王靜 馬曉靜

摘 要：采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法對(duì)全麥粉中嘔吐毒素含量的不確定度進(jìn)行評(píng)定，并依據(jù)測(cè)量不確定度評(píng)定的指導(dǎo)文件建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)測(cè)量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品前處理、儀器設(shè)備等不確定度來(lái)源進(jìn)行分析和評(píng)定，得出擴(kuò)展不確定度為0.19mg/kg，（k=2）。通過(guò)評(píng)定發(fā)現(xiàn)，樣品重復(fù)性測(cè)量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及樣品前處理是該方法不確定度的主要來(lái)源。

關(guān)鍵詞：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀? 內(nèi)標(biāo)? 全麥粉? 嘔吐毒素? 不確定度

谷物生長(zhǎng)過(guò)程中極易受到真菌毒素的污染，這不僅會(huì)對(duì)糧食產(chǎn)量造成極大影響，還可能給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大損失[1，2]。嘔吐毒素是主要存在于小麥、玉米等糧食及其制品中的真菌毒素，人體食用了被嘔吐毒素污染的食物后，會(huì)出現(xiàn)惡心、腹瀉、嘔吐等癥狀[3]。因此，檢測(cè)小麥中的嘔吐毒素具有非常重要的意義。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀在食品安全檢測(cè)中具有準(zhǔn)確度較高、受基質(zhì)干擾影響小等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為檢測(cè)嘔吐毒素的主要方法之一[4]。

此外，為了更加準(zhǔn)確地表達(dá)分析結(jié)果，需要引入測(cè)量不確定度（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“不確定度”），其是表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[5，6]。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果接近臨界值時(shí)，不確定度的引入能夠更準(zhǔn)確地反映真實(shí)結(jié)果[7，8]。

本實(shí)驗(yàn)提取全麥粉中嘔吐毒素的過(guò)程免去了真菌毒素提取中常用的免疫親和柱凈化處理，提高了提取效率，節(jié)省了人工與成本;采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)嘔吐毒素進(jìn)行測(cè)定并評(píng)定不確定度，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定全麥粉中嘔吐毒素的不確定度評(píng)定方法[9，10]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

嘔吐毒素（DON）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（103±1.2μg/mL），Sigma-alorich;穩(wěn)定同位素13C15-DON標(biāo)準(zhǔn)溶液（2μg/mL），國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院;乙腈（色譜純）迪馬科技;甲酸（質(zhì)譜級(jí)），Sigma;乙酸（色譜級(jí)），F(xiàn)isher;蒸餾水，屈臣氏。

1.2 儀器和設(shè)備

QTRAP-5500型液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源），美國(guó)AB公司;X1R型高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)熱電公司;PL602-L型分析天平，梅特勒-托利多（上海有限公司）;IKA渦旋混合器，廣州艾卡;QB-212型搖擺式混勻器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;JSFM-Ⅱ型糧食水分測(cè)試粉碎磨，中儲(chǔ)糧成都糧食儲(chǔ)藏科學(xué)研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制

使用1mL移液槍移取1mL嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相（乙腈︰水=3︰97）定容，得到嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度為1030ng/mL，儲(chǔ)存于4℃冰箱。

分別準(zhǔn)確移取312.5、625、1250、2500、5000μL嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)使用液于10mL容量瓶中，加入初始流動(dòng)相稀釋并定容至刻度，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的濃度分別為32.19、64.38、128.75、257.5、515ng/mL。

1.3.2 樣品前處理過(guò)程

準(zhǔn)確稱(chēng)取5g（精確到0.01g）試樣置于50mL離心管中，加入20mL提取液（乙腈︰水︰乙酸=70︰29︰1），渦旋混勻后置于搖擺式混勻器中振蕩30min，以6000r/min離心10min，吸取0.5mL上清液于1.5mL離心管中，加入0.5mL水并渦旋混勻，在4℃下以12000r/min離心10min，上清液過(guò)0.2μm的聚四氟乙烯濾膜。分別吸取180μL濾液和標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線于含有20μL穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)工作液的插管中，渦旋混勻，進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18柱（柱長(zhǎng)100mm，柱內(nèi)徑2.1mm，填料粒徑1.7μm）;流速：0.4mL/min;柱溫：35℃;進(jìn)樣量：2μL。流動(dòng)相：A相，水（0.1%甲酸）;B相，乙腈（0.1%甲酸）;梯度洗脫。

梯度洗脫程序：0～0.5min，3%B;0.5～1.0min，3%～10%B;1.0～6.0min，10%～90%B;6.0～7.5min，90%B;7.5～7.6min，90%～3%B;7.6～9.0min，3%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）離子源，正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multi-reaction monitor，MRM）模式;離子源溫度：600℃;質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

不確定度數(shù)學(xué)模型為：

式中：X為樣品中嘔吐毒素的含量（μg/kg），ρ為計(jì)算得到測(cè)定液中嘔吐毒素的質(zhì)量濃度（ng/mL），V為加入提取液的體積（20mL），f為稀釋液稀釋因子2，m為樣品質(zhì)量5g。

2.2 不確定度分量的來(lái)源分析

根據(jù)數(shù)學(xué)模型及實(shí)驗(yàn)過(guò)程，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定全麥粉中嘔吐毒素含量的不確定度來(lái)源有以下幾個(gè)方面：①樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)引入的不確定度;②樣品質(zhì)量稱(chēng)量引入的不確定度;③標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液自身的不確定度;④標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋、工作曲線配置、標(biāo)準(zhǔn)曲線最小二乘法擬合產(chǎn)生的不確定度;⑤樣品制備、提取及稀釋過(guò)程產(chǎn)生的不確定度;⑥液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的不確定度。此外，同位素內(nèi)標(biāo)13C15-DON引入的不確定度主要體現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制及樣品的內(nèi)標(biāo)溶液的加入，因此可忽略不計(jì)。

