楊柳，曹歡，孫東，侯賓，林玲，宋紅麗（.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津3009；.天津市第一中心醫(yī)院器官移植科，天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院移植醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津3009）

心臟死亡器官捐獻(xiàn)（donation after circulatory death， DCD）供肝經(jīng)歷較長(zhǎng)時(shí)間的熱缺血和缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury， IRI），靜態(tài)冷保存（static cold storage， SCS）下，肝臟能量代謝和線粒體功能易于受損，對(duì)SCS 相關(guān)的IRI 特別敏感，應(yīng)該限制暴露于SCS［1］。常溫機(jī)械灌注（normothermic machine perfusion， NMP）模仿體內(nèi)正常的代謝狀態(tài)，很大程度上改善了DCD 供肝質(zhì)量，優(yōu)于SCS［2-3］。肝臟微循環(huán)結(jié)構(gòu)和功能的變化在很大程度上影響著肝臟的生理功能，微循環(huán)障礙是導(dǎo)致肝臟損傷的決定因素［4-5］，本研究致力于探索NMP 對(duì)DCD 供肝的微循環(huán)的影響，研究其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：血管性血友病因子（von Willebrand factor， vWF）、血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1， VCAM-1）抗體購(gòu)自美國(guó)圣克魯斯公司；內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthetase，eNOS）抗體購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthetase，iNOS）、細(xì)胞間黏附分子（intercellular cell adhesion molecule-1， ICAM-1）抗體購(gòu)自中國(guó)武漢三鷹公司；內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）抗體購(gòu)自中國(guó)博奧森公司。選取6 ～ 8 周、200 ～ 220 g 雄性SD 大鼠（n ＝42）獲取DCD 肝臟；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2017-0005。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠DCD 肝臟獲取及肝臟NMP 系統(tǒng)建立：SD 大鼠麻醉后，腹部中央切口暴露肝臟，結(jié)扎左膈下靜脈、右腎靜脈、腎上腺靜脈叢和肝動(dòng)脈；游離門(mén)靜脈并結(jié)扎幽門(mén)靜脈及脾靜脈，插入膽管支架。剪開(kāi)膈肌夾閉胸主動(dòng)脈、棉棒壓迫心臟模擬心臟死亡過(guò)程；溫鹽水紗布覆蓋腹腔30 min 后取下肝臟。本研究大鼠NMP 系統(tǒng)是單循環(huán)系統(tǒng)設(shè)備，主要包括離心泵，膜氧合器，器官室，加熱器，壓力、溫度監(jiān)測(cè)器等。灌注液為含20 % FBS 和1 % 雙抗的DMEM/F12 （1：1）培養(yǎng)液60 ml，并添加20 ml 新鮮血液、肝素、胰島素和地塞米松。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和處理：實(shí)驗(yàn)分為3 組（n ＝42）：Normal 組（n ＝6），SCS 組（n ＝6），NMP 組（n ＝30）。 NMP 組，灌注后0、2、4、6 和8 h 收集流入道、流出道灌注液待檢，并收集肝臟標(biāo)本；SCS 組肝臟以 20 ml 4 ℃ UW 液（the University of Wisconsin solution）沖出肝內(nèi)血液，并于UW 液中4 ℃ SCS6 h 后收集肝臟標(biāo)本；Normal 組大鼠留取血清及肝臟待用。肝臟標(biāo)本隨機(jī)留取肝臟組織福爾馬林固定，2.5 %戊二醛溶液固定，部分肝臟剪碎后液氮速冷，所有標(biāo)本置于-80℃凍存待檢。

1.2.3 肝功能及乳酸檢測(cè)：檢測(cè)流出道灌注液白蛋白（albumin， ALB）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）的水平；血?dú)夥治鰴z測(cè)流入道灌注液乳酸水平。

1.2.4 肝臟病理蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin， HE）染色：隨機(jī)取各組肝臟組織，4 %甲醛溶液固定，制成石蠟切片進(jìn)行HE 染色，顯微鏡鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變；根據(jù)Suzuki 的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)評(píng)分［6］，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)（表1）。

