王春紅， 楊 璐， 胡 敏， 王曉云， 王利劍

(1. 天津工業(yè)大學(xué) 紡織科學(xué)與工程學(xué)院， 天津 300387；2. 天津工業(yè)大學(xué) 先進(jìn)紡織復(fù)合材料重點實驗室， 天津 300387)

烏拉草是莎草科薹草屬植物[1]，其纖維含量達(dá)50%左右[2]，主要生長于中國東北、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)以及日本等地區(qū)的沼澤濕地[3]。由于其具有獨特的抗菌和保暖性，對于烏拉草的開發(fā)使用已有悠久的歷史,常被編織成鞋墊、草鞋或者床墊等[4-5]。隨著對烏拉草的深入探索，科研人員對其進(jìn)行脫膠、漂白或熱解等處理以獲得較高質(zhì)量的烏拉草產(chǎn)品[6]，或用其制備復(fù)合材料、納米晶須[7]及多孔碳材料[8]等。

烏拉草的功能性不僅體現(xiàn)在纖維中，還體現(xiàn)在提取液中。烏拉草纖維木質(zhì)素含量高，剛性大，手感粗糙，而提取液為液體，具有再加工開發(fā)高效益、精細(xì)化產(chǎn)品的潛能。余克嬌[9]對烏拉草提取液進(jìn)行濃縮提純，確定了純化后的抗菌物質(zhì)為木犀草素。木犀草素為黃酮類化合物，在植物界分布廣泛,大量研究表明其在止咳、祛痰、消炎、抗腫瘤等方面具備藥理作用[10-12]。目前，對于木犀草素的確定及其含量測試主要采取高效液相色譜法[13-14]，其測定簡便，精度高，測定結(jié)果準(zhǔn)確。但關(guān)于多種測試方法之間進(jìn)行對比，以及烏拉草提取液中木犀草素含量與抗菌性能之間關(guān)系的研究卻很少。

本文采用水醇提取法，利用不同醇水比制備烏拉草提取液。通過紫外分光光度法和高效液相色譜法測試提取液中的抗菌物質(zhì)木犀草素的含量，并通過體外抗菌法對提取液進(jìn)行抗菌性能研究，以期為烏拉草提取液作為抗菌劑使用提供數(shù)據(jù)支撐，擴(kuò)大烏拉草的應(yīng)用領(lǐng)域。

1 實驗部分

1.1 主要原料

烏拉草秸稈，產(chǎn)自齊齊哈爾市鐵鋒區(qū)，其成分占比為：脂蠟質(zhì)2.4%，果膠3.4%，半纖維素14%，水溶物5.7%，木質(zhì)素4.5%，纖維素70%。木犀草素，由南京源植生物科技有限公司提供；甲醇、乙醇、98%濃磷酸，由天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司提供；牛肉膏、瓊脂、蛋白胨，由北京奧博星生物有限技術(shù)公司提供；高效液相用蒸餾水，由廣州屈臣氏食品飲料有限公司提供；提取烏拉草用蒸餾水，自制。

1.2 試樣的制備

1.2.1 烏拉草提取液的制備

將烏拉草秸稈剪成長約為1 cm的碎纖維，放入裝有30 mL溶劑的圓底燒杯中，連接冷凝管和橡膠管，整個裝置于電熱套中加熱。在中檔溫度下回流提取1.5 h，提取2次后合并濃縮至30 mL。濃縮條件為30 r/min、60 ℃。其中提取試劑是乙醇和水的混合溶液，體積比分別為3∶1、2∶2、1∶3、0∶4，提取的提取液依次編號分別為a、b、c、d。

1.2.2 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

使用30 mL乙醇溶液配制質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的木犀草素溶液，搖勻。采用移液槍分別量取上述溶液0.05、0.1、0.5、1、2 mL置于25 mL容量瓶中，加入乙醇溶解至定容刻度線，再次搖勻備用。這5種標(biāo)準(zhǔn)溶液的木犀草素質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、4.0、8.0、16.0 μg/mL。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液用帶有濾頭的注射器分別注入比色皿中，待用。

