徐 成 綜述 陳朝紅 審校

氧化應激和炎癥是多種腎臟疾病發(fā)生發(fā)展的關鍵因素,轉錄因子核因子E2相關因子2/抗氧化反應元件[Nrf2/antioxidant response element (ARE)]信號通路是機體內重要的抗氧化應激和抗炎的信號通路,調節(jié)多種抗氧化基因和解毒酶相關基因的轉錄,發(fā)揮抗氧化、抗炎和抗凋亡作用,維持細胞穩(wěn)態(tài),是多種疾病的藥理學靶標。氧化應激和炎癥也是腎臟疾病的主要致病因素和加重因素,Nrf2/ARE通路為腎臟疾病的治療提供了新的思路和靶點[1]。本文將著重介紹Nrf2/ARE信號通路與腎臟疾病的研究進展及其在臨床上的應用。

Nrf2結構和功能介紹

Nrf2屬于CNC (cap and collar,CNC)轉錄因子超家族成員,含有堿性亮氨酸拉鏈結構,由7個高度保守的NRF2-ECH(epichlorohydrin,環(huán)氧氯丙烷,Neh)同源結構域構成,即Neh1-7結構域[2-3]。Neh1結構域介導Nrf2和ARE結合。N端Neh2結構域是負性蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)的結合位點,含有高親和力結合位點ETGE區(qū)和低親和力結合位點DLG區(qū),這是Nrf2活性調節(jié)的結構基礎。Neh3-5結構域通過與轉錄裝置的各種成分結合而在基因反式激活中起作用,Neh3結構域主要招募染色質解旋酶DNA結合蛋白6(Chromo-ATPase/helicase DNA-binding domain 6,CHD6),Neh4和Neh5結構域可與環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白(cAMP Response element-binding protein,CREB)結合,促進Nrf2靶基因的轉錄,此外,Neh4和Neh5也可以與核輔因子RAC3/AIB1/SRC-3相互作用,靶向調控Nrf2的下游基因表達。Neh7結構域與視黃酸X受體α(Retinoid X receptor alpha,RXRα)相互作用,抑制Nrf2下游靶基因的表達(圖1A)。

生理條件下,Nrf2以非活性狀態(tài)存在于細胞質中,與Keap1相偶聯。Keap-1含有泛素連接酶Cullin3結合位點,介導Nrf2泛素化降解。當機體受到氧化應激因子或親電物質刺激后,Nrf2與Keap1解偶聯,Nrf2轉移入核,與核內Maf蛋白結合形成異二聚體后識別并結合于靶基因啟動子區(qū)域抗氧化反應元件,引起抗氧化和細胞保護性基因表達上調(圖1B)[4]。到目前為止,已證實經 Nrf2/ARE信號路徑調節(jié)的基因超過 250個[5]。這些保護性基因包括抗氧化蛋白類、Ⅰ和Ⅱ期藥物代謝酶、 轉運蛋白和抗炎因子等。此外,Nrf2還參與調節(jié)蛋白質磷酸化、糖酵解、線粒體呼吸鏈、氨基酸以及脂質代謝等通路。

圖1 Nrf2蛋白結構域、功能及信號通路Nrf2:核因子E2相關因子2;NH2:蛋白質氨基端;COOH:蛋白質羧基端;ARE:抗氧化反應序列元件;Keap1:Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1;RXRα:視黃酸X受體α;CHD6:染色質解旋酶DNA結合蛋白6;GCLM:谷氨酸半胱氨酸連接酶;GSR:谷胱甘肽還原酶;PLA2G7:磷脂酶A2VII;LIPH: 脂肪酶H;HMOX1:血紅素加氧酶1;LVRA/B:膽綠素還原酶A;53BP1:腫瘤蛋白P53結合蛋白;RAD51:RAD51重組酶。A：Nrf2蛋白7個高度保守的結構域及其功能;B：生理條件下,Nrf2與Keap1相偶聯,被泛素化降解。當機體受到氧化應激因子或親電物質刺激后,Nrf2與Keap1解偶聯,Nrf2轉移入核,結合于靶基因啟動子區(qū)域抗氧化反應元件,引起抗氧化和細胞保護性基因表達

