郭紅霞 陳紹云 高冰心 鐘梅

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期特有的多系統(tǒng)進展性疾病，其特點是妊娠20周后出現(xiàn)高血壓和蛋白尿，嚴(yán)重影響孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒的生命健康。目前子癇前期的病因和發(fā)病機制尚不清楚，多認(rèn)為是一種多因素和多機制的疾病，由孕婦、胎兒和胎盤等多方面因素共同作用引起，缺乏有效的預(yù)防、治療方法［1］。近年來子癇前期發(fā)病率繼續(xù)上升，且呈現(xiàn)新的特點，靶器官功能受損早、程度嚴(yán)重，腎為受損傷最早的靶器官，腎小球濾過屏障損傷引起蛋白尿發(fā)生，繼而腎功能出現(xiàn)相應(yīng)改變［2］，孕期出現(xiàn)子癇前期的女性以后發(fā)生終末腎疾病的風(fēng)險增加［3］。

Perlecan 是迄今發(fā)現(xiàn)的最大蛋白聚糖之一，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）的核心蛋白，由基因HSPG2編碼。前期研究［4-5］中利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺對妊娠期高血壓疾病孕婦和正常孕婦尿液進行分析，獲得了妊娠期高血壓疾病的尿液蛋白指紋圖譜，并鑒定出了30 種差異蛋白質(zhì)，Perlecan 是其中的蛋白之一，相對于正常妊娠組，該蛋白在子癇前期患者尿液中含量下降。為進一步明確Perlecan蛋白在子癇前期腎組織中的變化，本課題組構(gòu)建了正常孕鼠和子癇前期樣小鼠模型以檢測該蛋白的表達(dá)變化，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、動物來源

8～10 周齡C57 BL/6J 野生型雌雄小鼠，體重18～20 g，購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周。雌雄小鼠以2∶1 的比例同籠，每天觀察雌性小鼠陰道堵塞情況，發(fā)現(xiàn)陰道堵塞的當(dāng)天被定為妊娠的第1 天并將孕鼠隔離。亞硝基左旋精氨酸甲酯（L-NAME）購自Sigma 公司，膠體鐵黏多糖染色試劑盒購自Solarbio 公司，主要蛋白免疫印跡抗體購自Abcam 公司，肝素酶活性檢測試劑盒購自上?；鶢栴D生物科技有限公司。

二、建模與分組

將孕鼠隨機分為兩組，每組5 只。正常孕鼠為NP 組，從妊娠第13～20 天每日皮下注射生理鹽水；子癇前期樣小鼠為PP 組，從妊娠第13～16 天每日皮下注射L-NAME 50 mg/kg，妊娠第17～20 天每日皮下注射生理鹽水。兩組分別于妊娠第0 天、第15天和第21天測量動脈血壓；收集妊娠第1天及第20 天24 小時尿液測尿蛋白濃度；妊娠第21 天測量血肌酐濃度（血Cr）、尿肌酐濃度（尿Cr）和尿素氮（BUN）含量，頸椎脫臼處死孕鼠立即剖宮，記錄胎鼠數(shù)目并測定胎盤質(zhì)量。

三、實驗方法

1.分離腎小球

妊娠21天兩組小鼠均采用水合氯醛溶液進行麻醉，75%酒精消毒皮膚，暴露劍突，剪開隔膜，左心室放血。隨后，沿著腹中線剪開腹腔，游離并迅速取出動物雙側(cè)腎，置于4 ℃的D-Hank’s 溶液中。腎用D-Hank’s 溶液洗滌三次，去除包膜，分離腎皮質(zhì)，用眼科剪將皮質(zhì)剪成碎泥狀，用玻璃注射器針芯輕輕研磨腎皮質(zhì)，并不斷用D-Hank’s 溶液沖洗。該沖洗液先用80目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，濾過的溶液再過150 目的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，最后過200 目篩網(wǎng)。滯留在200 目篩網(wǎng)上的即為腎小球初步分離物，反復(fù)沖洗篩網(wǎng)后，收集分離物制成懸液，靜止10 min 后，1 000 r/min 離心5 min，棄除上清，收集純化后的腎小球沉淀，加入含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液制成腎小球懸液，即完成了腎小球的分離。