1.2.3 磷酸溶液的配制

用量筒量取467 mL屈臣氏純凈水置于廣口瓶中，加入1 mL磷酸配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的磷酸溶液。

1.2.4 培養(yǎng)基的制備

配制5個培養(yǎng)基，配方如表1所示。首先，取1～5號錐形瓶依次加入200 mL固體培養(yǎng)基A、B、C、D、E，6號和7號錐形瓶均加入20 mL液體培養(yǎng)基E，8號錐形瓶為50 mL蒸餾水。將所有錐形瓶、培養(yǎng)皿、吸頭、離心管等工具放入高壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行滅菌。然后，在6號錐形瓶接種大腸桿菌，7號錐形瓶接種金黃色葡萄球菌，均于120 r/min、37 ℃條件下的搖床中培養(yǎng)20 h，制備2種適宜濃度的菌懸液。將菌懸液稀釋到合適濃度，分別稀釋107、108、109倍3個梯度，經(jīng)實驗證明，稀釋108倍最為合適。然后將培養(yǎng)基A、B、C、D倒入平板，依次編號分別為A1、A2、A3，B1、B2、B3，C1、C2、C3，D1、D2、D3，此為實驗組；培養(yǎng)基E倒入的平板編號依次為E1、E2、E3，此為空白對照組。每個實驗樣品具有3個平行試樣。將適宜濃度的0.1 mL菌懸液用三角玻璃棒均勻涂抹于培養(yǎng)皿樣品上。所有樣品倒放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

表1 培養(yǎng)基配制方法

1.3 測試方法

采用6175-3C型pH計(天津億諾科學(xué)儀器有限公司)測定4種提取液的pH值。將pH電極放于溶液中，待示數(shù)穩(wěn)定后記錄。每種試樣測量5次，取平均值。

采用METTER TOLEDO型電導(dǎo)率儀(Five Eosy有限公司)對4種提取液的電導(dǎo)率進(jìn)行測試。取下電導(dǎo)儀探頭將其浸入溶液中，待示數(shù)穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù)。每種試樣測量5次，取平均值。

在使用Thermo Scentific型紫外分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)測試中，通過全波長掃描確定木犀草素紫外分光光度計測試波長。在特定波長下，檢測木犀草素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。

在使用SHIMADZU LC-15C型高效液相色譜儀(俊齊儀器設(shè)備有限公司)測試中，精密吸取樣品注入液相色譜儀，進(jìn)樣分析記錄峰面積。色譜柱為C18，250 mm，5 μm;流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液(體積比為56∶44);檢測波長直接使用紫外分光光度計法測得的波長350 nm;流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。配制體積比為1∶1的甲醇和水的混合溶液，超聲30 min用以洗脫高效液相色譜儀。

用CC-570 SUNTex型菌落計數(shù)儀(上海闊思電子有限公司)觀測樣品中細(xì)菌的分布，并測試各樣品的菌落數(shù)，按下式計算抑菌率：

式中：Y為試樣的抑菌率，%；Wt為對照樣活菌濃度的平均值；Qt為試樣活菌濃度的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將紫外分光光度法與高效液相色譜法測試的結(jié)果分別在Origin中擬合。在紫外分光光度法測試結(jié)果中，根據(jù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程測試實驗樣品的吸光度值，計算提取液中木犀草素含量。在高效液相色譜法測試中，根據(jù)不同提取液樣品高效液相色譜圖中木犀草素特征峰面積和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出各提取液中木犀草素質(zhì)量濃度。在抗菌測試中，使用菌落計數(shù)器計算平板菌落濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 導(dǎo)電率和pH值測試結(jié)果分析

4種提取液因溶劑不同，從烏拉草秸稈中提取出的物質(zhì)也不盡相同，提取液性能有所差異，其pH值和電導(dǎo)率測試結(jié)果如表2所示?？梢钥闯?，隨著提取溶劑中水的比例的增加，提取液的電導(dǎo)率逐漸增大，最大為546 μS/cm，pH值逐漸減小且都呈現(xiàn)酸性。

