李秋燕，黃發(fā)明，張凱元，谷云艷，莫彥妮，夏春波，朱琳*

（1.桂林醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541000；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，廣西 桂林 541000；3.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541000）

0 引言

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤中，具有高發(fā)病率和高病死率等特點(diǎn)的膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的。目前我國(guó)膠質(zhì)瘤發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，盡管通過(guò)結(jié)合手術(shù)、放化療和其他輔助治療進(jìn)行治療可以取得一定的療效，但高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然令人沮喪，中位生存期僅為10 至15 個(gè)月[1]。在過(guò)去的十年里，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分子特征有了顯著的發(fā)展。分子標(biāo)記是2016 年世界衛(wèi)生組織（WHO）給中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)增加的新組成部分，對(duì)膠質(zhì)瘤的臨床病理診斷和預(yù)后產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[2]。Parsons 等[3]在2008 年，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因的研究測(cè)序和分析，最先發(fā)現(xiàn)異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）的基因突變?cè)谀z質(zhì)母細(xì)胞瘤中大約占比12%。隨之，越來(lái)越多的研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)在低、高級(jí)別膠質(zhì)瘤以及繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中IDH1/2 突變普遍存，可作為其初步判斷預(yù)后結(jié)果的標(biāo)志，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及演變過(guò)程發(fā)揮著重要作用。膠質(zhì)瘤中另一個(gè)重要的突變是端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）突變[4]，包括C228T 和C250T 兩種類(lèi)型，TERT 基因啟動(dòng)子突變會(huì)導(dǎo)致不良預(yù)后[5]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷、治療和預(yù)后起著積極意義的分子標(biāo)志物有異檸檬酸脫氫酶（IDH）、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）、1p19q、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）等。本研究旨在探究IDH1/2，TERT 基因啟動(dòng)子區(qū)突變?cè)诓煌±砑?jí)別腦膠質(zhì)瘤中分布的聯(lián)系性及意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

采集2016 年1 月至2019 年12 月在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科行腦膠質(zhì)瘤切除術(shù)并且經(jīng)病理確診為腦膠質(zhì)瘤患者的60 例腫瘤組織標(biāo)本及尸檢獲取的正常腦組織標(biāo)本各30例，其中膠質(zhì)瘤患者年齡為22 歲至71 歲，平均44.8 歲；尸檢患者年齡為0 歲至78 歲，平均43.0 歲?；颊咝g(shù)前均未接受過(guò)放療和化療，排除病理質(zhì)量較差的病例及合并其他惡性腫瘤的標(biāo)本。標(biāo)本均經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2名經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師進(jìn)行診斷并確診為腦膠質(zhì)瘤，根據(jù)研究目的按照2016 版WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)將標(biāo)本分為高級(jí)別組（Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)）和低級(jí)別組（Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)）以及正常組（正常腦組織），如圖1 所示，其標(biāo)本數(shù)量依次分別為37 例，23 例和30 例。

圖1 不同病理級(jí)別腦膠質(zhì)瘤HE 染色

IDH1/2 基因突變與TERT 基因啟動(dòng)子區(qū)突變檢測(cè)

1.1.1 腦膠質(zhì)瘤組織樣本DNA 的提取

①參照北京泛生子生物科技有限公司提供的試劑說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備好60 例膠質(zhì)瘤和30 例尸檢標(biāo)本的蠟卷各10 卷，編好號(hào)后依次置于1.5mL 無(wú)菌離心管中，向離心管內(nèi)加入1mL 二甲苯，劇烈渦旋離心后棄上清。②將1mL 無(wú)水乙醇加入上述管中，渦旋混勻離心后棄上清，待乙醇揮發(fā)后加入200μ1 緩沖液GA 和20μl Proteinase K 進(jìn)行孵育裂解。③在上管中加入220μl 緩沖液GB 和250μl 無(wú)水乙醇，渦旋震蕩短暫離心后將混合液轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)的吸附柱CR2 中并進(jìn)行離心。④倒掉廢液，重新將吸附柱放回收集管中并向吸附柱CR2 中加入500μl 緩沖液GD，離心后倒掉收集管中的廢液。⑤加600μl漂洗液PW 于吸附柱CR2 中，離心后倒掉收集管中的廢液，將吸附柱開(kāi)蓋晾干殘余漂洗液。⑥將吸附柱CR2 轉(zhuǎn)入一個(gè)對(duì)應(yīng)編號(hào)的干凈離心管中，懸空滴加65℃預(yù)熱的60μl 洗脫緩沖液TE 后離心，收集到相應(yīng)樣本DNA。