表1 Suzuki’s 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling， TUNEL）：石 蠟切片經(jīng)烤片、二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蛋白酶K 通透、TUNEL 試劑反應(yīng)，觀察肝臟細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 透射電鏡檢測(cè)：隨機(jī)取新鮮肝組織，切成2 mm×3 mm 的樣品，2.5 %戊二醛溶液固定， 包埋、超薄切片后在透射電子顯微鏡下觀察肝組織的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.7 Western blot：提取肝臟總蛋白并測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)行電泳、轉(zhuǎn)膜，標(biāo)記ET-1（1 ∶500）、eNOS（1 ∶500）、iNOS（1 ∶500）、ICAM-1（1 ∶500）、VCAM-1（1 ∶100）、vWF（1 ∶500）和GAPDH（1 ∶3000）。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，全部數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)處理均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用q 檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠NMP 系統(tǒng)評(píng)價(jià)

2.1.1 大鼠NMP 系統(tǒng)對(duì)DCD 供肝肝功能、乳酸及膽汁分泌量的影響：各時(shí)間點(diǎn)ALB 水平無(wú)顯著差異；ALT 和AST 表現(xiàn)為升高趨勢(shì)，4 h 和6 h 的ALT、AST 水平無(wú)顯著差異，其余各時(shí)間點(diǎn)之間水平差異顯著，灌注6 h 以后，ALT 和AST 升高幅度顯著，差異顯著（P ＜0.05）；ALP 水平逐漸下降，各時(shí)間點(diǎn)水平無(wú)顯著差異。灌注0 h 乳酸迅速下降至低水平，灌注6 h 以后，乳酸出現(xiàn)升高趨勢(shì)，2 h 和6 h 乳酸水平差異顯著（P ＜0.05）；膽汁分泌量水平逐漸增高，灌注6 h 以后膽汁分泌幅度減小（圖1）。

圖1 大鼠NMP 系統(tǒng)對(duì)DCD 供肝肝功能、乳酸及膽汁分泌量的影響

2.1.2 大鼠NMP 系統(tǒng)對(duì)肝臟組織病理學(xué)的影響：隨灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，肝細(xì)胞空泡變性、水腫及肝竇淤血逐漸減輕，6 h（2.80±0.84）h 肝臟無(wú)明顯病理?yè)p傷，灌注8 h（5.80±0.45）h 的肝臟病理表現(xiàn)惡化；灌注4 h（3.40±0.55）h 和6 h 的肝臟Suzuki 評(píng)分較低，無(wú)顯著差異，肝臟病理表現(xiàn)最佳，提示隨著灌注時(shí)間的延長(zhǎng)IRI 逐漸得到改善，但灌注6 h 以后出現(xiàn)肝臟損傷（圖2）。

圖2 大鼠NMP 系統(tǒng)對(duì)DCD 供肝病理的影響

該大鼠NMP 系統(tǒng)可顯著改善DCD 供肝的肝功能和肝臟組織病理學(xué)，但是灌注6 h 時(shí)供肝質(zhì)量下降，提示該大鼠NMP 系統(tǒng)保存DCD 供肝的最佳、最長(zhǎng)時(shí)間為6 h，進(jìn)一步灌注可能影響供肝質(zhì)量。

2.2 NMP 改善DCD 肝臟組織病理學(xué)：SCS 組肝細(xì)胞空泡變性、水腫及肝竇淤血較重、NMP 組肝細(xì)胞幾乎無(wú)空泡變性、無(wú)肝細(xì)胞水腫及肝竇淤血。NMP（3.40±0.55）組Suzuki 損傷評(píng)分顯著低于SCS（7.00±0.71） 組（F ＝229.75，P ＜0.05），提示NMP 保存DCD 供肝可改善供肝病理（圖3）。2.3 NMP 減 輕DCD 肝 臟 細(xì) 胞 凋 亡：Normal（3.20±1.10）組凋亡小體最少，SCS（33.40±4.39）組凋亡小體最多，NMP（9.80±1.48）組凋亡顯著低于SCS 組（F ＝166.58，P ＜0.05），提示NMP可減輕DCD供肝細(xì)胞凋亡，優(yōu)于單SCS方式 （圖3）。