2.膠體鐵染色法

根據(jù)改良Hale 膠體鐵黏多糖染色試劑盒（Solarbio）操作說明，將所有分離出的腎小球脫水、固定、包埋、切片并脫蠟，將切片浸入弱酸溶液中5 min 進行預(yù)處理，然后在Hale stain 溶液中染色60 min，用弱酸溶液清洗3 ～4 次，每次2 min，然后將Perls stain 染色液滴在切片上染色10 min，將切片用蒸餾水洗滌3～4 次，滴加Perls 復(fù)染溶液在切片上染色5 min，用水洗滌后使用梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂密封，最后在電子顯微鏡下觀察切片。

3.肝素酶（heparanase，Hpa）活性檢測

用肝素酶標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，將酶促水解緩沖液（85 μL），肝素（5 μL）分別和動物水平兩組腎組織勻漿（10 μL）依次添加到96 孔板中，并孵育3 h。每孔加入100 μL 四唑藍(lán)顯色液，在60 ℃恒溫槽中孵育2 h。最后使用酶標(biāo)儀（Bio-Tek Instruments）在570 nm下檢測光密度值。

4.蛋白免疫印跡檢測

根據(jù)參考文獻［6］進行Western blot 分析，提取兩組小鼠的腎小球總蛋白，利用蛋白免疫印跡檢測Perlecan 及其降解酶Hpa 的表達(dá)水平，然后用ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（Millipore，Billerica，MA，USA）對膜進行可視化觀察及掃描，并用Quantity-One軟件進行定量分析。

表1 兩組動物模型鑒定相關(guān)指標(biāo)的比較（±s）

表1 兩組動物模型鑒定相關(guān)指標(biāo)的比較（±s）

組別NP組PP組t值P值妊娠第0天75.46±2.64 77.38±1.03 1.51 0.168 4血壓（mmHg）妊娠第15天78.00±4.14 100.27±6.16 6.712 0.000 2妊娠第21天82.18±0.86 112.78±1.16 47.49＜0.000 1尿蛋白（mg/L）114.23±82.00 399.81±145.05 3.83 0.005 0胎鼠數(shù)目（個）12.60±0.55 9.00±0.71 9.00＜0.000 1胎盤質(zhì)量（g）0.14±0.01 0.09±0.01 10.61＜0.000 1

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件對所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用樣本均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并使用Graph Pad Prism 7.0 軟件（Graph-Pad Software，La Jolla，CA）進行分析。所有實驗均重復(fù)3次。組間定性資料比較采用卡方檢驗；兩組定量資料比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、模型鑒定

PP 組孕鼠皮下注射L-NAME 后，血壓逐漸上升，與NP 組相比在妊娠第21 天血壓出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）且血壓升高30 mmHg 以上，說明建模成功［7］；PP 組給藥建模后，尿蛋白明顯增加，差異有顯著性（P＜0.05）；胎鼠數(shù)目及胎盤重量明顯下降（P＜0.05），見表1。進一步比較兩組腎功能相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)PP 組血Cr、尿Cr、BUN 較NP 組明顯升高［177.18±26.48）vs（74.64±25.80）μmol/L、（6 512.40±1 127.45）vs（2 590.03±1 082.69）μmol/L、（8.32±3.31）vs（3.98±1.74） mmol/L，P值 均＜0.05］，再次證實建模成功。

二、膠體鐵染色結(jié)果

膠體鐵染色通過膠體鐵顆粒與組織中的酸性黏液結(jié)合形成不溶性復(fù)合物并顯色，反映組織中所帶負(fù)電荷情況，藍(lán)色越深，黏液越酸，組織中的負(fù)電荷就越多。與NP 組比較，PP 組孕鼠腎小球電荷屏障被破壞，負(fù)電荷基本消失，見圖1。

圖1 兩組孕鼠腎小球膠體鐵染色結(jié)果

三、蛋白免疫印跡結(jié)果

從Western blot 分析結(jié)果均可以看出，Perlecan蛋白在PP 組子癇前期樣孕鼠腎小球組織中表達(dá)較NP 組正常孕鼠顯著降低（P＜0.05），而其降解酶Hpa 的表達(dá)則與之相反，PP 組子癇前期樣小鼠中Hpa 含量顯著高于NP 組正常孕鼠（P＜0.05），見圖2。