1.1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)IDH1/2 基因突變與TERT 基因啟動(dòng)子區(qū)突變

①使用分光光度計(jì)檢測(cè)待檢樣本DNA 濃度。按照DNA濃度為10ng/L 的標(biāo)準(zhǔn)，用去離子水稀釋待檢樣本，制成待檢DNA 樣品，并制備等體積的陰性對(duì)照品。②將融化好的檢測(cè)試劑和陽(yáng)性對(duì)照品短暫離心后置于冰上，制備等體積的陽(yáng)性對(duì)照品。③往已裝有待檢DNA、陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照的PCR管中加入Taq DNA 聚合酶，混勻后短暫離心。④打開(kāi)裝有檢測(cè)試劑的8 聯(lián)管管蓋，將待檢DNA、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照按3μ1/孔分別加至檢測(cè)試劑的不同反應(yīng)孔中，混勻后短暫離心立即上機(jī)檢測(cè)。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所涉及的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析選用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。IDH1/2 基因突變和TERT 啟動(dòng)子基因突變?cè)诓煌±砑?jí)別腦膠質(zhì)瘤組織中的分布差異采用χ2檢驗(yàn)，二者相關(guān)性選用Spearman 相關(guān)分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在不同病理級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中IDH1/2 基因突變的檢測(cè)分布結(jié)果

IDH 基因突變型在60 例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)26 例（總突變率43.33%），包括高級(jí)別組37 例，突變型12 例（突變率32.43%）；低級(jí)別組23 例，突變型14 例（突變率60.87%）。檢測(cè)結(jié)果顯示在不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中IDH 基因突變的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），詳見(jiàn)表1。IDH 基因突變型與野生型擴(kuò)增曲線(xiàn)圖詳見(jiàn)圖2。

表1 IDH 基因突變?cè)诓煌?jí)別腦膠質(zhì)瘤中的分布情況表

圖2 IDH 基因突變型與野生型擴(kuò)增曲線(xiàn)圖

2.2 在不同病理級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中TERT 基因啟動(dòng)子區(qū)突變的檢測(cè)分布結(jié)果

TERT 基因啟動(dòng)子區(qū)突變型在60 例腦膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)共有32 例（總突變率53.33%），其中23 例C228T 位點(diǎn)突變，9例C250T 位點(diǎn)突變。高級(jí)別組37 例，突變型17 例（突變率45.95%）；低級(jí)別組23 例，突變型15 例（突變率65.22%）。檢測(cè)結(jié)果表明，低級(jí)組的TERT 基因啟動(dòng)子突變的分布明顯高于高級(jí)組和正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)表2；TERT 基因啟動(dòng)子突變型與野生型擴(kuò)增曲線(xiàn)圖詳見(jiàn)圖3。

表2 TERT 基因啟動(dòng)子區(qū)突變?cè)诓煌?jí)別腦膠質(zhì)瘤中的分布情況表

圖3 TERT 基因突變型與野生型擴(kuò)增曲線(xiàn)圖

2.3 IDH 基因突變與TERT 基因啟動(dòng)子區(qū)突變相關(guān)性分析

我們通過(guò)進(jìn)一步Spearman 相關(guān)分析，探究了IDH 基因突變與TERT 基因啟動(dòng)子區(qū)突變的相關(guān)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)IDH 基因突變、TERT 基因啟動(dòng)子區(qū)突變呈負(fù)相關(guān)（r=-0.396，P＜0.01）。詳見(jiàn)表3。

表3 IDH 基因突變與TERT 基因啟動(dòng)子區(qū)突變的相關(guān)性

3 討論

高級(jí)別膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見(jiàn)的最具侵襲性和致命性的彌漫性惡性腫瘤[6]，其總體生存期并不長(zhǎng)[7]。目前臨床上膠質(zhì)瘤的主要治療方式仍然是依賴(lài)手術(shù)切除結(jié)合術(shù)后化療，但是其治療的總體效果較差，生存時(shí)間短，生活質(zhì)量大大降低。所以，找到有效的治療策略和方法去提高患者的生存質(zhì)量和時(shí)間。目前新的分子標(biāo)記物的出現(xiàn)為膠質(zhì)瘤的診斷、預(yù)后及改善生存率提供了可能，近年來(lái)的熱門(mén)研究課題也逐漸向IDH1/2 基因突變和TERT 基因啟動(dòng)子突變傾斜，并且其也是分子標(biāo)記研究相對(duì)較多、較熟悉且有價(jià)值的領(lǐng)域。IDH 是三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵限速酶，研究多次證明IDH1/2 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后相關(guān)，梁博等[8]發(fā)現(xiàn)，具有IDH1 突變的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者總生存期比野生型長(zhǎng)，這也間接證實(shí)了IDH1 基因突變可能會(huì)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)IDH1/2 突變相對(duì)獨(dú)立并且相互排斥，同時(shí)發(fā)生的情況并不多見(jiàn)[9]。此外，發(fā)現(xiàn)IDH 基因突變與膠質(zhì)瘤的病理分型也可能存在某種聯(lián)系，在鑒別與診斷上起到重要意義[10-13]，與本研究結(jié)果在不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中IDH 基因突變的分布存在差異一致。另有研究表明IDH 基因突變可作為臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)早期膠質(zhì)瘤患者的提示，這也就對(duì)于確診患者為神經(jīng)膠質(zhì)瘤和其腫瘤分級(jí)以及預(yù)估術(shù)后腦膠質(zhì)瘤患者生存時(shí)間同樣是具有重要參考價(jià)值。

