郭奉潔，馬錫慧，李彬鈺，孫玉潔（.解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)勤部，北京0009；.解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心原移植研究室，北京 0009）

他克莫司（Tacrolimus，Tac）是從筑波鏈霉菌的培養(yǎng)液中分離獲得的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，因其高效的免疫抑制作用已被廣泛應(yīng)用于各種實質(zhì)器官的臨床移植［1］。由于Tac 吸收存在明顯的個體間和個體內(nèi)差異，治療指數(shù)較低，安全范圍相對較窄，濃度過高易致毒性，過低又易發(fā)生排斥反應(yīng)。因此，對Tac 進行嚴密的血藥濃度監(jiān)測使其處于安全有效的治療范圍尤為重要。目前，臨床上Tac 血藥濃度的檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法、酶增強免疫法、微粒子酶免疫法、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法以及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，各種檢測方法都有其自身的特點［2］。膠乳增強免疫抑制法檢測Tac 血藥濃度未見文獻報道，本文通過分析化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法和膠乳增強免疫抑制法檢測Tac 全血藥物濃度的結(jié)果，評價兩種方法測定Tac 血藥濃度的一致性。

1 資料與方法

1.1 研究對象：選取在解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心進行Tac 血藥濃度檢測的腎移植受者96 例作為研究對象，其中男性66 例，女性30 例，年齡15 ～79 歲，平均年齡（44±12）歲，所有患者均采用Tac + 嗎替麥考酚酯+腎上腺皮質(zhì)激素（激素）三聯(lián)抗排斥治療方案，Tac 服用劑量隨術(shù)后時間、血藥濃度結(jié)果和患者臨床情況進行適當(dāng)調(diào)整。

1.2 實驗儀器與耗材：雅培ARCHITECT i1000SR全自動免疫分析儀，F(xiàn)UNOTEC FC300 全自動生化分析儀，試劑為各自配套的Tac 測定試劑盒，質(zhì)控品為伯樂公司的全血免疫抑制劑質(zhì)控物，采用高、中、低三個濃度。貝克曼高速離心機（AllegraTM21R Centrifuge），渦旋振蕩器（Thermo Scientific），移液器（200 μl、1 ml）及配套槍頭。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本采集：所有患者口服藥物前采集上肢靜脈血2 ml 于EDTA-K2 抗凝管中（4℃冰箱保存?zhèn)溆茫瑴y定Tac 藥物谷濃度，所有樣本在采集1 d內(nèi)完成檢測。

1.3.2 定標與質(zhì)控：化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法根據(jù)0.0、3.0、6.0、12.0、20.0、30. 0 μg/L 6 個濃度的FK506 標準液繪制標準曲線，隨行低（4.84 μg/L）、中（9.42 μg/L）、高（15.1 μg/L）三個濃度的Tac質(zhì)控品進行室內(nèi)質(zhì)控。膠乳增強免疫抑制法根據(jù)0.0、3.0、6.0、10.0、20.0、30. 0 μg/L 6 個濃度的Tac 標準液繪制標準曲線，隨行低（4.54 μg/L）、中（12.6 μg/L） 、高（24.2 μg/L）3 個濃度的Tac 質(zhì)控品進行室內(nèi)質(zhì)控。1.3.3 操作方法：在室內(nèi)質(zhì)控在控的條件下，用兩種方法平行檢測Tac 血藥濃度，操作時，嚴格按照兩種方法各自配套Tac 測定試劑盒說明書對質(zhì)控品和臨床樣本進行樣本前處理和檢測。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)的差異性分析采用配對t 檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析，回歸分析采用一元線性回歸，圖形繪制采用GraphPad Prism 5 軟件。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種方法檢測Tac 血藥濃度結(jié)果差異性分析：化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法測得的Tac 血藥濃度為（5.78±2.18）μg/L，膠乳增強免疫抑制法測得的Tac 血藥濃度為（6.51±2.32）μg/L，經(jīng)配對t 檢驗，t ＝12.237，P ＝0.000（P ＜0.001），即兩種方法檢測Tac 血藥濃度結(jié)果具有顯著性差異，化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法普遍低于膠乳增強免疫抑制法，兩種方法檢測Tac 血藥濃度差異性分析結(jié)果結(jié)果見表1，兩種方法檢測Tac 血藥濃度結(jié)果分布見圖1。

表1 兩種方法檢測Tac 血藥濃度差異性分析結(jié)果

圖1 兩種方法檢測Tac 血藥濃度分布圖

2.2 兩種方法檢測Tac 血藥濃度結(jié)果相關(guān)性分析：Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，兩種方法檢測Tac血藥濃度結(jié)果呈正相關(guān)（r ＝0.9676，P ＜0.0001）。對于每份樣本，以化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法檢測結(jié)果為橫坐標，以膠乳增強免疫抑制法檢測結(jié)果為縱坐標，繪制散點圖，見圖2。

2.3 兩種方法檢測Tac 血藥濃度結(jié)果回歸分析：對兩種方法檢測Tac 血藥濃度結(jié)果進行一元線性回歸分析，建立回歸模型，經(jīng)檢驗F ＝1378.911，P ＝0.000（P ＜0.05），即建立的回歸模型有意義。進而得到一元線性回歸方程Y ＝0.551+1.032X（其中X 為化學(xué)放光微粒子免疫法，Y 為膠乳增強免疫抑制法）。

