袁宇慧

[摘要] 目的 探討HBeAg陽性及陰性患者血清HBV RNA水平對乙肝相關(guān)肝纖維化的影響，為早期肝纖維化診斷和預(yù)測提供新方案。 方法 選取2016年10月至2019年9月我院確診的乙肝病毒感染的患者145例作為研究對象，進(jìn)行HBV DNA、HBV RNA水平的檢測;通過肝活檢及相關(guān)生化指標(biāo)評定肝纖維化分級、炎癥分級和肝臟儲備能力;通過多因素Logistic回歸分析，明確獨(dú)立危險(xiǎn)因素;通過ROC曲線評價HBV RNA水平對乙肝相關(guān)肝纖維化預(yù)測的影響。 結(jié)果 HBeAg陽性患者的AST、ALT和 HBV DNA定量均顯著高于HBeAg陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;在HBeAg陽性和陰性患者中，HBV RNA陽性組的肝纖維化分級、炎癥分級和Child-Pugh分級均顯著高于HBV RNA陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;多因素Logistic回歸分析顯示，HBeAg陽性和陰性患者的肝纖維化分級、炎癥分級和Child-Pugh分級是影響HBV RNA的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）;ROC曲線和效能評估檢測發(fā)現(xiàn)，HBV RNA評估HBeAg陰性患者肝纖維化分級和炎癥分級的曲線下面積（AUC）分別為0.721和0.763，特異度分別為69.5%和73.5%，敏感度為73.8%和75.4%。 結(jié)論 HBV RNA與乙肝肝纖維化具有相關(guān)性，對HBeAg陰性患者具有預(yù)測價值，值得臨床推廣。

[關(guān)鍵詞] HBV RNA;肝纖維化;HBeAg;相關(guān)性分析

[中圖分類號] R512.6? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）08-0001-05

Analysis on the correlation between serum HBV RNA level and hepatitis B related hepatic fibrosis in HBeAg positive and negative patients

YUAN Yuhui

Department of Hepatology， Xuzhou Infectious Disease Hospital in Jiangsu Province， Xuzhou? ?221000， China

[Abstract] Objective To investigate the impacts of serum hepatitis B virus（HBV） RNA level and hepatitis B related hepatic fibrosis in HBeAg positive and negative patients， and to provide a new scheme for early diagnosis and prediction of hepatic fibrosis. Methods A total of 145 patients with confirmed HBV infection from October 2016 to September 2019 were selected as the research objects， and HBV DNA and HBV RNA levels were detected. The levels of fibrosis， inflammation and liver reserve capacity were evaluated by liver biopsy and related biochemical indexes. Through multivariate Logistic regression analysis， the independent risk factors were identified. ROC curve was used to evaluate the impacts of HBV RNA level on the prediction of hepatitis B related hepatic fibrosis. Results The levels of AST， ALT and HBV DNA in HBeAg positive patients were all significantly higher than those in HBeAg negative patients， with statistically significant differences（P<0.05）. In HBeAg positive and negative patients， the levels of hepatic fibrosis， inflammation and child-pugh in the HBV RNA positive group were significantly higher than those in the HBV RNA negative group， with statistically significant differences（P<0.05）. It was shown by multivariate Logistic regression analysis that the levels of hepatic fibrosis， inflammation and child-pugh were independent risk factors of HBeAg positive and negative patients impacting HBV RNA（P<0.05）. It was shown by ROC curve and efficacy evaluation that the area under the curve（AUC） of HBV RNA in evaluating the levels of hepatic fibrosis and inflammation in HBeAg negative patients was 0.721 and 0.763， the specificity was 69.5% and 73.5%， and the sensitivity was 73.8% and 75.4%（P<0.05）. Conclusion HBV RNA is correlated with hepatitis B hepatic fibrosis， and has predictive value for HBeAg negative patients， which is worthy of clinical promotion.

