李子英 李佳迪 劉鐸 叢日春

(中國林業(yè)科學(xué)研究院荒漠化研究所，北京，100091) (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)田灌溉研究所) (中國林業(yè)科學(xué)研究院荒漠化研究所)

土壤鹽堿化是導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境惡化，限制農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因素[1]，我國的鹽堿土分布廣泛，總面積約3 600萬hm2，是重要的土地資源之一，具有廣闊的治理與應(yīng)用前景[2-3]，在東北、華北、華東、西北四大區(qū)域皆有分布[4-5]，在一些地區(qū)，鹽化與堿化往往同時(shí)發(fā)生，如東北松嫩平原鹽堿地中，以Na2CO3和NaHCO3為主，同時(shí)又伴有NaCl和Na2SO4危害[6-7]，對植物的影響遠(yuǎn)高于單一鹽堿的脅迫[8]。因此，對于混合鹽堿脅迫下的植物生理響應(yīng)的研究具有現(xiàn)實(shí)意義，更能真實(shí)反應(yīng)植物耐鹽堿機(jī)制。

柳樹在我國廣泛分布，種類繁多，耐水濕，抗逆性強(qiáng)，作為我國重要的闊葉樹種，具有較高的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[9]。近年來，對于柳樹耐鹽堿的研究逐漸增多，但是多集中于單一鹽或堿脅迫的研究[10-11]，對于混合鹽堿脅迫下柳樹光合色素及抗氧化酶等方面的研究較少。本研究以耐鹽柳樹新品系鹽柳1號為研究材料，以不同比例混合的NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3模擬出12種不同濃度和組成的鹽堿情況，對鹽柳1號幼苗的葉片含水量、光合色素含量及抗氧化酶活性進(jìn)行測定，為柳樹耐鹽堿的生理機(jī)制的深入研究及耐鹽堿品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

試驗(yàn)材料于中國林業(yè)科學(xué)研究院科研溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，選取粗細(xì)一致、健壯的鹽柳1號插條定植于裝有栽培基質(zhì)(洗凈的河沙混合少量珍珠巖)的花盆中，每盆1株，定期澆灌1/2霍格蘭營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待幼苗培養(yǎng)45 d左右，選取長勢良好、大小相同的鹽柳1號幼苗進(jìn)行脅迫處理[12-13]。

1.2 模擬鹽堿設(shè)計(jì)

將NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3按不同比例混合以模擬混合鹽堿脅迫?；旌消}堿脅迫分為3組，每組設(shè)置50、100、150、200 mmol/L 4個濃度梯度。A組各中性鹽與堿性鹽的物質(zhì)的量比為n(NaCl)∶n(Na2SO4)∶n(NaHCO3)∶n(Na2CO3)=1∶2∶1∶0，pH值分別為7.91、8.01、8.09、8.16；B組各中性鹽與堿性鹽的物質(zhì)的量比為n(NaCl)∶n(Na2SO4)∶n(NaHCO3)∶n(Na2CO3)=1∶9∶9∶1，pH值分別為8.47、8.62、8.71、8.84；C組各中性鹽與堿性鹽的物質(zhì)的量比為n(NaCl)∶n(Na2SO4)∶n(NaHCO3)∶n(Na2CO3)=1∶1∶1∶1，pH值分別為9.33、9.47、9.51、9.56。

1.3 混合鹽堿脅迫處理

將選取的鹽柳1號幼苗隨機(jī)分為13組，每組3次生物學(xué)重復(fù)。其中，一組作為對照，澆灌1/2霍格蘭營養(yǎng)液，其余12組按照A1-A4、B1-B4、C1-C4的順序進(jìn)行編號，每隔3 d澆灌100 mL上述相對應(yīng)的混合鹽堿溶液進(jìn)行脅迫處理，脅迫處理14 d。然后采集對照和各處理組幼苗相同部位的功能葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行各指標(biāo)的測定。

1.4 指標(biāo)測定及數(shù)據(jù)處理

采用烘干法測定鹽柳1號幼苗的葉片含水量；使用直接浸提法[14]提取鹽柳1號幼苗的葉片葉綠素，然后用紫外分光光度計(jì)測定葉綠素含量；分別采用愈創(chuàng)木酚法、過氧化氫還原法[15]、氮藍(lán)四唑法[16]測定鹽柳1號幼苗的葉片過氧化物酶(POD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性及超氧化物歧化酶(SOD)活性。所測得的數(shù)據(jù)使用Excel 2016、SPSS 19.0進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽堿脅迫對鹽柳1號幼苗葉片含水量的影響

