姜雄　李木清　毛滔　劉梨　程學(xué)榮　楊振武　杜攀攀

〔摘要〕 目的 通過研究象皮生肌膏對(duì)大鼠慢性難愈性創(chuàng)面模型PTEN、p-AKT、VEGF蛋白表達(dá)的影響，探討象皮生肌膏促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制。方法 從72只SD雄性大鼠中隨機(jī)選取18只為空白組，其余54只大鼠使用全層皮膚缺損法制備慢性難愈性創(chuàng)面模型，并隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、模型組，每組18只。造模完成后實(shí)驗(yàn)組予象皮生肌膏外敷，對(duì)照組予重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子凝膠外敷，模型組和空白組予生理鹽水外涂，于造模后的第3、7、14天觀察創(chuàng)面愈合情況，計(jì)算創(chuàng)面愈合率，HE染色觀察皮膚組織形態(tài)，ELISA檢測各組皮膚組織PTEN、p-AKT、VEGF蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 第3、7、14天實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組創(chuàng)面愈合率均高于模型組（P<0.05），且第7天實(shí)驗(yàn)組優(yōu)于對(duì)照組（P<0.05）。HE染色結(jié)果顯示，空白組第3、7、14天皮膚組織完整，前后無明顯形態(tài)學(xué)變化;模型組第3、7天創(chuàng)面組織大量炎性細(xì)胞浸潤、表皮大量壞死脫落，第14天見少量毛細(xì)血管形成;實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組第3天炎性細(xì)胞浸潤、表皮灶性壞死脫落，第7、14天炎性細(xì)胞浸潤逐漸減少、較多成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管增生、肉芽組織基本形成。第3、7、14天空白組PTEN、p-AKT、VEGF蛋白表達(dá)水平均無明顯差異（P>0.05）。第3、7、14天模型組PTEN蛋白表達(dá)水平均低于空白組（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均低于模型組（P<0.05），且第7天達(dá)到最低水平（P<0.05）。第3、7、14天模型組p-AKT蛋白表達(dá)水平均高于空白組（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均高于模型組（P<0.05），且第7天達(dá)到最高水平（P<0.05）。第3、7、14天模型組VEGF蛋白表達(dá)水平均低于空白組（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均高于模型組（P<0.05），且第7天達(dá)到最高水平（P<0.05）。結(jié)論 象皮生肌膏能降低大鼠創(chuàng)面中PTEN蛋白表達(dá)水平、提高p-AKT、VEGF蛋白表達(dá)水平，加快慢性創(chuàng)面愈合速度，調(diào)控PTEN/AKT/VEGF信號(hào)通路可能是象皮生肌膏促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合的機(jī)制之一。