[Key words] HBV RNA; Hepatic fibrosis; HBeAg; Correlation analysis

慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是重要的公共衛(wèi)生問題，極大程度地危及人們的生命財(cái)產(chǎn)安全[1]。慢性乙肝病毒感染患者具有很高的進(jìn)展性肝纖維化、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）的風(fēng)險(xiǎn)。因此，肝纖維化或肝硬化的早期診斷和嚴(yán)重程度評估對控制病情進(jìn)展起著重要作用，有利于降低HBV感染相關(guān)終末期肝病的發(fā)病率和死亡率?，F(xiàn)如今，肝組織活檢是診斷肝纖維化或肝硬化的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于肝組織活檢作為一種有創(chuàng)檢測，具有諸多局限性，如患者配合度較差、取樣標(biāo)本大小位置差異性較大等[2]，所以更便捷、無創(chuàng)的評估乙肝肝纖維化患者病情的方法是臨床上迫切需要的。有研究表明，乙肝相關(guān)肝纖維化或肝硬化患者的血清HBV DNA處于低濃度狀態(tài)，但與肝纖維化密切相關(guān)的共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）濃度仍較高，且復(fù)制活躍。由于肝組織內(nèi)cccDNA分布不均及血清內(nèi)雙鏈DNA干擾，cccDNA的肝組織和血清檢測難度大。血清HBV RNA作為cccDNA的直接轉(zhuǎn)錄體，能準(zhǔn)確反映cccDNA水平[3]。因此，本研究探討血清HBV RNA水平與乙肝肝纖維化患者病情、肝纖維化程度及肝臟炎癥的關(guān)系及其對乙肝肝纖維化診斷價值評估，為提高臨床診斷提供新的研究基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年10月至2019年9月間我院收治的乙肝肝纖維化患者145例作為研究對象。年齡25～69歲，平均（48.49±9.55）歲。男97例，女48例。根據(jù)乙肝e抗原（HBeAg）攜帶情況分為HBeAg陽性組71例和HBeAg陰性組74例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合2019年更新版《慢性乙型肝炎防治指南》[4]，并分為無明顯肝纖維化期（S0～S1）和明顯纖維化期（S2～S4）;②臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①藥物性肝病、酒精性肝病或其他病因?qū)е碌母卫w維化或肝硬化者;②具有其他原因?qū)е碌母螕p傷者;③合并惡性腫瘤或免疫系統(tǒng)疾病者;④伴有嚴(yán)重心、肺、腎等慢性疾病者;⑤昏迷或存在精神障礙者。本研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，所有入組患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血清HBV DNA和RNA檢測? 采用COBAS Taqman HBV DNA載量試劑盒（羅氏Cobas，瑞士）檢測HBV DNA;采用HBV-pgRNA核酸檢測試劑盒（PerkinElmer公司，美國），通過核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增等過程檢測HBV RNA，操作均嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。根據(jù)試劑盒檢測的下限，將檢出者稱為陽性，未檢出者稱為陰性。

1.2.2 肝穿刺活檢及纖維化和炎癥分級? 患者在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行肝穿刺，采用全自動一次性穿刺針（BARD，美國），取15～20 mm病理標(biāo)本，常規(guī)石蠟切片后，行HE、Masson和網(wǎng)織纖維染色。由兩名病理科醫(yī)師雙盲閱片，根據(jù)2015年更新版《慢性乙型肝炎防治指南》標(biāo)準(zhǔn)將肝組織病理切片纖維化程度分為無明顯肝纖維化期（S0～S1）和明顯纖維化期（S2～S4）;將肝組織病理切片根據(jù)炎癥程度分為輕度慢性肝炎（G1/G2期）和中、重度慢性肝炎（G3/G4期）。

1.2.3 血清生化及血清學(xué)指標(biāo)的檢測? 患者清晨空腹抽血2～3 mL，4000 rpm離心10 min，分離血清，于-80℃保存。使用C701全自動生化分析儀（羅氏Cobas，瑞士）檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、間接膽紅素（IBIL）;采用ARCHITECTi2000SR（雅培ABBOTT，美國）經(jīng)化學(xué)發(fā)光法檢測HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb和HBcAb，操作規(guī)程嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.2.4 肝臟儲備功能評價? 采用Child-Pugh分級標(biāo)準(zhǔn)對肝纖維化或肝硬化患者的肝臟儲備功能進(jìn)行量化評估，根據(jù)腹水、總膽紅素、清蛋白、凝血酶原時間、肝性腦病分期將患者分為A級（5～6分，肝臟儲備功能較好）、B級（7～9分，肝臟儲備功能一般）和C級（≥10分，肝臟儲備功能較差）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn);采用多因素Logistic回歸分析HBV RNA的影響因素;采用ROC曲線評估HBV RNA的預(yù)測價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBeAg陽性與陰性乙肝患者一般資料與臨床指標(biāo)比較