圖2 兩種方法檢測Tac 血藥濃度結(jié)果相關(guān)性分析圖

3 討 論

隨著器官移植技術(shù)的不斷發(fā)展，Tac 在臨床上的應(yīng)用也越來越廣泛。因其個體吸收差異大和藥理藥代特點， 使得Tac 藥物濃度監(jiān)測意義重大［3］。而選擇靈敏可靠的檢測方法對于臨床制定個體化用藥方案尤為重要。目前，臨床上Tac 血藥濃度的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法、酶增強免疫法、微粒子酶免疫法、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法以及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，各種方法都有其自身的特點，隨著免疫學(xué)檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和檢測儀器的推陳出新，Tac 檢測方法也不斷橫向擴展，有關(guān)方法學(xué)及兩種方法對比的文獻已見報道［4-6］，但膠乳增強免疫抑制法檢測Tac 血藥濃度的方法未見報道，本文通過分析兩種方法測得Tac 血藥濃度結(jié)果，評價兩種方法的差異性和相關(guān)性，以期為臨床制定個體化用藥方案提供理論依據(jù)。

化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法是近年來發(fā)展起來的一種高靈敏度的方法，其在檢測Tac 濃度之前，需對樣本進行預(yù)處理，將全血中與蛋白結(jié)合的Tac 萃取出來。檢測原理為采用吖啶酯標記的Tac 分子作為競爭物，用Tac 單克隆抗體包被的順磁微粒子作為捕獲物，將樣品與順磁微粒子混合反應(yīng)，加入競爭物，與微粒子上的抗體空位結(jié)合，外加磁場使微珠分離，清洗后加入預(yù)激發(fā)液與激發(fā)液產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光的強度與樣品中Tac 的濃度成反比，根據(jù)標準曲線，求得樣品中Tac 的濃度［7］。

膠乳增強免疫抑制法在測定Tac 濃度之前，同樣需對樣本進行預(yù)處理。檢測過程中，樣本中的Tac 與Tac 蛋白復(fù)合物中的Tac 競爭結(jié)合致敏膠乳顆粒表面的抗Tac 抗體，樣本中的Tac 濃度越高，膠乳表面抗體被其結(jié)合的程度越大，Tac-蛋白復(fù)合物可引發(fā)的膠乳聚集程度越低，反應(yīng)體系的濁度大小與樣本中的Tac 濃度呈負相關(guān)，通過測定546 nm處的吸光度，建立校準曲線，計算全血樣本Tac 的濃度。

兩種方法檢測Tac 血藥濃度結(jié)果差異性分析顯示：化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法普遍低于膠乳增強免疫抑制法，且差異顯著（P ＜0.001）。董新華等［8］用酶聯(lián)免疫吸附法和微粒子酶免疫法同時檢測200 份腎移植術(shù)后患者標本，結(jié)果顯示兩種方法測得結(jié)果差異顯著。葉偉民等［9］用上述兩種方法同時檢測58 例肝移植和腎移植患者的標本，得出相同結(jié)論。張麗萍等［10］的研究結(jié)果顯示，酶增強免疫分析法和微粒子酶免疫法測得的結(jié)果在低濃度時（＜8.0 ng/L）差異顯著，在高濃度時（≥8 ng/L）差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以上研究表明，不同方法檢測Tac 血藥濃度結(jié)果差異顯著，不應(yīng)相互比較。

兩種方法檢測Tac 血藥濃度結(jié)果相關(guān)性和回歸分析顯示：兩種方法相關(guān)性良好（r ＝0.9676，P ＜0.0001），這與其他檢測Tac 血藥濃度方法比較類文獻的報道均一致［8-10］。說明幾種方法都可以作為Tac 血藥濃度的檢測方法，不同實驗室可根據(jù)實際情況進行選擇。本文通過一元線性回歸分析，建立回歸模型（F ＝1378.911，P ＝0.000），進而得出線性回歸方程Y ＝0.551+1.032X（其中X 為化學(xué)放光微粒子免疫法，Y 為膠乳增強免疫抑制法）。這與董新華等［8］的報道相似。

兩種方法均在室內(nèi)質(zhì)控在控的條件下對樣本進行了平行檢測，為了客觀評價兩種方法的可靠性以及準確性，本研究認真按照標準規(guī)程操作，樣本的采集、環(huán)境溫度的控制、標本存放等各個環(huán)節(jié)均保持一致，避免了人為原因造成的檢測誤差。有文獻報道［11］，化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法與微粒子酶聯(lián)免疫法檢測Tac 濃度結(jié)果的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與檢測原理、儀器狀態(tài)或檢測環(huán)境有關(guān)。不同的方法對樣本提取的過程不同，對代謝物的識別也不同，因此所得的結(jié)果也可能不同［12］。因樣本收集限制，本研究中未包含高濃度（≥20 ng/L）樣本，對于高濃度樣本兩種方法檢測結(jié)果差異是否顯著，需進一步研究。

綜上所述，膠乳增強免疫抑制法和化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法均可用于Tac 血藥濃度監(jiān)測，二者相關(guān)性良好，但二者測定Tac 血藥濃度結(jié)果差異顯著，檢測結(jié)果不能相互比較，應(yīng)建立各自的治療窗范圍進行判斷，建議腎移植受者在進行Tac 血藥濃度動態(tài)監(jiān)測時，盡量選擇同一檢測方法和系統(tǒng)，以保證檢測結(jié)果的縱向可比性，從而為臨床制定個體化用藥方案提供可靠依據(jù)。