孫家佳 杜亞飛 包瑞敏 張智 楊可心 魏罡

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

松仁當(dāng)中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中包括蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、脂肪、維生素、礦物質(zhì)元素及其他的生物活性物質(zhì)[1]，松仁肽是由松仁蛋白在酶的作用下水解得到的小分子肽鏈[2-4]。為了克服松仁蛋白在營(yíng)養(yǎng)方面的弱點(diǎn)，提供極易消化吸收的多肽化合物，有研究采用微生物法發(fā)酵松仁肽，利用微生物通過(guò)自身的生理功能將松仁蛋白轉(zhuǎn)化為小分子的多肽，該法所得到的松仁肽更易于機(jī)體吸收，并且成本低，苦味少，為多肽的制備提供了新的參考[5-7]。

鋅是人體所須的營(yíng)養(yǎng)素，是人體上百種酶的組成元素，參與多種生理功能。鋅對(duì)兒童和老人的身體健康十分重要，缺鋅會(huì)使嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、智力發(fā)育不良、免疫功能下降等[8-9]。所以，相應(yīng)的Zn2+在食品方面的研究也越來(lái)越受到重視。

肽鋅螯合物是當(dāng)前普遍研究的新型營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，螯合的概念是指一分子或兩分子的官能團(tuán)與金屬離子之間，通過(guò)配位作用生成環(huán)狀構(gòu)造的化學(xué)反應(yīng)，螯合作用在食品應(yīng)用方面具有重要的意義[10-11]，人體攝取一些無(wú)機(jī)微量金屬元素的消化吸收效率較低，一般在2%～10%，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用價(jià)值較低。但一些金屬微量元素與氨基酸結(jié)合形成螯狀化合物時(shí)，人體對(duì)其的消化吸收的效率大大提高，是未螯合之前的2～10倍，所以螯合物在食品方面起著重要的作用，對(duì)于一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，可以提供較好的方式，提高營(yíng)養(yǎng)的吸收率[12-14]。本研究主要對(duì)相同條件下制備得到的松仁肽與其Zn2+螯合物進(jìn)行分離純化，并以抗氧化能力作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征的分析與對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

松仁粕(市售)；葡聚糖凝膠Sephadex G-50、葡聚糖凝膠Sephadex G-15、DPPH、ABTS，上海源葉生物科技有限公司；三氯乙酸(分析純)、濃硫酸(分析純)、三氯化鐵(分析純)、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；水楊酸，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

YXQG02手提式壓力蒸汽滅菌器，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；JA2003型電子天平，海精科儀器有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，海一恒科技有限公司；DL-6M離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器有限公司。

1.2 松仁肽-鋅螯合物及松仁肽的制備

松仁肽-鋅螯合物的制備：取適量的松仁用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩(60目篩子)，將得到的松仁粉末粕經(jīng)索氏提取法，除去松仁粕中的油脂。以松仁粕制作液體培養(yǎng)基，加入0.6 g的ZnSO4，用蒸餾水配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的懸濁液，枯草芽孢桿菌的接種量為3%，在溫度為36 ℃，160轉(zhuǎn)/min的搖床中發(fā)酵52 h。高溫滅菌后，待冷卻，離心取上層清液，冷凍干燥得到粗制松仁肽-鋅螯合物(備用)。

松仁肽的制備：取適量的松仁用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩(60目篩子)，將得到的松仁粉末粕經(jīng)索氏提取法，除去松仁粕中的油脂。以松仁粕制作液體培養(yǎng)基，用蒸餾水配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的懸濁液，枯草芽孢桿菌的接種量為3%，在溫度為36 ℃，160轉(zhuǎn)/min的搖床中發(fā)酵52 h。高溫滅菌后，待冷卻，離心取上層清液，冷凍干燥得到粗制松仁肽(備用)。

1.3 超濾

將去離子水加熱至50～60 ℃后清洗超濾組件；在原料液儲(chǔ)槽中加入一定量的備用處理后的松仁肽或松仁肽-鋅螯合物后，打開(kāi)低壓料液泵回流閥和低壓料液泵出口閥，打開(kāi)超濾料液進(jìn)口閥、超濾清液出口閥和濃液出口閥，使整個(gè)回路通暢。用截留相對(duì)分子質(zhì)量10 000的中空纖維柱低溫過(guò)濾。在測(cè)量過(guò)程中記錄濾前體積、濾后體積，計(jì)算濾液回收率。