2.3 不確定度分量的評(píng)定及計(jì)算

2.3.1 樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)引入的不確定度

在重復(fù)性測(cè)定條件下，對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行6次測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

測(cè)量結(jié)果重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2 樣品稱(chēng)量引入的不確定度

稱(chēng)量采用百分之一電子分析天平，其最大允差為±0.05g，假定其為矩形分布，則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

2.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液自身的不確定度

已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)給出的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（103±1.2μg/mL）的擴(kuò)展不確定度為±1.2μg/mL，按正態(tài)分布考慮，k=2，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為： 。

2.3.3.2 工作曲線配制引入的不確定度

工作曲線配制過(guò)程的不確定度主要來(lái)源于量器自身的誤差，以及溶劑在使用過(guò)程中因環(huán)境溫度引起的體積變化。依據(jù)《常用玻璃量具檢定規(guī)程》（JJG 196-2006）及《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646-2006）的要求，玻璃量器及移液槍對(duì)應(yīng)的最大允許誤差按B類(lèi)評(píng)定，服從矩形分布，? ? ? ? ? ;200μL移液槍的最大允許誤差為0.003mL，1mL移液槍的最大允許誤差為0.01mL，工作曲線配制過(guò)程中量器引入的不確定度見(jiàn)表3。

實(shí)驗(yàn)室的溫度變化范圍通常為（20±5）℃，考慮到液體的體積膨脹，20℃時(shí)純水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線用初始流動(dòng)相定容，其膨脹系數(shù)與純水相當(dāng)——近似于2.1×10-4℃，溫度波動(dòng)按矩形分布計(jì)算，? ? ? ? ，則標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制過(guò)程中的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度可合成為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度

采用6個(gè)濃度梯度的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，分別用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法重復(fù)測(cè)定2次，以濃度比為橫坐標(biāo)，峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，利用數(shù)據(jù)處理軟件擬合得到線性回歸方程為yi=a×xi+b，式中：a為斜率、b為截距，測(cè)定結(jié)果及數(shù)據(jù)計(jì)算見(jiàn)表4。

則由工作曲線擬合所產(chǎn)生的不確定度計(jì)算公式如下：

S為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差：

式中：p為試樣測(cè)試重復(fù)次數(shù)，6次;n為擬合直線的數(shù)據(jù)總數(shù)，12;為試樣測(cè)試濃度的平均值;為繪制擬合直線響應(yīng)值（6個(gè)）的平均值;xi為標(biāo)準(zhǔn)曲線各個(gè)濃度點(diǎn)的值

工作曲線擬合所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.5 樣品稀釋過(guò)程的不確定度

稀釋過(guò)程中使用20mL單標(biāo)吸量管量取提取液，提取液經(jīng)提取、離心后，用1mL移液槍吸取0.5mL過(guò)濾液，并用0.5mL水稀釋?zhuān)^(guò)濾后進(jìn)質(zhì)譜儀測(cè)定。依據(jù)《常用玻璃量具檢定規(guī)程》（JJG 196-2006）的要求，20mL單標(biāo)吸量管的最大允許為誤差按B類(lèi)評(píng)定，服從矩形分布，k= 。提取液中由于乙酸的加入量為微量，故可忽略溫度波動(dòng)引起的乙酸體積變化。因此，溫度波動(dòng)引起提取液的體積變化為（1.2×10-3 ×0.7+2.1×10-4×0.29）×5×20=0.0901mL，按均勻分布計(jì)算，? ? ? ? ? ?，合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量見(jiàn)表5。

則樣品稀釋過(guò)程中的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度可合成為：

2.3.6 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的不確定度

由液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀校準(zhǔn)證書(shū)提供的峰面積重復(fù)性不確定度為1.1%，k=2，則由儀器引入的相對(duì)不確定度為：

3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成與擴(kuò)展

3.1 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品測(cè)量重復(fù)性、樣品稱(chēng)量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品稀釋、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀等不確定度分量值，見(jiàn)表6。

將各分量合成計(jì)算全麥粉中嘔吐毒素的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

全麥粉中嘔吐毒素的含量為2.441mg/kg，相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：U（W）=2.441×0.0393=0.0959mg/kg。

3.3 擴(kuò)展不確定度

擴(kuò)展不確定度（U），通過(guò)使用包含因子k=2，計(jì)算得到：U=U（W）×2=0.0959×2=0.19mg/kg。

全麥粉中嘔吐毒素的含量為（2.441±0.19）mg/kg，k=2。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定全麥粉中的嘔吐毒素，該方法免去了傳統(tǒng)免疫親和柱凈化步驟，減化了樣品前處理過(guò)程，通過(guò)液相-質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過(guò)對(duì)各個(gè)不確定分量的評(píng)定及分析可以看出，樣品重復(fù)性測(cè)量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及樣品稀釋是該方法不確定度的主要來(lái)源，由于采用內(nèi)標(biāo)法定量，因此忽略了回收率的不確定度。通過(guò)評(píng)定實(shí)驗(yàn)過(guò)程的不確定度，可以有效地控制關(guān)鍵步驟，進(jìn)而減小樣品檢測(cè)過(guò)程中的偏差，達(dá)到更準(zhǔn)確測(cè)定樣品結(jié)果的目的。

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作者簡(jiǎn)介：王靜（1982-），女，漢族，工作單位：河北省糧油質(zhì)量檢測(cè)中心，職稱(chēng)：高級(jí)工程師，學(xué)歷：碩士，研究方向：糧油質(zhì)量檢測(cè)。