〔關(guān)鍵詞〕 象皮生肌膏;慢性難愈性創(chuàng)面;PTEN;p-AKT;VEGF

〔中圖分類號(hào)〕R275.9? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.01.012

〔Abstract〕 Objective To study the effect of Xiangpi Shengji Ointment on PTEN， p-AKT and VEGF protein expression in rat chronic wound model， and to explore the mechanism of Xiangpi Shengji Ointment in promoting wound healing. Methods 18 SD male rats were randomly selected as the blank group， and the remaining 54 rats were made into chronic refractory wound model by full-thickness skin defect method， and were randomly divided into the experimental group， the control group and the model group， with 18 rats in each group. After modeling， the experimental group was externally applied with Xiangpi Shengji Ointment， the control group was externally applied with recombinant bovine basic fibroblast growth factor gel， and the model group and the blank group were externally coated with normal saline. The wound healing was observed on the 3rd， 7th and 14th day after modeling， the wound healing rate was calculated， the tissue morphology was observed by HE staining， and the expressions of PTEN， p-AKT and VEGF protein in skin tissue in each group were detected by ELISA. Results On the 3rd， 7th and 14th day， the wound healing rate of the experimental group and the control group was higher than the model group （P<0.05）， the experimental group was better than the control group on the 7th day （P<0.05）. The results of HE staining showed that on the 3rd， 7th and 14th day， the skin tissue in the blank group was intact， and there was no obvious morphological change before and after. In the model group， a large number of inflammatory cells infiltrated into the wound tissue on the 3rd and 7th day， a large number of epidermal necrosis and exfoliation， and a few capillaries formed on the 14th day; in the experimental group and the control group， inflammatory cells infiltrated， epidermal focal necrosis and exfoliationon the 3rd day， and inflammatory cells infiltration gradually decreased， with more fibroblasts and capillaries proliferating， and granulation tissue basically formed on the 7th and 14th day. The expression levels of PTEN， p-AKT and VEGF protein showed that there were no significant difference in the blank group on the 3rd， 7th and 14th day （P>0.05）. On the 3rd， 7th and 14th day， the level of PTEN proteinin the model group was lower than the blank group （P<0.05）， the experimental group and the control group were lower than the model group （P<0.05）， and reached the lowest level on the 7th day （P<0.05）. On the 3rd， 7th and 14th day， the level of p-AKT protein in the model group was higher than the blank group （P<0.05）， the experimental group and the control group were higher than the model group （P<0.05）， and reached the highest level on the 7th day （P<0.05）. On the 3rd， 7th and 14th day， the expressionof VEGF protein in the model group was lower than the blank group （P<0.05）， the experimental group and the control group was higher than the model group （P<0.05）， and reached the highest level on the 7th day （P<0.05）. Conclusion Xiangpi Shengji Ointment can reduce the expression level of PTEN protein， increase the expression levels of p-AKT and VEGF protein， and accelerate the speed of chronic wound healing. Regulating PTEN/AKT/VEGF signal pathway may be one of the mechanisms of Xiangpi Shengji Ointmentin promoting chronic wound healing.

〔Keywords〕 Xiangpi Shengji Ointment; chronic refractory wound; PTEN; p-AKT; VEGF

正常傷口愈合是止血、炎癥、增殖、重塑幾個(gè)連續(xù)且重疊的過程[1]，良好的循環(huán)在創(chuàng)面愈合過程中能保障新生組織充足養(yǎng)分，故血管新生是創(chuàng)面修復(fù)的重要條件[2]。近年來，PTEN/AKT/VEGF信號(hào)通路被證實(shí)參與創(chuàng)面的修復(fù)過程[3]，該通路的正向調(diào)節(jié)效能促進(jìn)新生血管的生成，通過改善局部循環(huán)促進(jìn)創(chuàng)面愈合。象皮生肌膏治療慢性難愈性創(chuàng)面歷史久遠(yuǎn)，臨床療效可靠[4]，但象皮生肌膏促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過建立慢性難愈性創(chuàng)面大鼠模型，研究象皮生肌膏作用下創(chuàng)面PTEN、p-AKT、VEGF蛋白表達(dá)情況，進(jìn)一步探討其促進(jìn)慢性難愈性創(chuàng)面的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用象皮生肌膏治療慢性難愈性創(chuàng)面提供可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠72只，雄性，12周齡，220～250 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[（動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2019-0009）]代購于湖南長沙斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004）]，所有實(shí)驗(yàn)操作均遵循倫理標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，各組分籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食，日溫差≤3 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。

1.2? 藥物

象皮生肌膏（20200121，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制備，湘藥制字Z20070276）。重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子凝膠（04481212，珠海億盛生物制藥有限公司）。醋酸氫化可的松（S47632，上海源葉生物科技有限公司）。

1.3? 主要試劑與儀器

酶標(biāo)儀（RT-6100，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）;988洗板機(jī)（Tianshi，北京拓普分析儀器有限責(zé)任公司）;PTEN（FY40152-A）、p-AKT（FY40155-A）、VEGF（FY3055-A）、酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒（200717R39、200717R53、200718R55），均由江蘇菲亞生物有限公司提供。

