劉丹丹 隋紅梅 李愛華

組蛋白精氨酸甲基轉移酶1 （coactivatorassociated arginine methyltransferase 1，CARM1）是蛋白質精氨酸甲基轉移酶家族（protein arginine Nmethyltransferases，PRMTs）的成員之一，通過甲基化組蛋白和非組蛋白參與翻譯后修飾，在信號轉導、mRNA 剪接、轉錄調控、DNA 修復等方面發(fā)揮重要作用。新近研究表明CARM1 在多種人類癌癥發(fā)生中有促進作用，如乳腺癌［1］、前列腺癌［2］、結腸癌［3］，但在子宮頸癌中未見報道。p16INK4a 是重要的抑癌因子，它通過抑制Rb 蛋白磷酸化來阻礙細胞周期蛋白的活化，使細胞周期發(fā)生停滯，從而發(fā)揮抑癌作用，有研究證實p16INK4a 蛋白精氨酸殘基在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［4］，本研究旨在檢測子宮頸鱗狀細胞癌組織中CARM1 和p16INK4a的表達，分析兩者與臨床病理特征的相關性，以及與生存的關系，探討兩者是否存在交互作用，研究子宮頸癌可能的發(fā)病機制，為子宮頸癌的精準靶向治療提供新思路。

資料與方法

一、病例選擇

收集2010 年1 月至2012 年12 月期間聊城市人民醫(yī)院病理科儲存的子宮頸蠟塊組織，選擇具有完整臨床病理信息的組織標本146 例。其中包括84 例原發(fā)性子宮頸鱗狀細胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC） 標本，患者中位年齡47.3 歲（27 歲～69 歲），均接受廣泛性子宮切除術+盆腔淋巴結清掃±腹主動脈旁淋巴清掃術，排除6 例行新輔助化療后手術的患者，以及16例晚期直接行放射治療的患者，其他患者術前均未接受放、化療、抗血管生成藥物或免疫治療等其他輔助治療，分期參照國際婦產(chǎn)科協(xié)會（Federation International of Gynecology and Obstetrics， FIGO） 2018 年 分 期 標準：Ⅰ期28 例，Ⅱ期40 例，Ⅲ期16 例；病理分級：高分化36 例，中、低分化48 例。另外還收集了30 例宮頸上皮內病變組織［10 例低級別鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）、20 例高級別鱗狀上皮內病變（high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）］，10 例因子宮肌瘤切除子宮患者的正常子宮頸組織標本作為對照，CSCC 患者中位隨訪9.1 年，其中6 例因聯(lián)系方式變更失訪。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準。

二、主要試劑和方法

CARM1 兔多克隆抗體（55246-1-AP）、P16 抗體試劑（ZM-0210）、兔二步法試劑盒（PV-6001）、DAB顯色試劑盒（ALI-9018）、免疫組化抗原修復緩沖液（ZLI-9065）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，試驗步驟參照兔二步法試劑盒（PV-6001）說明書。

三、免疫組化結果分析判定

由2 名有資質的病理科醫(yī)師在光學顯微鏡下觀察染色結果，并進行雙盲判讀，使用半定量評分法評估組織染色強度及染色細胞數(shù)百分比。根據(jù)染色強度計分：0 分（無色）、1 分（淺黃或黃色）、2 分（棕黃或褐色）、3分（深褐色）；根據(jù)染色細胞百分比計分：0 分（0%～5%）、1 分（6%～25%）、2 分（26%～50%）、3 分（51%～75%）、4 分（76%～100%）。總分是二者得分的乘積，如果小于3 分則為陰性，如果大于或等于3分為陽性。

四、統(tǒng)計學分析

使用統(tǒng)計軟件SPSS 23.0 對實驗結果進行統(tǒng)計分析。應用t檢驗進行組間比較，對于計數(shù)資料則用卡方或連續(xù)校正卡方檢驗，相關分析則使用Spearman 秩相關檢驗，單因素生存分析采用Kaplan-Meier 法進行分析，若P＜0.05 則認為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、CARM1 在CSCC 組織中的表達及與臨床病理特征的相關性