Nrf2激活劑

目前大部分Nrf2激動劑通過靶向Keap1來提高Nrf2穩(wěn)定性,如親電子化合物通過改變Keap1結構,阻止Nrf2與Keap1結合,例如富馬酸二甲酯(N,N-Dimethylformamide,DMF)、姜黃素、蘿卜硫素以及五環(huán)三萜類化合物;糖原合成酸激酶3(GSK-3)抑制劑直接阻止Nrf2與泛素化相關蛋白β-TrCP結合,阻斷Nrf2泛素化降解[6]。巴多索隆甲酯(bardoxolone methyl,CDDO-Me)作為經典的Nrf2激動劑,主要通過與Keap1的C151殘基相互作用,阻礙其與泛素連接酶Cullin3的結合,從而激活Nrf2[7],發(fā)揮抗炎抗氧化作用。我們研究發(fā)現,CDDO-Me激活 Nrf2能抑制氨基核苷嘌呤霉素誘導的足細胞氧化應激和炎癥因子IL-1及腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產生[8]。CDDO-Me目前主要應用于糖尿病腎病、神經退行性疾病、自身免疫性疾病等疾病的臨床實驗研究。

Nrf2與糖尿病腎病

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的嚴重并發(fā)癥,是慢性腎臟病(CKD)的最常見原因。 早期DN的特征是腎小球高濾過,微量蛋白尿。高血糖導致線粒體產生大量的活性氧,造成腎小球和腎小管細胞中的氧化損傷。由于糖尿病小鼠中Nrf2基因敲除表現為腎臟氧化應激水平升高,腎損傷加重,因此Nrf2通路可能是保護DN的重要防御機制[9-10]。在Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠中注射鏈脲佐菌素誘導的1型糖尿病小鼠模型中,蘿卜硫素或肉桂醛均能特異性激活Nrf2,改善糖尿病常見的代謝紊亂癥狀(血糖、胰島素、多飲、多尿和體重減輕),抑制腎臟氧化損傷,改善腎功能[11]。另外在遺傳和高脂飲食誘導的2型糖尿病小鼠模型中,口服CDDO-咪唑內酯(CDDO-Imidazolide,CDDO-Im)、CDDO-Me和姜黃素可增強Nrf2活性并改善胰島素敏感性和葡萄糖耐量,改善糖尿病表型。同時,Keap1flox/-小鼠可預防高熱量飲食誘發(fā)的糖尿病,而且當其和db/db小鼠雜交時,能明顯改善db/db小鼠的胰島素分泌和胰島素抵抗,降低血糖[12]。然而Xu等[13]通過Keap1基因敲除組成型激活Nrf2,發(fā)現Keap1基因敲除增強Lep ob/ob小鼠和高脂飲食小鼠的糖尿病表型,損害胰島素信號傳導,誘導胰島素抵抗。但上述表型是否由Nrf2激活導致,亦或Keap1有不依賴于Nrf2的重要功能尚有爭論。臨床試驗發(fā)現Nrf2激活劑CDDO-Me增加蛋白尿,白蛋白尿與eGFR升高之間存在相關性[14]。Rush等[15]研究顯示Nrf2激活與CKD模型小鼠,如阿霉素腎病和血管緊張素誘導腎損傷模型小鼠的蛋白尿升高有關。Nrf2激活與DN蛋白尿之間的關系還需進一步觀察研究。