HBeAg陽性與陰性患者的年齡、性別、TBIL、DBIL和IBIL比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;HBeAg陽性患者的肝功能指標(biāo)AST、ALT和 HBV DNA定量均顯著高于HBeAg陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;然而，HBeAg陽性患者的HBV RNA定量顯著低于HBeAg陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 HBeAg陽性與陰性患者生化指標(biāo)、纖維化分級、炎癥分級和肝臟儲備能力在HBV RNA陽性組和陰性組比較

HBeAg陽性患者中，HBV RNA陽性組與HBV RNA陰性組AST、ALT、HBV DNA陽性率水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），HBV RNA陽性組的肝纖維化分級、炎癥分級和Child-Pugh分級顯著高于HBV RNA陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HBeAg陰性患者中，HBV RNA陽性組AST、ALT、HBV DNA陽性率、肝纖維化分級、炎癥分級和Child-Pugh分級均顯著高于HBV RNA陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.3 影響HBeAg陽性與陰性患者HBV RNA的多因素Logistic回歸分析

以HBV RNA為因變量（y：HBV RNA陰性組=0，HBV RNA陽性組=1），以單變量分析中P<0.10的因素為自變量，進(jìn)行變量賦值后，納入患者進(jìn)行回歸分析。Logistic回歸分析顯示，在HBeAg陽性患者中，肝纖維化分級[OR=1.885，95%CI：1.245～2.673]、炎癥分級[OR=2.228，95%CI：1.725～2.518]和Child-Pugh分級[OR=2.046，95%CI：1.508～2.529]是HBV RNA的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）;在HBeAg陰性患者中，AST[OR=1.830，95%CI：1.526～2.238]、ALT[OR=1.682，95%CI：1.238～2.025]、HBV DNA陽性率[OR=1.772，95%CI：1.215～2.204]、肝纖維化分級[OR=2.374，95%CI：1.734～2.945]、炎癥分級[OR=2.058，95%CI：1.663～2.497]和Child-Pugh分級[OR=2.337，95%CI：1.823～2.852]是HBV RNA的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。

2.4 HBeAg陽性與陰性患者HBV RNA對肝纖維化分級和炎癥分級的評價效能分析

分析HBeAg陽性與陰性患者的HBV RNA對肝纖維化分級和炎癥分級進(jìn)行評估，繪制ROC曲線。見圖1。在HBeAg陽性患者中，HBV RNA評估肝纖維化分級和炎癥分級的曲線下面積（AUC）分別為0.633和0.606，特異度分別為43.6%和49.7%，敏感度為51.5%和47.3%（P>0.05）;在HBeAg陰性患者中，HBV RNA評估肝纖維化分級和炎癥分級的曲線下面積（AUC）分別為0.721和0.763，特異度分別為69.5%和73.5%，敏感度為73.8%和75.4%（P<0.05）。

3 討論

乙型肝炎病毒感染是導(dǎo)致慢性肝纖維化[5]、肝硬化[6]甚至肝癌[7]的主要病因之一，因此乙肝病毒感染后肝纖維化預(yù)防和病情評估十分重要?？笻BV治療有效的標(biāo)準(zhǔn)是血清學(xué)的轉(zhuǎn)換，其中HBeAg由陽轉(zhuǎn)陰具有重要意義[8]。然而有研究發(fā)現(xiàn)，HBeAg陰性患者仍可能繼發(fā)肝纖維化或肝硬化，這是由于在長期HBV感染中，患者可能對野生型HBV復(fù)制的耐受性降低，進(jìn)而導(dǎo)致HBeAg轉(zhuǎn)陰，但HBV DNA可轉(zhuǎn)化為cccDNA，仍復(fù)制活躍[9]。乙肝肝纖維化是肝臟對因乙肝肝炎病毒引起的慢性炎癥損傷進(jìn)行修復(fù)和愈合的結(jié)果，肝臟結(jié)構(gòu)被破壞、改建中形成假小葉[10]，最終引起肝功能障礙、肝硬化和肝癌，因此乙肝病毒的長期活躍與肝纖維化密不可分。HBV RNA作為HBV未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的前基因組，可有效反映乙肝患者肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的水平和轉(zhuǎn)錄活性，因此可能成為乙肝療效評價或乙肝肝纖維化預(yù)測的潛在指標(biāo)[11]。