圖3 不同保存方式對(duì)DCD 供肝質(zhì)量的影響

2.4 NMP 減輕DCD 肝臟細(xì)胞線粒體損傷：SCS 組肝細(xì)胞線粒體嚴(yán)重水腫、空泡變性，線粒體嵴結(jié)構(gòu)紊亂、大部分消失，線粒體不可逆損傷嚴(yán)重（2.80±0.45），部分線粒體壞死溶解；NMP 組肝細(xì)胞線粒體幾乎無(wú)腫脹、空泡變性，線粒體嵴結(jié)構(gòu)完整，線粒體不可逆損傷較少（1.60±0.55，F(xiàn) ＝36.29，P ＜0.05）。提示NMP 可改善線粒體損傷（圖4）。

圖4 各組DCD 供肝組織超微結(jié)構(gòu)的變化（×25 000）

2.5 NMP 改善DCD 肝臟微循環(huán)

2.5.1 NMP 抑制細(xì)胞間黏附和改善內(nèi)皮細(xì)胞損傷：ICAM-1 和VCAM-1 是細(xì)胞間黏附分子，是炎癥反應(yīng)的產(chǎn)物，提示肝竇阻塞程度。NMP 組肝內(nèi)ICAM-1（F ＝1728.45，P ＜0.05）和VCAM-1的表達(dá)顯著低于SCS 組（F ＝254.72，P ＜0.05），提示：NMP 保存可減輕肝竇阻塞（圖5）。NMP 組肝內(nèi)vWF（F ＝595.30，P ＜0.05）的表達(dá)量顯著低于SCS 組（P ＜0.05）。提示NMP 保存方式可減少肝臟內(nèi)皮損傷（圖5）。

圖5 各組DCD 供肝黏附分子和vWF 的表達(dá)情況

2.5.2 NMP 改善ET-1/NOS 平衡和微循環(huán)灌注：肝內(nèi)ET-1 表達(dá)于肝內(nèi)血管及肝竇，NMP 組ET-1 的表達(dá)水平顯著低于SCS 組 （F ＝1372.51，P ＜0.05）。提示NMP 抑制了肝內(nèi)分泌ET-1 的作用，減少肝竇收縮，改善肝竇血流灌注（圖6）。

圖6 各組DCD 供肝ET-1/NOS 表達(dá)情況

肝內(nèi)eNOS 表達(dá)于肝竇內(nèi)皮和血管內(nèi)皮，可產(chǎn)生NO，是內(nèi)皮舒張因子，具有擴(kuò)張血管和肝竇的作用。NMP 組肝內(nèi)eNOS 表達(dá)水平顯著高于SCS 組（F ＝271.66，P ＜0.05）。 肝 內(nèi)iNOS表達(dá)于肝竇，由應(yīng)激和炎癥誘導(dǎo)產(chǎn)生，提示巨噬細(xì)胞活化程度。NMP 組肝內(nèi)iNOS 表達(dá)量顯著低于SCS 組（F ＝1102.20，P ＜0.05）。提 示NMP促進(jìn)了DCD 肝臟合成eNOS，抑制iNOS 的生成（圖6）。

3 討 論

在該項(xiàng)研究中，我們采用穩(wěn)定的單循環(huán)NMP系統(tǒng)，灌注時(shí)間選擇0、2、4、6 h 和8 h，檢測(cè)了肝功能、乳酸和膽汁分泌量指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)隨著灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，灌注6 h 以后ALT 和AST 出現(xiàn)了明顯的升高，乳酸水平在灌注6 h 后出現(xiàn)明顯反跳升高，同時(shí)膽汁的分泌量升高幅度降低。組織病理學(xué)方面的表現(xiàn)，灌注后肝臟缺血/再灌注（ischemia reperfusion，IRI）逐漸得到改善，4 h 和6 h 的病理表現(xiàn)最佳，與肝功能表現(xiàn)一致的是，灌注6 h 以后出現(xiàn)了肝細(xì)胞水腫、肝竇淤滯等病理惡化的表現(xiàn)。為了研究效果的穩(wěn)定性，綜合評(píng)價(jià)該NMP 系統(tǒng)對(duì)供肝質(zhì)量的影響，我們選擇了NMP系統(tǒng)保存后供肝質(zhì)量最佳的6 h 的肝臟進(jìn)行后續(xù)的研究。我們?cè)u(píng)估了NMP 保存方式和SCS 保存方式對(duì)DCD 供肝質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)保存DCD 供肝6 h，NMP 顯著改善肝功能、肝臟病理和IRI，減少肝細(xì)胞凋亡，NMP 明顯優(yōu)于SCS；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NMP 對(duì)肝臟線粒體也具有保護(hù)作用。線粒體對(duì)缺氧和氧化應(yīng)激非常敏感，與肝臟微循環(huán)的關(guān)系密切［7］。