1.4? 動(dòng)物分組及模型制備

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)選取18只為空白組，空白組僅背部備皮處理。其余54只大鼠統(tǒng)一采用全層皮膚缺損法制備慢性難愈性創(chuàng)面[5]，先按照3 mL/kg標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射10%水合氯醛將大鼠麻醉，確認(rèn)麻醉充分后背部備皮，備皮面積約4 cm×4 cm，備皮完成后使用直徑為2 cm大小圓形印章在備皮區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記，在嚴(yán)格無菌操作下延標(biāo)記將大鼠全層表皮去除，深達(dá)筋膜層，按照80 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)3 d每天注射1次醋酸氫化可的松，建成慢性創(chuàng)面模型，造模完成后將54只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、模型組，每組18只。

1.5? 動(dòng)物用藥

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組用5%碘伏進(jìn)行創(chuàng)面消毒，生理鹽水棉球擦凈后分別在創(chuàng)面涂抹約1 mm厚的象皮生肌膏或重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子凝膠，使用無菌敷貼覆蓋創(chuàng)面;模型組創(chuàng)面消毒后外涂生理鹽水，使用無菌敷貼覆蓋創(chuàng)面;空白組僅在備皮處以生理鹽水外涂。造模結(jié)束后，各組每天早晚各換藥一次至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.6? 標(biāo)本取材與檢測

各組分別于第 3、7、14 天隨機(jī)選取6只大鼠，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及模型組在創(chuàng)面去痂后從創(chuàng)面邊緣分離創(chuàng)面組織，取創(chuàng)面中肉芽組織，空白組取備皮處相同部位的正常皮膚組織。部分創(chuàng)面組織經(jīng)液氮冷卻后放入-80 ℃冰箱凍存，部分創(chuàng)面組織固定于多聚甲醛中。

1.7? 創(chuàng)面愈合情況

于第 3、7、14天觀察并記錄各組創(chuàng)面愈合情況，用透明膜描記創(chuàng)面大小，將描記的透明膜放置小方格紙上計(jì)算創(chuàng)面面積，并計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率[6]。

創(chuàng)面愈合率=（治療前面積-治療后面積）/治療前面積×100%

創(chuàng)面組織標(biāo)本病理切片后進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察各組大鼠創(chuàng)面組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.8? ELISA檢測皮膚組織PTEN、p-AKT、VEGF蛋白表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取組織進(jìn)行勻漿后收集上清液，應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中蛋白表達(dá)水平，具體步驟參考ELISA試劑盒說明。

1.9? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用“x±s”表示，滿足方差齊性檢驗(yàn)者，采用單因素方差分析，再進(jìn)行LSD組間兩兩比較，方差不齊時(shí)采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，再用Mann-Whitney U進(jìn)行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組愈合率比較

第3、7、14天實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組創(chuàng)面愈合率均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），第7天實(shí)驗(yàn)組愈合率優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），第3、14天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組創(chuàng)面愈合率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），各組組內(nèi)第3、7、14天創(chuàng)面愈合率整體均呈上升趨勢，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、表1。

2.2? 各組病理學(xué)變化情況比較

鏡下觀察可見，第3、7、14天空白組皮膚組織完整，前后無明顯形態(tài)學(xué)變化。第3天，模型組見創(chuàng)面組織大量炎性細(xì)胞浸潤，表皮大量壞死脫落，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組炎性細(xì)胞浸潤，表皮灶性壞死脫落。第7天模型組仍有大量炎性細(xì)胞浸潤，表皮壞死脫落，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組炎細(xì)胞浸潤減少，較多成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管增生。第14天仍有表皮壞死伴炎細(xì)胞浸潤，少量毛細(xì)血管形成，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組炎性細(xì)胞明顯減少，肉芽組織基本形成。見圖2。

2.3? 各組PTEN蛋白表達(dá)水平比較

第3、7、14天空白組PTEN蛋白表達(dá)水平前后比較無明顯差異（P>0.05），且均高于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第14天模型組PTEN蛋白表達(dá)水平低于第3、7天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第3、7、14天實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組PTEN蛋白表達(dá)水平均低于模型組，且第7天表達(dá)為最低水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第3、7、14天實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組PTEN蛋白表達(dá)水平組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.4? 各組p-AKT蛋白表達(dá)水平比較