表2 不同提取液的pH值和電導(dǎo)率測試結(jié)果

圖1示出各提取液的表觀顏色。由于木犀草素中具有酚羥基，所以其水溶液呈弱酸性[15]。由表2可知，提取液pH值均小于7，則提取的物質(zhì)主要呈酸性，說明溶液中可能存在木犀草素。木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品的水溶液呈淡淡的亮黃色，但圖1提取液中顯示出不同的顏色，是因為液體中除木犀草素存在外，還溶解有其他化學(xué)物質(zhì)。

圖1 提取液的表觀顏色圖

2.2 紫外分光光度法測試結(jié)果分析

以乙醇為空白對照樣，木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品為實驗樣，在波長為190～600 nm區(qū)間內(nèi)利用紫外分光光度計掃描。掃描結(jié)果表明，在350 nm波長處的吸收峰最強(qiáng)，所以本文將350 nm作為檢測波長對提取液中木犀草素進(jìn)行檢測。

在波長為350 nm下測試木犀草素標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外光吸光度，并根據(jù)測試結(jié)果繪制木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品紫外分光測試標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為

Y1=0.044 94X1+0.061 96

圖2 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外分光測試曲線

采用紫外分光光度法測試不同溶劑提取液中木犀草素的質(zhì)量濃度，計算結(jié)果如表3所示。表中顯示，隨著提取溶劑中水的比例的增加，木犀草素的質(zhì)量濃度在逐漸減少。其中提取液a中檢測的木犀草素的質(zhì)量濃度最高，提取液b、c、d中木犀草素質(zhì)量濃度相近，三者差值僅在0.3 μg/mL內(nèi)。由表3還可以看出，醇水比超過50%后，提取液中木犀草素的質(zhì)量濃度陡然上升，從1.36 μg/mL突增到29.22 μg/mL。

表3 采用紫外分光光度法測得的不同溶劑提取液中木犀草素的質(zhì)量濃度

相對于水分子，有機(jī)溶劑無水乙醇的分子質(zhì)量大，極性更強(qiáng)，易提取烏拉草秸稈中物質(zhì)。同時木犀草素溶于乙醇，微溶于水[16]，所以隨著乙醇比例的增加，所測物質(zhì)提取量也隨之增大。

2.3 高效液相色譜法測試結(jié)果分析

圖3示出木犀草素標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖?？芍?，在350 nm波長條件下，色譜圖具有唯一的特征峰，出峰時間在6.4 min左右。隨抗菌物質(zhì)質(zhì)量濃度的增大，色譜圖中特征峰的峰值及峰面積相應(yīng)增大。由此對應(yīng)關(guān)系繪制出木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。擬合的此標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為

Y2=99 233X2+35 626

圖3 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖

圖4 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5示出不同提取液的高效液相色譜圖。色譜圖中不同時間出現(xiàn)的特征峰代表不同的物質(zhì)，峰值的高低及面積代表物質(zhì)的濃度[17]。根據(jù)圖3標(biāo)準(zhǔn)色譜圖可知，在6.4 min左右出現(xiàn)的峰為木犀草素的特征峰。在圖5提取液樣品高效液相色譜圖中雖然存在多個特征峰，但在固定時間6.4 min左右均有高低不同的峰出現(xiàn)，由此可以確定4種提取液中都含有木犀草素。不同提取液的色譜圖中木犀草素特征峰的峰值及峰面積不同，說明各提取液中木犀草素含量有所差異。

圖5 不同提取液樣品高效液相色譜圖

木犀草素質(zhì)量濃度計算結(jié)果如表4所示?？芍?，隨著提取液中水的比例的增大，木犀草素特征峰面積逐漸減小，即木犀草素質(zhì)量濃度逐漸減小。其中提取液a中木犀草素質(zhì)量濃度遠(yuǎn)大于提取液b、c、d，且提取液b、c、d中木犀草素質(zhì)量濃度相近。

