梁怡蕭, 潘建章, 方 群

(浙江大學(xué)化學(xué)系, 微分析系統(tǒng)研究所, 浙江 杭州 310058)

藥物篩選是指從天然產(chǎn)物或者人工合成的化合物中篩選出具有生物活性的新藥或者先導(dǎo)化合物[1],是新藥研發(fā)過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)需要采用適當(dāng)?shù)乃幬镒饔冒悬c(diǎn)對(duì)大量化合物樣品進(jìn)行篩選。而隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、組合化學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,藥物分子庫(kù)在不斷擴(kuò)大,藥物作用靶點(diǎn)也越來(lái)越多,這使得藥物發(fā)現(xiàn)的范圍逐漸擴(kuò)大,藥物篩選的工作量急劇增加。因此高通量篩選(high-throughput screening)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。高通量篩選系統(tǒng)以分子水平或細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ),通過(guò)自動(dòng)化操作系統(tǒng)、靈敏快速的檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)數(shù)千個(gè)反應(yīng)同時(shí)測(cè)試和分析,大大提高了藥物篩選的實(shí)驗(yàn)規(guī)模和效率?；诩?xì)胞水平的藥物篩選系統(tǒng)因?yàn)楦咏咏梭w生理?xiàng)l件,實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確率更高,成為主要的篩選模型。

目前已經(jīng)發(fā)展成熟的細(xì)胞高通量篩選系統(tǒng)主要是基于多孔板進(jìn)行的。它們利用自動(dòng)化的液體轉(zhuǎn)移分配機(jī)械臂完成對(duì)液體的多步操控和試劑運(yùn)輸,并使用多孔板掃描儀或者自動(dòng)化顯微鏡掃描拍攝技術(shù)對(duì)細(xì)胞的生存情況進(jìn)行檢測(cè)。但是這些自動(dòng)化設(shè)備的價(jià)格相對(duì)較高,不利于普通小型的研究中心或?qū)嶒?yàn)室使用。另外,用于藥物篩選的生物樣品和藥物庫(kù)的成本也較高,而目前常規(guī)液體處理設(shè)備能夠準(zhǔn)確操控的液體體積在數(shù)百納升水平。

微流控技術(shù)[2]是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一,其核心是將常規(guī)化學(xué)、生物等領(lǐng)域所涉及的基本操作單元集成到方寸大小的芯片上,實(shí)現(xiàn)對(duì)nL級(jí)至pL級(jí)液體的精準(zhǔn)操控,在化學(xué)[3]、生物學(xué)[4,5]、醫(yī)學(xué)[6,7]等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用。利用微流控技術(shù)可以構(gòu)建高通量、低成本細(xì)胞水平的藥物篩選系統(tǒng),系統(tǒng)具有樣品及試劑消耗量少、系統(tǒng)高度集成化和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí),微流控芯片與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)器皿相比,在細(xì)胞培養(yǎng)上也具有諸多優(yōu)勢(shì)。如通過(guò)選擇不同的芯片材料或者設(shè)計(jì)不同的細(xì)胞培養(yǎng)腔室結(jié)構(gòu),更容易實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的三維(3D)培養(yǎng)[8-10]。因此,基于微流控技術(shù)的細(xì)胞篩選系統(tǒng)是一種極具潛力的藥物篩選系統(tǒng)。

在微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)中,通常會(huì)涉及細(xì)胞的接種、培養(yǎng)液的更換或添加、藥物的加入與清洗、細(xì)胞染色試劑的添加等操作,這些操作均需通過(guò)對(duì)微流體的操控得以實(shí)現(xiàn)。按照微流體操控模式的不同,可將微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)分為3類,分別是灌注流模式、液滴模式和微陣列模式[11]。

1 基于灌注流模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)