圖2 兩組孕鼠腎小球Perlecan及降解酶Hpa蛋白表達(dá)

四、肝素酶（Hpa）活性檢測結(jié)果

PP 組孕鼠腎小球肝素酶活性明顯高于NP 組（P＜0.05），見圖3。

討 論

圖3 動物水平兩組孕鼠腎小球肝素酶活性檢測結(jié)果

腎小球濾過膜由腎小球內(nèi)皮細(xì)胞表層、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基膜（glomerular basement membrane，GBM）、足細(xì)胞和足細(xì)胞下間隙等五層結(jié)構(gòu)組成，GBM 為凝膠狀的細(xì)胞外基質(zhì)，主要由Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、巢蛋白及蛋白聚糖構(gòu)成，其中的蛋白聚糖主要以HSPG 為主，其蛋白核心包括Perlecan、焦聚蛋白等，是腎小球濾過的主要機械和電荷屏障，在腎小球濾過中起重要作用。Perlecan 蛋白可以被體內(nèi)唯一一種HSPG 降解酶Hpa 降解，釋放多種活性因子，產(chǎn)生一系列生物反應(yīng)，行使不同的功能，從而具備生物功能的多樣性［8］。研究［9］顯示在不同腎病模型的腎組織上可以觀察到HSPG 和Perlecan 水平的下降，其表達(dá)量與蛋白尿呈反比，發(fā)現(xiàn)其發(fā)生機制不僅與電荷屏障損傷有關(guān)，HSPG還可能通過介導(dǎo)細(xì)胞與基膜黏附、結(jié)合并轉(zhuǎn)導(dǎo)生長因子信號等途徑對腎造成損傷。Shen Q 等［10］通過對胎兒生長受限的大鼠腎進行蛋白質(zhì)組學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，相對于正常對照組，胎兒生長受限大鼠腎Perlecan 顯著下降，可能通過促進凋亡和抑制生長因子與細(xì)胞表面黏附在腎發(fā)生異常中起重要作用。

目前關(guān)于Perlecan 蛋白在子癇前期中的研究很少，Chui A 等［11］通過測定子癇前期和正常妊娠胎盤組織中蛋白多糖的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)五種蛋白多糖包括Perlecan 的mRNA 在子癇前期的胎盤中表達(dá)顯著下降，說明胎盤中蛋白多糖的表達(dá)不足也可能是子癇前期胎盤病變的特征之一。而子癇前期患者胎盤組織中Hpa 表達(dá)顯著高于正常妊娠女性［12］，國內(nèi)目前沒有關(guān)于Perlecan 蛋白在子癇前期患者中的直接報道。

本研究通過構(gòu)建子癇前期樣小鼠模型，發(fā)現(xiàn)相對于正常妊娠小鼠，子癇前期樣小鼠腎小球基底膜上Perlecan蛋白表達(dá)下降，與Raats CJ等［9］的研究結(jié)果一致，該研究也在腎病模型腎組織中也發(fā)現(xiàn)Perlecan 蛋白含量降低。本研究同時對腎小球基底膜的負(fù)電荷進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子癇前期樣小鼠腎小球基底膜負(fù)電荷基本消失，電荷屏障確實被破壞，進一步說明子癇前期樣小鼠腎小球結(jié)構(gòu)可能損傷，從而引起腎小球濾過功能障礙出現(xiàn)蛋白尿。Hpa 在正常大鼠腎小球不表達(dá)，腎小管呈低表達(dá)，當(dāng)腎處于病理狀態(tài)下時Hpa 的表達(dá)增高，突出表現(xiàn)在腎小球Hpa 的表達(dá)變化。屈微等［13］通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，在妊娠期高血壓疾病組中，Hpa 在腎小球中表達(dá)較正常妊娠組明顯增強，本研究實驗結(jié)果也證實Hpa 含量及活性均上升，可能是引起Perlecan 蛋白下降造成腎結(jié)構(gòu)損傷的原因。

由此可見，子癇前期樣小鼠模型腎Perlecan 蛋白表達(dá)下降，其唯一降解酶Hpa 升高且活性增強，引起腎小球基底膜負(fù)電荷減少，腎小球濾過屏障障礙，從而出現(xiàn)蛋白尿等子癇前期癥狀，是導(dǎo)致子癇前期腎損傷的機制之一。