濾液回收率=(Vi/V)×100%。

式中：Vi為濾后體積(mL)；V為濾前體積(mL)。

1.4 葡聚糖凝膠Sephadex G-50一級(jí)分離

選定合適的層析柱型號(hào)(1.6 cm×20 cm)，將干膠顆粒倒入燒杯并加入5～10倍量的蒸餾水，加熱溶脹，沸水浴中2～3 h即可使其凝膠充分溶脹。

凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，用去離子水清洗；層析柱循環(huán)流淌15 min，與此同時(shí)在向裝有葡聚糖凝膠Sephadex G-50中加入1/3容積的洗脫液(去離子水)，用玻璃棒攪拌使其成為懸濁液。將葡聚糖凝膠懸濁液加入已清洗好的層析柱，緩慢加入使其均勻填充[15]。

加樣：用吸管吸去凝膠柱床頂部大部分液體，小心地把經(jīng)超濾處理后的松仁肽與松仁肽-鋅螯合物加入柱床表面，使其呈一均勻薄層。

洗脫與收集：以蒸餾水為洗脫液，控制流速為0.5 mL/min，樣品質(zhì)量濃度為20 g/L(用冷凍干燥后的固體樣品配置)，用小型試管收集，每管收集2 mL，于220 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

對(duì)于出現(xiàn)的吸收峰，進(jìn)行體外抗氧化能力比較，分別測(cè)試清除羥自由基、總還原能力、ABTS自由清除率和DPPH自由基清除率等4個(gè)指標(biāo)，選出抗氧化能力最強(qiáng)的進(jìn)行二級(jí)分離。

1.5 葡聚糖凝膠Sephadex G-15二級(jí)分離

在一級(jí)處理的前提下，對(duì)經(jīng)過(guò)一級(jí)分離后的松仁肽及松仁肽-鋅螯合物進(jìn)行二級(jí)分離，葡聚糖凝膠Sephadex G-15的前處理方式、裝柱及加樣的實(shí)驗(yàn)方式與1.4的實(shí)驗(yàn)方式相同。

1.6 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

羥自由基的測(cè)定。H2O2與亞鐵離子生成·OH，·OH自由基具有較高的反應(yīng)活性，因?yàn)榇婊顣r(shí)間較短，加入水楊酸，會(huì)與·OH自由基反應(yīng)生產(chǎn)紫色絡(luò)合物，該有色絡(luò)合物在510 nm處有較大的吸收波長(zhǎng)，吸光度與·OH自由基的量成正比[16-17]。反應(yīng)體系中含有9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液、9 mmol/L硫酸亞、8.8 mmol/L H2O2。比色管中依次加入硫酸亞鐵、水楊酸、去離子水，最后加入H2O2，搖勻，在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，以蒸餾水歸零，在510 nm的波長(zhǎng)下測(cè)吸光度[18-19]。

式中：A0為空白對(duì)照組的吸光度；AX為加入樣品后的吸光度；AX0為不加顯色劑H2O2樣品溶液本底的吸光度。

還原力的測(cè)定。取1 mL不同質(zhì)量濃度的3種待測(cè)樣品溶液，分別與pH為6.6、濃度為0.2 mol/L的2.5 mL的磷酸鈉緩沖液和2.5 mL的鐵氰化鉀混合，在50 ℃保溫30 min后迅速冷卻；再加入2.5 mL三氯乙酸后離心3 000 r/min，10 min后取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL氯化鐵溶液，混合均勻[20]。反應(yīng)10 min后在700 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，比較3種被測(cè)樣品的還原能力，吸光度越大說(shuō)明還原能力越強(qiáng)[21]。

DPPH自由基清除率的測(cè)定。取DPPH 3.5 mg，用無(wú)水乙醇溶解，轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶，用無(wú)水乙醇定容至刻度。取2 mL至100 mL的容量瓶中，搖勻得濃度為0.017 8 mmol/L DPPH儲(chǔ)備液備用。用乙醇將松仁肽-鋅的螯合物稀釋一定濃度，待測(cè)。在10 mL比色管中一次加入4 mL DPPH和螯合物的稀釋液，加入乙醇至刻度，混均勻立即在517 nm的波長(zhǎng)下測(cè)吸光值[22]記為Ai。將待測(cè)液在室溫避光的條件下保存30 min后測(cè)吸光值，記為Aj。對(duì)照試驗(yàn)為只加DPPH的乙醇溶液，測(cè)吸光值為Ac，按下式計(jì)算自由基清除率(K)[23]。