TERT 基因啟動(dòng)子區(qū)突變最先在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)[14]，其后證實(shí)在腦膠質(zhì)瘤中也存在TERT 基因啟動(dòng)子區(qū)突變[15]，對(duì)膠質(zhì)瘤的形成和發(fā)展起重要作用[16]。突變后的TERT 能夠產(chǎn)生兩個(gè)結(jié)構(gòu)相同的啟動(dòng)子結(jié)合域，使轉(zhuǎn)錄活性成倍的增加,進(jìn)而使端粒酶的活性增強(qiáng)并抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[17-18]。Nonoguchi 等人[19]研究發(fā)現(xiàn)TERT 啟動(dòng)子突變多位于C228T和C250T，且C228T 突變患者預(yù)后差于C250T 突變。另有研究表明端粒的維持可能是腦癌形成的必要前提[20]，在WHOⅡ級(jí)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中具有一定的預(yù)后評(píng)估價(jià)值[21]。本研究中，在60 例腦膠質(zhì)瘤中有32 例發(fā)生TERT 基因啟動(dòng)子區(qū)突變，其中23 例發(fā)生C228T 位點(diǎn)突變，9 例發(fā)生C250T 位點(diǎn)突變，且在低級(jí)別組中的突變率明顯高于高級(jí)別組及正常組，提示突變可能對(duì)患者預(yù)后提供評(píng)估價(jià)值。

Nonoguchi 等[19]研究發(fā)現(xiàn)TERT 基因突變和IDH1 基因突變存在互斥現(xiàn)象，認(rèn)為T(mén)ERTp-mut 對(duì)腫瘤不良預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值很大程度上是得益于其與IDH1/2 突變的負(fù)相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示IDH 基因突變與TERT 基因啟動(dòng)子區(qū)突變存在明顯負(fù)相關(guān)，與上述研究結(jié)果相似。Killela 等[22]和Zachary等[23]研究表明TERT 啟動(dòng)子區(qū)突變和IDH1/2 突變?cè)诓煌瑏喰偷哪z質(zhì)瘤中也明顯存在著分布差異。有研究[24]發(fā)現(xiàn)同時(shí)存在IDH1/2 突變和TERT 啟動(dòng)子區(qū)突變時(shí)高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者的個(gè)體生存期最長(zhǎng)，其次為僅存在IDHI/2 突變的研究組，預(yù)后較差的是無(wú)兩者中任何突變和僅存在TERT 啟動(dòng)子區(qū)突變的患者。這種現(xiàn)象可能與IDH1 突變和TERT 基因啟動(dòng)子突變的協(xié)同作用有一定的聯(lián)系。它們互相影響于彼此的下游信號(hào)通道，并使TERT 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性下降。因此，TERT基因突變的患者預(yù)后較差。

本研究結(jié)果顯示在腦膠質(zhì)瘤中IDH1/2 基因突變與TERT基因啟動(dòng)子區(qū)突變存在明顯相關(guān)性，但是仍舊需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以確認(rèn)它們之間的相互作用，并探討IDH1/2 基因突變與TERT 基因啟動(dòng)子區(qū)突變?cè)谀z質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)更多腫瘤標(biāo)志性基因以及靶向用于臨床。目前雖然IDH1/2 和TERT 基因等分子靶向基因檢測(cè)尚處于早期階段，但隨著更深入的研究，快速、低價(jià)和精準(zhǔn)的分子手段一定會(huì)為臨床治療提供新的途徑和方法，提高腦膠質(zhì)瘤患者的生活質(zhì)量以及改善預(yù)后，推進(jìn)膠質(zhì)瘤患者的個(gè)體化治療。