表4 高效液相色譜法得到的不同提取液中木犀草素的質(zhì)量濃度

2.4 抗菌性能測試結(jié)果與分析

2.4.1 對大腸桿菌的抗菌測試結(jié)果分析

圖6示出對照樣和4種提取液對大腸桿菌的抗菌效果圖，抑菌率結(jié)果如表5所示。圖6(e)對照樣中細(xì)菌菌落大小合適，細(xì)菌菌落沒有連片，散落均勻，可肉眼清晰分辨，易于計數(shù)，得出的數(shù)據(jù)較準(zhǔn)確。圖6(a)～(d)實驗樣中的菌落數(shù)量明顯減少，且隨著提取溶劑中水比例的增加，抗菌效果有所減弱，但最低抑菌率高達(dá)75.5%。

圖6 不同醇水比烏拉草提取液對大腸桿菌的抗菌效果圖

表5 烏拉草提取液對大腸桿菌的抑菌率

根據(jù)GB/T 20944.3—2008《紡織品 抗菌性能的評價 第3部分:振蕩法》規(guī)定，只要樣品對大腸桿菌的抑菌率≥70%，即能表明該樣品具有抗菌性。觀察發(fā)現(xiàn)，不同溶劑的烏拉草提取液抑菌率均大于70%，滿足要求?？梢?，4種烏拉草提取液對大腸桿菌都具有良好的抗菌性，其中提取液a的抗菌性能最好，提取液b、c、d的抗菌性相近。結(jié)合木犀草素質(zhì)量濃度測試結(jié)果可知，木犀草素質(zhì)量濃度與對大腸桿菌的抗菌性均成正相關(guān)。

2.4.2 對金黃色葡萄球菌的抗菌測試結(jié)果分析

圖7示出對照樣和4種提取液對金黃色葡萄球菌的抗菌效果圖，計算的抑菌率如表6所示。圖7(e)中對照樣的細(xì)菌菌落大小合適，易于計數(shù)，得出的數(shù)據(jù)較準(zhǔn)確。圖7(a)～(d)試驗樣中的菌落數(shù)明顯減少。隨著提取溶劑中水的比例的增加，抗菌效果有減弱的趨勢，其中具有最小抑菌率的提取液其抑菌率為74.6%，說明整體抗菌效果良好。

圖7 不同醇水比烏拉草提取液對金黃色葡萄球菌抗菌效果圖

由表6可知，4種烏拉草提取液對金黃色葡萄球菌都具有良好的抗菌性，其中提取液a的抗菌性能最好，提取液b、c、d的抗菌性相近，抗菌性能與所測的木犀草素含量呈正相關(guān)。

表6 烏拉草提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌率

3 結(jié) 論

本文以烏拉草秸稈為原料制備提取液，測定其基本性能，使用紫外分光光度法和高效液相色譜法測試提取液中木犀草素含量，并對其抑菌活性進(jìn)行測試，得到以下主要結(jié)論。

1)隨著提取溶劑中水的比例的增加，提取液的電導(dǎo)率逐漸增大，pH值逐漸減小且都呈現(xiàn)酸性。

2)使用紫外分光光度法和高效液相色譜法2種方法對4種提取液進(jìn)行測試，得出的木犀草素質(zhì)量濃度變化趨勢一致。隨著提取溶劑中水的比例的增大，木犀草素的質(zhì)量濃度逐漸減少。前者測試的目標(biāo)物質(zhì)質(zhì)量濃度數(shù)值低于后者測試結(jié)果。

3)4種提取液對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均具有良好的抗菌性，且木犀草素質(zhì)量濃度與抗菌性能呈正相關(guān)。因其優(yōu)異的抗菌性能，提取液可做成微膠囊應(yīng)用到織物整理或溶進(jìn)紡絲液中，具有較好的應(yīng)用前景。