為明確HBV RNA對乙肝患者肝纖維化的作用，本研究根據(jù)HBeAg陽性/陰性將患者分為兩組，首先比較兩組間生化指標(biāo)的差異，發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性組AST、ALT和 HBV DNA定量均顯著高于HBeAg陰性組（P<0.05），但HBV RNA定量顯著低于HBeAg陰性組（P<0.05）。這種HBV DNA和RNA的差異型趨勢的原因可能是HBV DNA在抗病毒治療后可受到反轉(zhuǎn)錄抑制，HBeAg由于耐受轉(zhuǎn)陰，進(jìn)而導(dǎo)致HBV DNA檢測數(shù)值降低，但HBV仍以cccDNA的形式不斷產(chǎn)生HBV RNA病毒樣顆粒，因此HBeAg陰性患者的HBV RNA仍居高不下[12]。彭亞夢等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HBeAg陽性/陰性的HBV DNA與HBV RNA水平存在較大差異，HBeAg是CHB患者血清HBV RNA水平的影響因素，但HBeAg與HBV DNA不相關(guān)，提示相較于HBV DNA，HBV RNA能更好地反映HBeAg的轉(zhuǎn)陰情況。

本研究為探討HBV RNA在HBeAg陽性/陰性情況下對乙肝相關(guān)肝纖維化的影響，比較HBV RNA陽性組和陰性組間AST、ALT、HBV DNA、肝纖維化分級、炎癥分級和肝臟儲備能力的差異，發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性/陰性情況下，HBV RNA陽性組的肝纖維化分級、炎癥分級和Child-Pugh分級均顯著高于HBV RNA陰性組，提示HBV RNA可能與乙肝肝纖維化存在相關(guān)性。之后通過多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，HBeAg陽性患者的肝纖維化分級、炎癥分級和Child-Pugh分級是HBV RNA的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;HBeAg陰性患者的AST、ALT、HBV DNA陽性率、肝纖維化分級、炎癥分級和Child-Pugh分級是HBV RNA的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。最后通過ROC曲線對HBV RNA預(yù)測肝纖維化進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，HBV RNA對HBeAg陰性患者肝纖維化的預(yù)測特異度和敏感度較好，提示HBV RNA對乙肝患者的肝纖維化具有評估作用，尤其是在HBeAg轉(zhuǎn)陰的患者中，HBV RNA的預(yù)測效能較高。這種情況的出現(xiàn)可能與乙肝的治療方法有關(guān)，目前核苷類藥物是乙肝活動期的主要治療手段，其對HBV DNA的抑制作用十分明顯，但對cccDNA作用有限，需要更長時間的持續(xù)用藥。蔣貝等[14]研究認(rèn)為，在HBeAg陰性患者中血清HBV RNA僅來源于cccDNA的直接轉(zhuǎn)錄，故較HBV DNA和HBsAg更能反映cccDNA水平或活性，因此可以作為HBV轉(zhuǎn)錄活性的評價指標(biāo)。另一項(xiàng)研究認(rèn)為，HBV RNA持續(xù)陰性可作為部分治愈的依據(jù)，對預(yù)測停藥后復(fù)發(fā)或病毒學(xué)反彈風(fēng)險(xiǎn)具有意義[15]。Liu等[16]也認(rèn)為HBV RNA可以反映肝纖維化程度，且具有較好的HBV轉(zhuǎn)錄活性評價效能，可以作為一種新的乙肝治療停藥指標(biāo)。

綜上所述，HBV RNA與乙肝肝纖維化具有相關(guān)性，尤其是在HBeAg陰性患者中，HBV RNA具有乙肝肝纖維化的較好預(yù)測效能，但本研究病例數(shù)較少，對于肝纖維化各期HBV RNA變化仍需進(jìn)一步大樣本量的前瞻性研究。