/L纖維素酶于檸檬酸緩沖溶液中(pH= 4.8, 50 mmol/L),掃描纖維素酶的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜,得到纖維素酶的最大激發(fā)波長(λex,max)和最大發(fā)射波長(λemx,max)及熒光強(qiáng)度。掃描范圍200～800 nm，激發(fā)單色器狹縫寬度20 nm，發(fā)射單色器狹縫寬度5 nm，循環(huán)水浴溫度50 ℃。

1.3 離子液體溶液中纖維素酶的熒光活性測(cè)定

配置一定濃度的離子液體溶液與上述酶溶液等體積混合后， 在相同的作用時(shí)間內(nèi)，以纖維素酶λex,max波長為激發(fā)光，于λemx,max下檢測(cè)纖維素酶的熒光活性，空白分別為各離子液體溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶的熒光光譜特征

在蛋白質(zhì)分子中，能發(fā)射熒光的氨基酸有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及苯丙氨酸(Phe)。個(gè)別蛋白質(zhì)分子含有的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)也能發(fā)射熒光。Trp、Tyr及Phe熒光強(qiáng)弱順序從大到小依次為Trp、Ty、Phe。通常，蛋白質(zhì)的熒光通常在 280 nm 或更長的波長被激發(fā)，因此Phe在絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)條件下不被激發(fā)。蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來自Trp和Tyr 殘基。Trp 殘基對(duì)微環(huán)境的變化很敏感，因而常作為內(nèi)源熒光探針來研究溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)的構(gòu)象[21]。目前，對(duì)于熒光光譜的研究主要在猝滅劑、溶劑、電磁場及金屬離子等對(duì)酶構(gòu)象方面[22-23]。因此，可以根據(jù)蛋白質(zhì)溶液在280 nm附近的激發(fā)波長下所產(chǎn)生較高強(qiáng)度的熒光，根據(jù)蛋白溶液的熒光光譜特征，可以分析蛋白結(jié)構(gòu)的變化,進(jìn)而考查環(huán)境等因素對(duì)纖維素酶活力的影響[24]。

結(jié)果如圖1所示，纖維素酶的最大激發(fā)波長270 nm(熒光強(qiáng)度194.43)，最大發(fā)射波長 346 nm (熒光強(qiáng)度196.05)，它的熒光發(fā)射光譜和激發(fā)光譜之間存在著鏡像對(duì)稱關(guān)系。由于纖維素酶為蛋白質(zhì)，熒光活性主要來自于其色基酸殘基，其熒光活性的穩(wěn)定性有待考查，因此不同時(shí)間點(diǎn)(30、 60、90、120 min)分別考查纖維素酶的熒光活性，其熒光強(qiáng)度在190.44～193.04范圍內(nèi)變化，說明其熒光活性在2 h內(nèi)是較穩(wěn)定的。

圖1 纖維素酶的熒光光譜特征

2.2 離子液體溶液對(duì)纖維素酶的熒光活性的影響

2.2.1 離子液體的熒光干擾

離子液體在酶熒光活性測(cè)定時(shí)會(huì)存在一定程度的干擾，最終導(dǎo)致酶熒光活性測(cè)定準(zhǔn)確度降低。因此對(duì)離子液體溶液自身的熒光干擾進(jìn)行了考查。結(jié)果如表1所示，11種咪唑型離子液體中在346 nm處的熒光強(qiáng)度較小，對(duì)酶活性測(cè)定影響較小。

表1 離子液體溶液的熒光干擾

2.2.2 離子液體結(jié)構(gòu)對(duì)纖維素酶熒光活性的影響

陽離子碳鏈長度。陰離子均為Br-時(shí)，碳鏈長度不同對(duì)纖維素酶熒光強(qiáng)度產(chǎn)生影響亦不相同。陽離子碳鏈長度越長，纖維素酶的熒光強(qiáng)度降低幅度越大，當(dāng)碳鏈的原子數(shù)目為2或4個(gè)時(shí)對(duì)酶活性影響最小。這可能由于空間位阻的影響，使得纖維素酶空間結(jié)構(gòu)、褶皺程度發(fā)生改變，導(dǎo)致其分子內(nèi)的熒光猝滅，其具體影響如表2所示。

陽離子不飽和程度。陰離子均為Cl-時(shí)，分別考查了陽離子碳鏈的不飽和程度對(duì)纖維素酶熒光強(qiáng)度影響，熒光活性大小依次順序?yàn)槎⊥榛?、烯丙基、芐基, 陽離子不飽和程度越大對(duì)酶的活性影響越大。

表2 離子液體溶液中纖維素酶的熒光活性

2.2.3離子液體溶液濃度對(duì)纖維素酶熒光活性的影響

如表3所示，離子液體溶液濃度分別為0.40、0.25、0.20、0.10 mol/L時(shí)，11種咪唑類離子液體中纖維素酶熒光活性隨濃度的增高成遞減的趨勢(shì)，濃度越低，對(duì)酶活性影響越小。

表3 纖維素酶在不同濃度離子液體中的熒光強(qiáng)度

3 討論與結(jié)論

纖維素酶系蛋白質(zhì)中，因其含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸殘基而產(chǎn)生較強(qiáng)的內(nèi)源熒光。 影響分子發(fā)光的環(huán)境因素有：溶劑、介質(zhì)酸堿性、介質(zhì)的溫度和黏度及有序介質(zhì)。當(dāng)某些因素作用于蛋白質(zhì)后，會(huì)導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度下降，這種現(xiàn)象稱為熒光猝滅作用。一般來說，不同陰離子組成的離子液體影響纖維素酶活性，結(jié)果在一定程度上符合離子對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的Hofmeister規(guī)律[16]；離子液體中碳鏈長度較長的陽離子對(duì)纖維素酶有較大的抑制作用，但未達(dá)到失活水平；最明顯的是高濃度的離子液體會(huì)使酶在一定程度上失去部分活性。

從Chen、Liu et al.[25-26]的研究可以看出，在低濃度的咪唑型離子液體溶液中，纖維素酶保持一定的活性，對(duì)水解纖維素保持有效的催化效率，能夠破壞細(xì)胞壁，提高傳質(zhì)。Cui et al.[27]對(duì)1-烷基-3甲基咪唑型離子液體溶液中纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白酶對(duì)喜樹翅果進(jìn)行處理，其中以[Omim]Br+半纖維素酶溶劑體系在目標(biāo)化合物的溶出效果上優(yōu)勢(shì)明顯，這可能與喜樹翅果細(xì)胞壁主要以半纖維為主有關(guān)。本研究的光譜學(xué)研究結(jié)果顯示，低濃度的離子液體溶液對(duì)纖維素酶酶活力有一定影響，其還具備一定催化水解能力和效率。