陳書秀，孫 娟，李 霞，趙 楠，史 良，李曉捷

(山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻與海參技術(shù)創(chuàng)新中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點實驗室，山東 煙臺 264003)

籠目海帶(KjellmaniellacrassifoliaMiyabe)，又稱厚葉切氏海帶、厚葉解曼藻，屬于褐藻門、褐藻綱、海帶目、海帶科，主要分布于日本北海道函館和室蘭的深水區(qū)[1]?；\目海帶含有豐富的巖藻多糖，其含量比普通海帶高，且其他雜糖含量相對較少，因此是提取巖藻多糖的重要原料。巖藻多糖具有調(diào)節(jié)血脂、降血糖、降血壓、抗腫瘤等生物活性[2]。

籠目海帶是一種大型褐藻，一般在冬季和初春進行生長和繁殖，研究其生長發(fā)育與環(huán)境條件的關(guān)系，有利于提高養(yǎng)殖效益，優(yōu)化養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)等。國內(nèi)外學(xué)者對環(huán)境因子如溫度、光照、營養(yǎng)鹽與海帶生長發(fā)育關(guān)系做了一系列的研究[3-8]，但關(guān)于光對籠目海帶生長發(fā)育的影響尚未見報道。光強對海帶屬種類的生長發(fā)育有較大的影響，低溫弱光條件下會長期處于配子體階段，改變生長環(huán)境條件，恢復(fù)合適的光照強度，海帶配子體可以正常發(fā)育形成配子體并產(chǎn)生孢子體[9]，海帶有孢子體階段能夠耐受較高的光強，隨孢子體的變大，其耐受的光照強度減弱[10]。藻類配子或孢子的發(fā)生還受光周期的影響，如柏桉藻(Bonnemaisoniahamifera)以隱藏孢子體的狀態(tài)越夏，在秋冬季短日照時產(chǎn)生孢子；杉藻(Gigartinaacicularis)的雌雄配子體僅在日照短于12 h時形成；礁膜(Monostromagrevillei)的孢子的產(chǎn)生也受光周期的控制[11]。

本研究以籠目海帶雌、雄配子體為材料，通過顯微觀察配子體生長發(fā)育狀態(tài)，計算配子體發(fā)育率等，探究不同光照強度及光照周期對籠目海帶配子體生長發(fā)育的影響，以期為籠目海帶配子體克隆育苗技術(shù)提供理論支持，為其進一步擴大養(yǎng)殖奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及培養(yǎng)方法

籠目海帶配子體保存條件為溫度10℃，鹽度31，光照強度10 μmol·m-2s-1，24 h光照。取適量的雌雄配子體分別用300目篩絹過濾，獲得含2～5個細胞的細胞段懸濁液，然后按照細胞密度2∶1的比例將雌雄配子體混合均勻，取10 mL懸濁液加入到12 cm(直徑)的培養(yǎng)皿中，放置在不同的光照強度、光照周期下進行培養(yǎng)。在海水中添加NaNO3、KH2PO3、檸檬酸鐵作為培養(yǎng)液，總有效氮為2 mg/L，有效磷為0.2 mg/L，有效鐵為0.05 mg/L。設(shè)置不同的光照強度和光照周期進行單因子實驗，每個處理組設(shè)置3個重復(fù)。

根據(jù)常見養(yǎng)殖海帶品種對光的適應(yīng)性[10，12]，本實驗將光照強度(光照周期均為10L∶14D)設(shè)置為：5、10、20、30、40、60、80、100、120 μmol·m-2s-1。光照周期(光照強度均為15 μmol·m-2s-1)設(shè)置為L/D：6∶18、10∶14、12∶12、16∶8、20∶4。

1.2 配子體生長、發(fā)育指標(biāo)的測定

在顯微鏡下觀察配子體的生長發(fā)育狀態(tài)，每3天拍照1次，實驗周期30 d。

配子體發(fā)育率的計算：每個培養(yǎng)皿隨機觀察10個100×視野，分別統(tǒng)計卵囊形成、排卵、幼孢子體和總細胞數(shù)，按卵囊形成數(shù)、排卵數(shù)和孢子體數(shù)之和占總細胞數(shù)的百分比計算發(fā)育率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0軟件對發(fā)育率進行單因子方差分析、多重比較(P<0.05表示差異顯著)。用Excel軟件作圖。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同光照強度對籠目海帶配子體發(fā)育的影響

從圖1可以看出，籠目海帶配子體在光照強度范圍為5～100 μmol·m-2s-1條件下均可進入生殖生長階段，均出現(xiàn)卵囊、排卵及孢子體(圖2d、e、f)。單因子方差分析結(jié)果表明，光照強度對籠目海帶配子體發(fā)育率有顯著影響(P<0.05)。多重比較結(jié)果如圖3所示，培養(yǎng)天數(shù)為15 d時，60 μmol·m-2s-1條件下發(fā)育率(11.06%)顯著高于其他組。培養(yǎng)到第19天 ，各組的孢子體數(shù)目顯著增加，20～40 μmol·m-2s-1光照強度條件下發(fā)育率(42.15%～51.72%)顯著高于其他組。培養(yǎng)后期，除高光強100～120 μmol·m-2s-1條件下發(fā)育率(42.39%、13.33%)顯著低于其他組外，其余光照強度條件下，發(fā)育率差異不顯著。