第3、7、14天空白組p-AKT蛋白表達(dá)水平前后無明顯差異（P>0.05），且均低于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第3、7、14天模型組p-AKT蛋白表達(dá)水平呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第3、7、14天實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組p-AKT表達(dá)水平均高于模型組，且第7天達(dá)到最高水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第3、7、14天實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組p-AKT蛋白表達(dá)水平組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.5? 各組VEGF蛋白表達(dá)水平比較

第3、7、14天空白組VEGF蛋白表達(dá)水平前后無明顯差異（P>0.05），且均高于其他3組，除外對(duì)照組第7天，余差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第7、14天模型組VEGF蛋白表達(dá)水平高于第3天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第3、7、14天實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組VEGF蛋白表達(dá)水平均高于模型組，且第7天達(dá)到最高水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第7天實(shí)驗(yàn)組VEGF蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第3、14天實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組VEGF蛋白表達(dá)水平組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。3 討論

慢性創(chuàng)面指在各種病因下通過1月以上治療仍未愈合，同時(shí)也無明顯愈合傾向，不能通過正常、有序、及時(shí)的修復(fù)達(dá)到解剖和功能完整的創(chuàng)面。本病中醫(yī)學(xué)屬于“潰瘍”“頑瘡”范疇[7]。象皮生肌膏出自《瘍科綱要》，作為祛腐生肌的代表藥物，治療創(chuàng)面愈合由來已久。象皮生肌膏藥以象皮止血、斂瘡為君藥，現(xiàn)代研究表明象皮具有保護(hù)創(chuàng)面、止血、抗炎的作用，能加速潰瘍?nèi)庋拷M織生長，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[8];當(dāng)歸補(bǔ)血活血、消腫止痛、排膿生肌為臣藥;《本草綱目》記載生地黃可填骨髓、長肌肉、生精血、通血脈;血余炭消瘀止血，石膏及爐甘石解毒、收濕、止癢、斂瘡、防腐生肌，佐以麻油滋潤潰面、解毒生肌。全方諸藥合用具有清熱活血、收濕斂瘡、祛腐生肌之效。近年來，大量研究[8-10]證明象皮生肌膏治療慢性創(chuàng)面療效可靠，具有較好的祛腐生肌、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。

近年來，相關(guān)研究[3]表明PTEN/AKT/VEGF信號(hào)通路能夠有效參與創(chuàng)面修復(fù)的調(diào)控。PTEN在PTEN/AKT/VEGF信號(hào)通路中是負(fù)調(diào)控因子[11-12]，當(dāng)上游的PTEN的含量降低時(shí)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，PI3K表達(dá)隨之升高[13]，AKT表達(dá)水平增加[14]，AKT磷酸化后最終促進(jìn)VEGF表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管新生等[15-17]，加速創(chuàng)面愈合。大量研究[9，18]表明，象皮生肌膏可以提高創(chuàng)面組織中VEGF的含量，加速創(chuàng)面愈合，但作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率均高于模型組，表明象皮生肌膏能有效促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合;第3、7、14天，實(shí)驗(yàn)組PTEN蛋白表達(dá)水平均較模型組降低（P<0.05），p-AKT、VEGF蛋白表達(dá)水平均較模型組升高（P<0.05），表明象皮生肌膏能降低PTEN蛋白表達(dá)水平，同時(shí)升高p-AKT、VEGF蛋白表達(dá)水平。在創(chuàng)面組織病理學(xué)變化的過程中，與同期模型組比較，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組組織病理學(xué)形態(tài)觀察，局部炎癥、肉芽組織情況明顯優(yōu)于模型組。

綜上所述，本次研究結(jié)果提示象皮生肌膏能降低PTEN蛋白的表達(dá)，提高p-AKT、VEGF蛋白的表達(dá)，可能通過促進(jìn)血管的生成而加快創(chuàng)面愈合，調(diào)控PTEN/AKT/VEGF信號(hào)通路可能是象皮生肌膏促進(jìn)慢性創(chuàng)面大鼠模型加速愈合的作用機(jī)制之一。然而象皮生肌膏的作用機(jī)制復(fù)雜，在下一步工作中應(yīng)進(jìn)一步深入基因?qū)用孢M(jìn)行拓展研究。

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