ABTS清除自由基的測(cè)定。取0.4 mL ABTS工作液，用PBS溶液稀釋備用，2 mL的ABTS溶液分別與松仁肽、松仁肽-鋅螯合物混合，常溫避光下靜止6 nim，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同吸收峰的吸光度，并記錄下來(lái)，計(jì)算清除率。

式中：A0為不加樣品時(shí)ABTS溶液的吸光度；A1為加樣品后所測(cè)得的吸光度。

1.7 結(jié)構(gòu)表征的測(cè)定

氨基酸組成的測(cè)定。將純化后的松仁肽與松仁肽-鋅螯合的樣品冷凍干燥后備用，以固體的形式用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定氨基酸的組成。

紫外掃描光譜的測(cè)定。用去離子水將松仁肽及松仁肽-鋅螯合物分別配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL溶液，采用全自動(dòng)紫外掃描儀分別進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，掃描范圍200～400 nm，分析小肽進(jìn)行螯合反應(yīng)前后其吸光度的變化情況，以去離子水作為空白調(diào)零。

傅里葉紅外光譜的測(cè)定。分別取肽與肽鋅螯合物固體樣品2 mg及干燥后的KBr 200 mg，放入瑪瑙研缽中混合研磨，研磨至粒度在2.5～2.0 μm，裝入壓片裝置中，加壓至20 MPa，維持1～2 min；取出壓片，呈半透明狀。利用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行定性分析，得到光譜，波長(zhǎng)范圍500～4 000 cm-1。

能譜的測(cè)定。分別將肽與肽鋅螯合物粉末用雙面膠粘貼于鋁制樣品臺(tái)上，然后噴涂一薄層金膜，用能譜儀測(cè)定各元素的組成和所占的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾結(jié)果

用截留相對(duì)分子質(zhì)量10 000的中空纖維柱低溫過(guò)濾、截留后，相對(duì)得分子質(zhì)量10 000左右的濾液。所得松仁肽和松仁肽-鋅螯合物濾液回收率為87.4%和83.7%。

2.2 松仁肽的分離純化

2.2.1 松仁肽Sephadex G-50一級(jí)分離結(jié)果

利用Sephadex G-50凝膠柱可將松仁肽初分為4個(gè)組分，分別命名為P-1、P-2、P-3、P-4，其中P-1、P-2、P-3主要是分子量較大的部分，估計(jì)主要由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶及未充分水解的蛋白質(zhì)組成；P-4主要是水解后的短肽。P-4后還有一部分組分具有吸收值，這部分對(duì)應(yīng)于相對(duì)分子質(zhì)量最小的部分，估計(jì)主要是游離氨基酸或小分子鹽類物質(zhì)，不予保留。由表1可知抗氧化能力最強(qiáng)的部分為P-4，選其進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 松仁肽一級(jí)分離洗脫曲線

表1 組分P-1、P-2、P-3、P-4抗氧化能力測(cè)定結(jié)果

2.2.2 松仁肽Sephadex G-15二級(jí)分離結(jié)果

利用Sephadex G-15可將P-4分成3個(gè)組分，分別為P-4-1、P-4-2、P-4-3，烘干后分別配制質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的各組分溶液，測(cè)其抗氧化能力。由表2可知P-4-3的抗氧化活性明顯高于其他組，擇優(yōu)選取抗氧化能力最強(qiáng)的組分P-4-3進(jìn)行下一步的結(jié)構(gòu)分析和氨基酸組成分析實(shí)驗(yàn)。

圖2 松仁肽二級(jí)分離洗脫曲線

表2 組分P-4-1、P-4-2、P-4-3、抗氧化能力的測(cè)定

2.3 松仁肽-鋅螯合物的分離純化

2.3.1松仁肽-鋅螯合物Sephadex G-50一級(jí)分離結(jié)果

螯合物的洗脫圖3中同樣出現(xiàn)3個(gè)吸收峰，分別記作P-Zn-1、P-Zn-2、P-Zn-3的3個(gè)組分。同樣P-Zn-1、P-Zn-2為相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)，推測(cè)為草芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶、未充分水解的蛋白質(zhì)及其螯合物；P-Zn-3為水解后短肽的螯合物。通過(guò)抗氧化能力的比較得出P-Zn-3的抗氧化能力最強(qiáng)，選擇P-Zn-3進(jìn)行下一步的分離。