Nrf2與狼瘡性腎炎

狼瘡性腎炎是系統性紅斑狼瘡的主要并發(fā)癥,狼瘡性腎炎患者往往伴有氧化應激和炎癥損傷。Nrf2基因敲除加劇了狼瘡腎炎模型小鼠腎臟的氧化應激和腎組織損傷。Barranco等[16]在野生型和Nrf2基因敲除小鼠中構建狼瘡性腎炎模型,發(fā)現Nrf2基因敲除小鼠高表達轉化生長因子β(TGF-β),纖連蛋白和誘導型一氧化氮合酶,并伴隨著腎臟損傷加重的[16-17]。在NZB/WF1或MRL/lpr自發(fā)性狼瘡小鼠模型中,Nrf2激活劑可以預防狼瘡腎炎的發(fā)展,Ebihara等[18]發(fā)現Nrf2的激動劑DMF減弱TNF誘導的人腎小球系膜細胞中炎性細胞因子的產生,抑制降植烷誘導的狼瘡性腎炎。狼瘡自身抗體的產生和狼瘡性腎炎與I型 干擾素受體信號傳導密切相關[19],Han等[20]研究顯示Nrf2激活有助于緩解狼瘡性腎炎的慢性炎癥,Nrf2激動劑CDDO-Me抑制巨噬細胞干擾素受體和干擾素刺激基因表達,減輕氧化應激,調節(jié)巨噬細胞極化,緩解腎臟疾病。上述研究提示以Nrf2為靶點可能是治療狼瘡性腎炎的有效方法[16,21]。

Nrf2與急性腎損傷

腎臟缺血再灌注(IR)伴隨著炎癥和氧化應激水平的增加,往往表現為急性腎損傷,Nrf2基因敲除增強小鼠對缺血性腎損傷的敏感性,Nrf2敲除后缺血再灌注損傷(IRI)模型小鼠腎功能顯著惡化,血管通透性明顯增高;相反,激活Nrf2可明顯改善IRI小鼠腎功能,減少腎臟促炎細胞因子和趨化因子,緩解腎臟纖維化[22]。

藥物激活Nrf2還可明顯改善順鉑、馬兜鈴酸和造影劑等誘導的急性腎損傷[23-25],其機制與Nrf2抗炎和抗氧化相關。急性腎損傷病變的慢性化是腎功能衰竭的重要原因。GSK-3是一種在進化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶,可不依賴Keap1調節(jié)Nrf2活性。在葉酸誘導的腎損傷模型,以及各種病因(如造影劑和馬兜鈴酸)急性腎損傷后發(fā)生CKD的患者中,腎小管GSK-3β持續(xù)高表達,伴有氧化損傷、Nrf2激活減少和其靶基因誘導減少?；謴湍I臟中的Nrf2抗氧化反應,可阻止AKI向CKD的轉化,因此,Nrf2可能是改善AKI長期預后的有效靶點[26]。

Nrf2與腎臟纖維化

腎臟纖維化是CKD進展的主要病理標志。活性氧促進間質成纖維細胞的增殖和細胞外基質蛋白的沉積加速腎臟纖維化。Nrf2誘導劑可緩解腎纖維化。Nrf2活化劑蘿卜硫素、富馬酸二甲酯和齊墩果酸可減輕單側輸尿管梗阻模型大鼠模型中的線粒體損傷,炎癥和氧化應激,從而改善腎功能、減少腎臟纖維化。蘿卜硫素通過抑制GSK-3β的磷酸化增加Nrf2入核,減輕腎臟纖維化[27]。

TGF-β通過上調細胞外基質(extracellular matrix,ECM)表達和促進腎纖維化而引起腎損傷。Song等[28]研究了Nrf2激活對ECM產生和TGF-β/Smad信號傳導的影響,發(fā)現腎小球系膜細胞遺傳性高表達Nrf2可抑制TGF-β1誘導的纖連蛋白和α平滑肌肌動蛋白的表達,并阻斷Smad2/3磷酸化。值得注意的是,高表達Nrf2的系膜細胞中,TGF-β1受體1的水平顯著降低,而抑制TGF-β1/Smad信號傳導的Smad7蛋白水平卻顯著升高。Nrf2藥物激活劑CDDO-Me上調Smad7的水平,降低系膜細胞TGF-β/Smad2/ECM表達。此外,在馬兜鈴酸誘導的腎病小鼠模型中,CDDO-Me治療上調Nrf2和Smad7表達,明顯改善馬兜鈴酸誘導的腎小管壞死和間質纖維化。這些結果表明Nrf2-Smad7軸在保護TGF-β誘導的腎纖維化中起關鍵作用,并且提示了Nrf2對腎臟疾病有益作用的新分子機制[28]。