鹽柳1號幼苗的葉片含水量隨著鹽濃度的增大表現(xiàn)出降低的趨勢，且堿性鹽比例越大的組合降幅越大。A處理組的葉片含水量在鹽濃度100 mmol/L時(shí)有最小值，與對照相比降低了6.62%；B、C處理組的葉片含水量在鹽濃度200 mmol/L時(shí)降至最低，與對照相比分別顯著降低了48.40%和73.03%(P<0.05)。鹽濃度為50 mmol/L時(shí)，隨著pH值的增大，葉片含水量無顯著變化，此時(shí)各混合鹽堿脅迫組合對葉片含水量的影響較小；在鹽濃度100 mmol/L、150 mmol/L時(shí)，隨著pH值的增大，C處理組的葉片含水量相對于A、B處理組顯著下降；在鹽濃度200 mmol/L時(shí)，A、B、C處理組的葉片含水量均表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)，下降趨勢隨鹽濃度的增大而加劇，在pH值為9.56時(shí)降至最低，此時(shí)葉片含水量僅為21.13%(表1)。

表1 不同濃度鹽堿脅迫對鹽柳1號幼苗葉片含水量的影響

2.2 鹽堿脅迫對鹽柳1號幼苗葉片光合色素含量的影響

A處理組鹽柳1號幼苗的葉片葉綠素a和葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)均未有顯著變化(P>0.05)，呈先降低后升高又降低的趨勢；B處理組的葉綠素a和葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)在200 mmol/L時(shí)均降至最低，葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對于對照顯著降低了19.14%(P<0.05)，葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)相較于對照變化不顯著(P>0.05)；C處理組的葉綠素a和葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨鹽濃度的增大上升，但未表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)。在低鹽濃度條件下(50、100 mmol/L)，隨著pH值的增高，葉綠素a和葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不明顯，相對于對照略有上升；在高鹽濃度條件下(150、200 mmol/L)，隨著pH值的增高，葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低(P<0.05)，葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍未有明顯變化(p>0.05)，說明混合鹽堿脅迫對葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響小于葉綠素a(表2、表3)。

表2 不同濃度鹽堿脅迫對鹽柳1號幼苗葉片葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.3 鹽堿脅迫對鹽柳1號幼苗抗氧化酶活性的影響

2.3.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化

A、B處理組的鹽柳1號幼苗的葉片SOD活性隨著鹽濃度的增大呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在鹽濃度150 mmol/L時(shí)升至最高，分別相對于對照顯著增加了110.72%、123.78%(P<0.05)，隨后下降；C處理組的葉片SOD活性呈升高的趨勢，在鹽濃度100 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，相對于對照顯著增加了130.62%(P<0.05)。在鹽濃度50、100 mmol/L的脅迫條件下，隨著pH值的增高，鹽柳1號幼苗的葉片SOD活性不斷增加；在150 mmol/L鹽濃度條件下，B處理組的葉片SOD活性仍大于A處理組，說明在鹽濃度低于150 mmol/L，pH值<9.51范圍內(nèi)，鹽柳1號幼苗能表現(xiàn)出較好的適應(yīng)性；在鹽濃度200 mmol/L時(shí)，鹽柳1號幼苗的葉片SOD活性不斷降低(表4)。

表3 不同濃度鹽堿脅迫對鹽柳1號幼苗葉片葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

表4 不同濃度鹽堿脅迫對鹽柳1號幼苗葉片SOD活性的影響

2.3.2 過氧化物酶(POD)活性的變化

同葉片SOD活性的變化趨勢類似，A、B處理組的鹽柳1號幼苗的葉片POD活性隨著鹽濃度的增大呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在鹽濃度150 mmol/L時(shí)升至最高，分別相對于對照增加或顯著增加了31.31%、71.73%(P<0.05)，隨后下降；C處理組的葉片POD活性呈升高的趨勢，在鹽濃度100 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，相對于對照顯著增加了22.16%(P<0.05)。在低鹽濃度條件下(50、100 mmol/L)，隨著pH值的增高，鹽柳1號幼苗的葉片POD活性變化不明顯；在鹽濃度150、200 mmol/L時(shí)，鹽柳1號幼苗的葉片POD活性升高(表5)。