圖3 松仁肽-鋅螯合物的一級(jí)分離洗脫曲線

表3 組分P-Zn-1、P-Zn-2、P-Zn-3抗氧化能力的測(cè)定

2.3.2松仁肽-鋅螯合物的Sephadex G-15二級(jí)分離結(jié)果

經(jīng)過(guò)Sephadex G-15的P-Zn-3可得到3個(gè)組分，分別為P-Zn-3-1、P-Zn-3-2和P-Zn-3-3，其中P-Zn-3-3表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。雖然各組分都是多肽分子，但相對(duì)分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)組成不同及某些氨基酸的位置數(shù)量不同均對(duì)抗氧化活性有影響，需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

P-4-1和P-Zn-3-1兩者的4項(xiàng)體外抗氧化指標(biāo)比較可以得出P-Zn-3-1的抗氧化能力高于P-4-1，因此選擇P-4-1、P-Zn-3-3組分進(jìn)行下一步的結(jié)構(gòu)分析和氨基酸組成分析試驗(yàn)。

圖4 松仁肽-鋅螯合物的二級(jí)分離洗脫曲線

表4 組分P-Zn-3-1、P-Zn-3-2、P-Zn-3-3抗氧化能力的測(cè)定

2.4 松仁肽與松仁肽-鋅螯合物的結(jié)構(gòu)表征對(duì)比

2.4.1 氨基酸組成對(duì)比

表5為松仁肽與松仁肽-鋅螯合物中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較，可知松仁肽與鋅發(fā)生螯合反應(yīng)后，蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸和脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均減少，其他11種氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有不同程度的增加。其中天冬氨酸和谷氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加幅度較大，天冬氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由6.306%上升至12.083%，谷氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由14.953%上升到16.076%，且這兩種氨基酸在螯合物中所占比例最高。以上分析表明，酸性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的多肽更容易與Zn2+發(fā)生螯合反應(yīng)，同時(shí)也說(shuō)明了酸性氨基酸與Zn2+的結(jié)合能力更強(qiáng)。

2.4.2 紫外掃描光譜分析

肽與肽鋅螯合物溶液在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的掃描曲線如圖5所示。可以看出，肽與肽鋅螯合物的紫外吸收光譜發(fā)生了明顯的改變。肽在220 nm處具有明顯的吸收峰，而與Zn2+螯合后，其吸收峰移至240 nm處，發(fā)生了紅移。肽的最大吸收峰在220 nm左右，這是由肽鍵上羰基(CO)n→π*電子躍遷引起的；當(dāng)肽與Zn2+發(fā)生螯合反應(yīng)后，Zn2+與肽中的N、O形成配合鍵后，影響了肽鍵上羰基(CO)n→π*電子躍遷，從而使其發(fā)生紅移。

表5 松仁肽與松仁肽-鋅螯合物中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較

由此可知肽與Zn2+之間發(fā)生了相互作用，并且生成了一種不同于肽的新化合物。紫外掃描光譜證明了肽與Zn2+發(fā)生螯合反應(yīng)并有螯合物的生成。