Nrf2激活劑臨床研究進展

大量體內外實驗證實Nrf2具有顯著的腎臟保護作用,因此目前正在進行多項Nrf2激動劑的臨床研究。甲基巴多索隆是五環(huán)三萜類化合物,通過修飾Keap1的半胱氨酸殘基進而促使Nrf2和Keap1相解離,轉移入核中,激活下游抗氧化基因的表達,發(fā)揮保護作用。最初CDDO-Me作為一種抗腫瘤藥物,在針對實體腫瘤和血液系統惡性腫瘤進行的I期臨床試驗中,意外發(fā)現CDDO-Me顯著增加腎臟疾病患者的eGFR(26%)[29],因此CDDO-Me最有可能成為治療慢性腎臟病有潛力的新藥。

CDDO-Me的Ⅱ期臨床試驗(BEAM試驗)招募227例3～4期CKD合并2型糖尿病患者,分別服用25 mg/d、75 mg/d、150 mg/d的CDDO-Me或安慰劑,為期52周,結果顯示,CDDO-Me給藥組(25 mg/d、75 mg/d和150 mg/d治療組)患者的估算的腎小球濾過率(eGFR)顯著增加,而且停藥一周后,患者的eGFR仍然高于基線水平[30]。然而CDDO-Me的Ⅲ期臨床試驗(BEACON試驗)因為治療組患者心血管風險性增高而被提前終止,后續(xù)有研究報道,有心血管基礎疾病的患者,在治療過程中可能易發(fā)生心血管事件,而基礎血清BNP濃度<200 pg/ml的CDDO-Me受試者中,心力衰竭發(fā)生率與安慰劑受試者相當[31]。

2015年,CDDO-Me的Ⅱ期臨床試驗重新開始(TSUBAKI 試驗),其中入選的3～4期CKD患者均不包括有液體超負荷危險因素(例如高水平的BNP和心力衰竭病史),結果顯示CKD患者的eGFR顯著增加并且沒有任何液體超負荷的跡象[32]?；赥SUBAKI 研究,2018年,啟動了一項名為AYAME的CDDO-Me 的Ⅲ期隨機對照臨床試驗(NCT03550443),入選對象主要是3～4期CKD合并糖尿病的患者,主要終點是eGFR從基線開始下降超過30%。AYAME研究將在2022年完成,預計該數據將進一步明確CDDO-Me對治療DN患者的具體作用。

除DN外,目前正在開展CDDO-Me治療各種其他類型腎臟疾病的臨床試驗。例如,CARDINAL研究和FALCON研究正在進行Alport綜合征(由異常IV型膠原引起的遺傳性腎臟疾病)和ADPKD(常染色體顯性多囊腎)的臨床試驗(Ⅱ-Ⅲ階段,2017～2020年,NCT03019185和Ⅲ期,2019-2023,NCT03918447)。

總 結

氧化應激和炎癥加速CKD疾病進程。 Nrf2是抗氧化和抗炎的主要調節(jié)因子,可誘導細胞保護性基因和抗氧化酶的表達。大量研究表明,Nrf2激活可抵御氧化應激,減輕炎癥,減緩AKI和CKD進展。幾種天然和合成的Nrf2誘導劑可減輕動物模型中的腎臟損傷,正在開展臨床實驗,顯示Nrf2為靶點治療腎臟疾病具有臨床應用前景。