1.CARM1 在宮頸鱗狀上皮內病變及CSCC 組織中的表達情況

CARM1 在細胞核或細胞漿內表達，呈現(xiàn)棕黃色顆粒（圖1），陽性表達率在正常子宮頸組織、LSIL、HSIL、CSCC 組織中呈遞增趨勢，CSCC 組CARM1 陽性表達率明顯高于正常對照，與HSIL 相比差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

圖1 不同宮頸組織CARM1 IHC染色對比

表1 CARM1蛋白在正常宮頸組織、LSIL、HSIL、CSCC中的表達狀況

2.CSCC 組織中CARM1 蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關系

CARM1 蛋白在CSCC 組織中陽性表達率為70.24%，與組織分化程度和浸潤深度有關，與年齡和FIGO分期無關，見表2。

表2 CARM1蛋白陽性表達與CSCC患者臨床病理特征的關系

二、p16INK4a 蛋白在CSCC 組織中的表達與臨床病理特征的相關性

1.p16INK4a 蛋白在宮頸鱗狀上皮內病變及CSCC組織中的表達情況

圖2 不同宮頸組織 p16INK4a IHC染色對比

p16INK4a蛋白在細胞核或細胞漿表達，呈棕黃色顆粒（圖2），陽性表達率在正常宮頸組織、LSIL、HSIL、CSCC 組織中呈遞增趨勢，其陽性表達率在CSCC 組織中高于正常對照及LSIL，與HSIL相比差異無統(tǒng)計學意義，見表3。

表3 p16INK4a在蛋白在正常宮頸組織、LSIL、HSIL、CSCC中的表達狀況

2.CSCC 組織中p16INK4a 蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關系

p16INK4a 蛋白在CSCC 組織中高表達，其陽性表達率為92.86%，中低分化組高于高分化組，與年齡、FIGO分期及浸潤深度無關，見表4。

表4 p16INK4a蛋白陽性表達與CSCC患者臨床病理特征的關系

三、CARM1 和p16INK4a 在CSCC 組織中表達的相關性分析

Spearman 相關分析顯示CSCC 組織中CARM1 和p16INK4a 蛋白表達呈弱正相關，r= 0.325，見表5）。

四、CARM1、p16INK4a 蛋白表達情況與CSCC生存預后的關系

采用Kalplan-Meier 方法分析：CSCC 患者中位生存時間為（97.08±4.06）月，CARM1陽性表達者為（90.45±5.29）月，陰性者為（112.76±4.12）月，CARM1 陽性表達者預后較差（Log Rank：χ2=5.321，P=0.021）（圖3）。p16INK4a 陽性表達者中位生存期為（90.45±5.29）月，陰性者為（112.83±6.542）月，p16INK4a 陽性表達者預后較差（Log Rank：χ2= 0.597，P= 0.440）。COX 比例風險模型分析顯示僅臨床分期為獨立預后因素，見表6。

表5 CSCC組織中CARM1蛋白與p16INK4a蛋白表達的相關性

圖3 CARM1蛋白表達與CSCC患者生存時間的相關性

表6 單因素及多因素生存分析

討 論

CARM1 是蛋白質精氨酸甲基轉移酶家族（PRMTs） 的重要成員，是多種基因特異性轉錄因子的分子開關，如P53、NF-kB、LEF1/TCF4和E2Fs等，參與細胞的多種進程，包括基因表達［5］、轉錄偶聯(lián)、mRNA 加工［6］、調節(jié)蛋白質穩(wěn)定性和組織發(fā)育［7］，新近研究表明CARM1在多種人類癌癥發(fā)生中有促進作用，如乳腺癌［1］、結腸癌［3］、前列腺癌［2］、白血?。?］、骨肉瘤［9］等，CARM1 在子宮頸癌的研究未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)CARM1 蛋白在細胞核或細胞漿內表達，呈現(xiàn)棕黃色顆粒，陽性表達率在正常宮頸組織、LSIL、HSIL、CSCC 組織中呈遞增趨勢，CARM1 蛋白在CSCC 組織中過表達，與分化程度和浸潤深度相關，KaPlan-Meier生存分析顯示CARM1陽性表達者預后不良。表明CARM1 在CSCC 發(fā)生發(fā)展進程中可能發(fā)揮促進作用。