圖5 松仁肽與松仁肽-鋅螯合物的紫外吸收光譜

2.4.3 傅里葉紅外光譜分析

如圖6所示，兩種物質(zhì)在吸收峰位置和吸收強(qiáng)度方面均發(fā)生變化。肽的特征性譜帶包括酰胺A帶、酰胺B帶、酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅲ帶，分別位于3 232.11、2 922.592、1 698.979 cm-1和1 400.549～1 422.727 cm-1處。當(dāng)肽分子與Zn2+離子發(fā)生相互作用生成肽鋅螯合物時(shí)，其相應(yīng)的酰胺譜帶分別移至3 248.985、2 952.965、1 676.802 cm-1和1 391.389～1 430.44 cm-1處。酰胺A帶由亞氨基的伸縮振動(dòng)引起，該位置受N原子和氫鍵的影響；在譜圖中，—NH的吸收峰由3 232.11 cm-1移至3 248.985 cm-1，說(shuō)明在螯合過(guò)程中，肽中的—NH發(fā)生了變化，其透射率升高，可能是Zn原子替代了H原子所致。酰胺B帶與CH2的非對(duì)稱性伸縮振動(dòng)相對(duì)應(yīng)；在譜圖中，肽與肽鋅螯合物的譜帶位置由2 922.592 cm-1移至2 952.965 cm-1，表明CH2基團(tuán)也參與了螯合反應(yīng)。酰胺Ⅰ帶主要由CO的伸縮振動(dòng)引起，同時(shí)還伴隨N—H的彎曲振動(dòng)、C—N的伸縮振動(dòng)及CN的變形振動(dòng)，且譜帶波數(shù)越低氫鍵作用力越強(qiáng)；在圖譜中，CO的吸收峰由1 698.979 cm-1移至1 676.802 cm-1，故羰基參與了配位螯合反應(yīng)，反應(yīng)形成的肽鋅螯合物中相鄰鏈間的分子內(nèi)相互作用力與肽相比明顯減弱。酰胺Ⅲ帶主要由—COOH的伸縮振動(dòng)引起，圖譜中1 400.549～1 422.727 cm-1移至1 391.389～1 430.44 cm-1，表明—COOH可能結(jié)合了鋅。

圖6 松仁肽與松仁肽-鋅螯合物的傅里葉紅外光譜圖

2.4.4 能譜分析

能譜分析的原理是利用具有一定能量的電子束照射樣品，使樣品組成當(dāng)中的原子或分子的電子受激發(fā)而發(fā)射出來(lái)，這些電子具有特征能量，并同時(shí)顯示表面結(jié)構(gòu)的變化。兩種化合物經(jīng)能譜分析可以看出，松仁肽中含有C、N、O等元素，不含有Zn元素；而松仁肽-鋅螯合物中除含有C、N、O元素外，還含有Zn元素，證明了肽鋅螯合物中Zn元素的存在。對(duì)元素進(jìn)行定量分析可知，肽鋅螯合物Zn元素質(zhì)量百分比為2.86%。能譜分析進(jìn)一步證明了螯合反應(yīng)的發(fā)生。

表6 松仁肽各元素占比 %

3 結(jié)論

松仁肽與松仁肽-鋅螯合物經(jīng)過(guò)超濾、Sephadex G-50一級(jí)凝膠過(guò)濾層析分離得到P-1、P-2、P-3、P-4等4個(gè)組分及P-Zn-1、P-Zn-2、P-Zn-3等3個(gè)組分，分別測(cè)試清除羥自由基、總還原能力、ABTS自由清除率和DPPH自由基清除率等4個(gè)指標(biāo)，得出P-4和P-Zn-3組分的抗氧化能力較強(qiáng)，并對(duì)該組分進(jìn)行Sephadex G-15二級(jí)分離，抗氧化能力比較后得出P-4-1、P-Zn-3-1的能力強(qiáng)。

圖7 松仁肽的能譜分析圖

表7 松仁肽-鋅螯合物各元素占比%

圖8 松仁肽-鋅螯合物的能譜分析圖

對(duì)P-4-1和P-Zn-3-1進(jìn)行氨基酸組成、紫外掃描光譜、傅里葉紅外光譜和能譜的測(cè)定，松仁肽與松仁肽-鋅螯合物的氨基酸組成分析可得出氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在螯合前后有所變化。其中天冬氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由6.306%上升至12.083%，谷氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由14.953%上升到16.076%，證明了酸性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的多肽更容易與Zn2+發(fā)生螯合反應(yīng)，同時(shí)也說(shuō)明了酸性氨基酸與Zn2+的結(jié)合能力更強(qiáng)。紫外和紅外的掃描結(jié)果顯示出螯合前與螯合后的吸光度、吸收峰和吸收強(qiáng)度均有所變化。在能譜分析中，根據(jù)不同元素的能量來(lái)辨別不同物質(zhì)的元素組成，得出的能譜結(jié)果顯示，螯合前無(wú)Zn2+的能量柱，螯合后出現(xiàn)Zn2+。

在對(duì)松仁肽與其Zn2+螯合物的分離純化時(shí)，以抗氧化能力作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)不同組分間的比較可看出，與Zn2+螯合后的化合物的抗氧化能力高于未螯合的松仁肽。將得出抗氧化能力最強(qiáng)的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定，得出的結(jié)果顯示兩者的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出明顯的變化，說(shuō)明了有Zn2+參與的螯合反應(yīng)會(huì)對(duì)松仁肽的抗氧化能力有所影響。