表5 不同濃度鹽堿脅迫對鹽柳1號幼苗葉片POD活性的影響

2.3.3 過氧化氫酶(CAT)活性的變化

A、B處理組的鹽柳1號幼苗的葉片CAT活性隨著鹽濃度的增大呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，A、B處理組的葉片CAT活性分別在150、100 mmol/L時(shí)達(dá)到最高，分別相對于對照顯著增加了110.61%和75.84%(P<0.05)；C處理組的葉片CAT活性不斷升高，在鹽濃度100 mmol/L時(shí)急劇增高，相對于對照顯著增加了142.62%(P<0.05)。鹽濃度100 mmol/L以下的混合鹽堿脅迫對鹽柳1號幼苗的葉片CAT活性有一定的促進(jìn)作用，而在鹽濃度150 mmol/L、200 mmol/L脅迫條件下，葉片CAT活性隨著pH值的增大而降低(表6)，說明隨著鹽濃度的增大，鹽柳1號對pH值的耐受性下降。

表6 不同濃度鹽堿脅迫對鹽柳1號幼苗CAT活性的影響

3 結(jié)論與討論

相對含水量是反應(yīng)鹽脅迫下植物水分狀況的指標(biāo)[17]。在混合鹽堿脅迫下，油用向日葵[18]地上部分含水量和堿地膚[19]葉片含水量均隨著鹽濃度的增大和pH值的升高表現(xiàn)出降低的趨勢。本研究中，在50 mmol/L時(shí)A、B、C 3組以及在100、150 mmol/L時(shí)A、B兩組鹽柳1號幼苗的葉片含水量未出現(xiàn)顯著下降，說明鹽柳1號在低鹽濃度和低pH值下，仍能保持較高的相對含水量以維持各項(xiàng)生命活動。隨著pH值的增高以及鹽濃度的增大，葉片含水量下降趨勢明顯加劇。由此可見，鹽濃度和pH值的協(xié)同作用對鹽柳1號葉片含水量的影響大于鹽濃度和pH值的單獨(dú)作用。

光合色素是植物利用光能的主要載體，是進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，在植物光合作用中發(fā)揮著重要的作用[20]。本研究中，在鹽濃度和堿性鹽含量較低時(shí)，鹽柳1號幼苗的葉片葉綠素a、葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大，大致呈升高趨勢，而隨著堿性鹽含量和鹽濃度的增大，混合鹽堿脅迫對葉綠素a合成影響增大，表現(xiàn)出下降的趨勢，葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化小于葉綠素a。除B處理組的鹽柳1號幼苗的葉片葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)在鹽濃度高于150 mmol/L時(shí)顯著下降，其他處理組的葉綠素a、葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)均無顯著變化。郭金博[21]等在對混合鹽堿脅迫下‘中山杉406’葉綠素含量的研究中也曾得出類似的結(jié)論，鹽堿混合脅迫并未對‘中山杉406’的葉綠素a和葉綠素b 2種光合色素的含量造成顯著影響。同樣，在對耐鹽植物鹽地堿蓬[22]和耐鹽棉花品種[23]的研究中，其在高鹽脅迫下葉綠素含量也未發(fā)生明顯變化，這在一定程度上體現(xiàn)了鹽柳1號的耐鹽堿能力，保護(hù)葉片中的光合色素不被降解。

鹽堿脅迫下，植物體內(nèi)的活性氧代謝平衡被破壞，植物體內(nèi)SOD、POD、CAT等保護(hù)酶類的活性大幅升高清除細(xì)胞內(nèi)過量的活性氧，維持活性氧的代謝平衡，在一定程度上減緩鹽堿脅迫對植物的傷害，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，當(dāng)超過植物抗氧化酶系統(tǒng)的清除能力時(shí)，致使活性氧大量積累，抗氧化酶活性下降[24]。本研究中，在鹽濃度小于150 mmol/L，pH值低于9.51的混合鹽堿脅迫下，隨著鹽濃度的增高，各處理組的葉片SOD、POD、CAT活性都增強(qiáng)或顯著增強(qiáng)。說明鹽柳1號幼苗體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)的活性不斷提高，有效的清除了多余的活性氧，對鹽柳1號的膜系統(tǒng)起到了一定的保護(hù)作用。這與前人在芍藥[25]、巨菌草[26]等植物的研究結(jié)果一致。而超過這一限度后，在高鹽堿濃度下，幼苗體內(nèi)的活性氧平衡被破壞，抗氧化酶活性下降，膜脂過氧化程度加重，細(xì)胞膜受到傷害。