p16INK4a蛋白是腫瘤抑制因子和細胞周期負性調控因子，控制細胞周期G1/S 轉化［10］。研究表明p16INK4a蛋白是多種腫瘤細胞周期調控的早期分子事件和重要環(huán)節(jié)。p16INK4a 在肺癌［11］、乳腺癌［1］、肝癌［12］、黑色素瘤［13］，食管瘤［14］等組織中表達下調，參與多種腫瘤的發(fā)生和進展［15］。然而Carozzi F等研究發(fā)現(xiàn)p16INK4a 蛋白在正常宮頸組織中陰性表達，隨宮頸病變的進展表達呈上升趨勢［16］，有學者認為p16INK4a 與人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV） 感染存在一定關系［17］?？梢?，p16INK4a參與子宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機制與其他腫瘤不同，可能是鑒別宮頸病變的良好指標［18］。

本研究發(fā)現(xiàn)p16INK4a 蛋白在細胞核或細胞漿表達，呈棕黃色顆粒，其陽性表達率在正常宮頸組織、LSIL、HSIL、CSCC 組織中呈遞增趨勢，在CSCC 組織中高表達，與組織分化程度相關，單因素分析顯示p16INK4a 陽性表達者預后差（Log Rank：χ2= 0.597，P= 0.440），但差異無統(tǒng)計學意義。其原因可能在于作為調控細胞周期的抑癌基因，p16INK4a 蛋白通過抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb）磷酸化，阻止細胞由G1期進入S期，從而抑制細胞增殖。而在子宮頸鱗癌組織中，pRb 被HPV E7 蛋白滅活，從而釋放E2F，導致細胞順利通過G1/S 關卡，導致細胞過度增殖，最終癌癥發(fā)生。于此同時通過p16INK4a-CDK4/6-p Rb 通路負反饋參與調節(jié)，導致P16 蛋白表達增多［19］。Mulvany NJ等人提出p16INK4a蛋白表達增加，比HPV持續(xù)感染更有意義，其表達異常代表pRb 基因異常更加準確［20］。和既往研究一致，p16INK4a 蛋白在宮頸高級別病變及宮頸癌組織中過表達，可作為宮頸癌診斷的分子生物學指標之一，對于HSIL的臨床監(jiān)測和治療具有指導意義［21］。

Spearman 相關分析發(fā)現(xiàn)CSCC 組織中CARM1 和p16INK4a 蛋白表達呈弱正相關，表明兩者在CSCC進展中可能發(fā)揮部分協(xié)同作用。有研究通過免疫共沉淀試驗證實PRMTs 可提高P16 蛋白甲基化水平［8］。在不同細胞系中p16INK4a 蛋白精氨酸22、131 和138 是主要的甲基化位點，下調p16INK4a 精氨酸甲基化水平可促進p16-CDK4 結合，而PRMTs過表達可阻斷p16-CDK4 的結合，抵消了野生型p16INK4a 誘 導A549 細 胞G1 期 阻 滯［22］，p16INK4a精氨酸甲基化水平依賴精氨酸甲基轉移酶家族的作用。

此次研究采用2018 修訂的FIGO 分期系統(tǒng)進行研究，部分患者因“淋巴結轉移”分期升級，通過Cox比例風險回歸模型研究多因素對于CSCC患者生存的影響，證實僅分期是獨立預后因素，也論證了新分期對于患者風險分層及預后評估的指導意義［23］。由于部分病例信息不全，沒有納入HPV分型研究，考慮臨床上在宮頸高級別病變治療及隨訪中基因甲基化檢測的廣闊前景，在這一領域可進一步擴大樣本量，延長隨訪時間，深入探討臨床應用價值。

綜上所述，CARM1、p16INK4a 在子宮頸鱗癌中均過表達，二者的異常表達可能參與了CSCC 的發(fā)生發(fā)展過程，具體作用機制有待于深入探討。