縮血管因素ET-1 和擴(kuò)血管因素NOS 兩者之間的平衡對(duì)肝臟微循環(huán)穩(wěn)態(tài)的維持具有重要作用。ET-1 是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的內(nèi)源性縮血管肽，缺血、缺氧是ET-1 表達(dá)上調(diào)的重要刺激因素［8］。肝臟受損時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ET-1 增加，NO 產(chǎn)生減少，使得血管收縮、肝竇淤滯［9-10］。NOS 合成NO，主要是eNOS 和iNOS，eNOS 具有 改 善IRI作用，而iNOS 主要在炎癥刺激下誘導(dǎo)產(chǎn)生，過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)ONOO-的產(chǎn)生，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)IRI 的發(fā)生［11-13］。我們的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)NMP 保存方式抑制了DCD 供肝肝內(nèi)ET-1 和iNOS的過(guò)度合成，促進(jìn)了eNOS 的合成增加，NMP 對(duì)肝內(nèi)ET-1 和NOS 的表達(dá)產(chǎn)生了顯著的調(diào)節(jié)作用，NMP 對(duì)ET-1/NOS 平衡的調(diào)節(jié)可能與其持續(xù)灌注、供氧，改善肝竇淤滯有關(guān)，因此我們認(rèn)為NMP 的保存方式可改善DCD 供肝微循環(huán)灌注，優(yōu)于SCS。

研究表明，持續(xù)的NMP 可以建立保護(hù)級(jí)聯(lián)，改善缺血缺氧造成的氧化應(yīng)激損傷，ROS 釋放發(fā)生限制到最低，減輕組織炎癥［14-15］。ICAM-1 和VCAM-1 是炎癥反應(yīng)的產(chǎn)物，是細(xì)胞間黏附和浸潤(rùn)的標(biāo)志，提示肝竇阻塞程度［16-17］，也是內(nèi)皮功能障礙的特征性分子［18］。我們的研究發(fā)現(xiàn)NMP的保存方式顯著抑制DCD 供肝肝內(nèi)ICAM-1 和VCAM-1 的表達(dá)，優(yōu)于SCS，提示了NMP 可通過(guò)持續(xù)灌注、供氧及提供代謝物質(zhì)來(lái)減輕肝竇阻塞，減少肝竇內(nèi)皮和血管內(nèi)皮損傷。von Willebrand 是內(nèi)皮損傷的標(biāo)志，肝內(nèi)vWF 水平的升高的程度提示內(nèi)皮損傷程度和肝竇阻塞程度［19］，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了NMP 的保存方式可以顯著抑制DCD 肝臟vWF 的表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度和肝竇阻塞程度最低，進(jìn)一步驗(yàn)證了NMP 在改善DCD 供肝肝竇微循環(huán)障礙和內(nèi)皮損傷的作用。

本研究表明，NMP 通過(guò)抑制DCD 供肝內(nèi)細(xì)胞間黏附，改善肝竇阻塞和內(nèi)皮損傷，調(diào)節(jié)肝內(nèi)ET-1/NOS 平衡改善肝臟灌注進(jìn)而改善DCD 供肝微循環(huán)來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用。本研究中的NMP 系統(tǒng)是單循環(huán)系統(tǒng)，灌注系統(tǒng)沒(méi)有設(shè)立排泄裝置，灌注時(shí)間過(guò)長(zhǎng)限制了灌注體系的器官修復(fù)水平，下一步我們將進(jìn)一步改良灌注方法，做進(jìn)一步的研究。