2.2 不同光照周期對籠目海帶配子體發(fā)育的影響

從圖4可以看出，籠目海帶配子體在5個不同光照周期條件下均可進入生殖生長階段，均出現(xiàn)卵囊、排卵及孢子體(圖2d、e、f)。單因子方差分析結(jié)果表明：光照周期對籠目海帶配子體發(fā)育率有顯著影響(P<0.05)。多重比較結(jié)果(圖5)表明，培養(yǎng)第12～25天時，16L∶8D、20L∶4D光照周期條件下發(fā)育率(6.68%～69.87%、6.64%～76.71%)顯著高于其他組。培養(yǎng)第28～32天，6L∶18D條件下發(fā)育率(23.90%、43.95%)顯著低于其他組以外，其余組之間的差異不顯著，發(fā)育率均可達到60%～80%，其中，光照時間最長的處理組即20L∶4D的發(fā)育率(74.54%)最高且孢子體細胞列數(shù)最多(圖5)。

注：A1、A2、A3分別為6L∶18D第19天、第25天、第32天；B1、B2、B3分別為10L∶14D第19天、第25天、第32天；C1、C2、C3分別為12L∶12D第19天、第25天、第32天；D1、D2、D3分別為16L∶8D第19天、第25天、第32天；E1、E2、E3分別為20L∶4D第19天、第25天、第32天。

注：柱狀圖上小寫字母下標(biāo)相同數(shù)字的為同一組多重個比較，同一組的不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討論

藻類對光照強度的需求有一個適宜范圍(即補償光照強度和飽和光照強度之間)，在此適光范圍內(nèi)，光照強度增加，光合作用加快，從而有利于生物量的增加；超過光飽和強度后，光合作用反而減弱以致受到抑制。本實驗結(jié)果表明，光照強度對籠目海帶配子體的發(fā)育有顯著的影響，籠目海帶配子體發(fā)育的最適光照強度為20～40 μmol·m-2s-1。國內(nèi)外專家也做了其他海帶配子體的相關(guān)研究，楊迎霞等[13]研究結(jié)果表明，在4 500 lx光照強度，充氣懸浮培養(yǎng)條件下，海帶配子體克隆具有較高的瞬時生長率。孫娟等[14]研究表明，多肋藻雌配子體培養(yǎng)光照強度應(yīng)保持在1 000 lx左右，雄配子體培養(yǎng)光照強度在2 000 lx左右為宜。Lee[15]的研究表明，當(dāng)光照強度為80 μmol·m-2s-1時，皺海帶(L.relifiosa)配子體的繁殖率達到最大。Lüning K等[16]研究表明通常條件下海帶配子體在充足光照下會進入生殖生長階段，在低光下則維持營養(yǎng)生長狀態(tài)。

本次實驗結(jié)果表明，在15 μmol·m-2s-1光照強度條件下，較長的光照時間(16L∶8D、20L∶4D)有利于促進配子體的生殖生長進程，促進卵囊的形成、受精卵的排放及孢子體的生長。張鑫等[17]研究了不同光照周期對羊棲菜有性繁殖過程的影響，結(jié)果表明，長光照周期可以明顯促進卵子的排放，延長卵子的存活時間，提高卵子的受精效率，有利于合子的發(fā)育與生長。除此之外，光質(zhì)、營養(yǎng)鹽、溫度等也是影響海帶配子體生長發(fā)育的重要因素。如隋曉偉等[18]研究表明光質(zhì)對海帶配子體的生長和發(fā)育具有顯著的影響，促進作用最大的是藍光，其次是綠光，紅光可抑制配子體的發(fā)育。鞠青等[19]研究表明N∶P>15∶1時會降低海帶配子體的形成；王軍等[20]研究也表明利尻海帶在10℃條件下，雌、雄配子體的成熟度最高；在20℃條件下，配子體不發(fā)育。Martins N等[21]發(fā)現(xiàn)掌狀海帶配子體生長的最適溫度范圍為10～18℃，而發(fā)育的最適溫度范圍為5～15℃。Schreiber E[22]研究表明糖海帶配子體生長的最適溫度范圍為13～18℃，而發(fā)育的最適溫度為6℃。

另外，各種環(huán)境因子對海帶配子體的生長發(fā)育的影響一般存在著交互作用，如皺海帶配子體發(fā)育過程中，在光照適宜和營養(yǎng)鹽充足的條件下，溫度對配子體的發(fā)育影響不顯著[23]。王軍等[20]研究也表明了溫度是影響利尻海帶配子體成熟的主要因子，照度只是個輔助因子。王瀟等[24]研究表明鐵和氮磷對海帶 ‘黃官1號’配子體的營養(yǎng)生長和生殖生長具有協(xié)同促進作用，鐵是海帶配子體由營養(yǎng)生長到發(fā)育成熟再到有性生殖過程中的關(guān)鍵因素。因此，進一步深入研究各環(huán)境因子對籠目海帶配子體生長發(fā)育的影響是利用籠目海帶配子體育苗的關(guān)鍵。

4 結(jié)論

本文僅利用單因子實驗研究了光照強度及光照周期對籠目海帶配子體生長發(fā)育的影響，結(jié)果表明在光照周期為10L∶16D條件下，籠目海帶配子體發(fā)育的最適光照強度為20～40 μmol·m-2s-1；在光照強度為15 μmol·m-2s-1條件下，籠目海帶配子體發(fā)育的最適光照周期為16L∶8D、20L∶4D。

綜上可知，各種環(huán)境因子對海帶配子體的生長發(fā)育的影響一般存在著交互作用，因此，在籠目海帶配子體育苗過程中需要進行多方面的考慮，以期達到最好的育苗效果。