基于灌注流模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng),通過(guò)控制流體連續(xù)流過(guò)微通道,將細(xì)胞接種在微通道中的細(xì)胞培養(yǎng)腔室,并完成對(duì)細(xì)胞的藥物刺激。流體的驅(qū)動(dòng)力主要有外部機(jī)械泵驅(qū)動(dòng)[12,13]、電滲驅(qū)動(dòng)[14]、重力驅(qū)動(dòng)[15]以及表面張力驅(qū)動(dòng)[16]等方式。這類系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于容易實(shí)施,并適用于不同的細(xì)胞檢測(cè)方法,如熒光檢測(cè)[17]、吸光度檢測(cè)[18]、電化學(xué)傳感器實(shí)時(shí)檢測(cè)[19-22],以及通過(guò)質(zhì)譜對(duì)細(xì)胞代謝物或其他生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)[23,24]。這類系統(tǒng)的局限性主要有:利用微通道進(jìn)行連續(xù)流體輸送易導(dǎo)致較高的試劑消耗;當(dāng)被應(yīng)用于大規(guī)模的藥物篩選時(shí),芯片結(jié)構(gòu)通常比較復(fù)雜,涉及多種通道、液體控制泵和閥門的設(shè)計(jì)[25,26]。

圖 1 基于灌注流模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)Fig. 1 Cell-based microfluidic screening systems based on perfusion flow mode a. schematic diagram of the pneumatically-actuated elastomeric valves based microfluidic platform for cell cytotoxicity screening[17]; b. schematic diagram of the microfluidic system based on bridge-and-underpass architecture[27]; c. schematic diagram of the integrated microfluidic device with concentration gradient generators[28]; d. schematic diagram of the 3D printed concentration gradient generator[32].

Wang等[17]設(shè)計(jì)了一種基于灌注流模式的微流控芯片,用于正交化的藥物篩選(見(jiàn)圖1a)。芯片在水平和垂直兩個(gè)方向上分別加工有24條通道,通過(guò)在芯片中集成氣動(dòng)彈性微閥實(shí)現(xiàn)對(duì)垂直通道和水平通道的分別控制,完成不同類型的細(xì)胞接種和不同藥物對(duì)不同細(xì)胞的正交化刺激。利用該芯片測(cè)試了洋地黃皂苷(digitonin)、皂角苷(saponin)、丙烯醛(acrolein)、氯化鈷(CoCl2)和氯化鎳(NiCl2)5種物質(zhì)分別對(duì)于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(BALB/3T3)、HeLa細(xì)胞和牛內(nèi)皮細(xì)胞(bovine endothelial cells)的毒性作用,實(shí)現(xiàn)了高密度平行的藥物篩選。Park等[27]在類似的芯片結(jié)構(gòu)上設(shè)計(jì)了橋連式的微通道來(lái)輸送細(xì)胞和藥物(見(jiàn)圖1b),研究了細(xì)胞外基質(zhì)與可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1對(duì)二型肺泡上皮細(xì)胞(ATII)表型的影響。這種方法不僅可以提高對(duì)目標(biāo)細(xì)胞腔室尋址的靈活性,還能減少流體剪切力對(duì)細(xì)胞的影響。

圖 2 基于3D細(xì)胞培養(yǎng)的灌注流模式微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)Fig. 2 3D cell culture-based microfluidic screening systems based on the perfusion flow mode a. schematic diagram of cell chambers with two sizes used for the formation of cell spheres[38]; b. schematic diagram of the 3D cell perfusion culture chip with an array of micropillars in the microfluidic channel[39]; c. schematic diagram of the integrated microchip with interdigitated microelectrodes[20].

顯著的層流效應(yīng)是灌注流體系的主要特征之一,利用該效應(yīng)可以在微通道內(nèi)形成具有較高重現(xiàn)性和穩(wěn)定性濃度梯度的液流,這類系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞高通量藥物篩選中。Ye等[28]將濃度梯度藥物形成與細(xì)胞培養(yǎng)這兩個(gè)單元集成到一個(gè)圓盤芯片中(見(jiàn)圖1c)。該芯片含8個(gè)具有相同結(jié)構(gòu)的單元,每個(gè)單元在上游包含一個(gè)“圣誕樹(shù)”結(jié)構(gòu)的濃度梯度生成器,下游平行連接多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)腔室,單次可產(chǎn)生64種藥物作用條件,實(shí)現(xiàn)了對(duì)阿霉素(doxorubicin)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞(HepG2)凋亡過(guò)程的監(jiān)測(cè)。An等[29]將兩個(gè)相似結(jié)構(gòu)的濃度梯度生成器與細(xì)胞培養(yǎng)腔室正交連接,評(píng)估了姜黃素(curcumin)和腫瘤壞死因子-α相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體對(duì)前列腺癌細(xì)胞(PC3)的聯(lián)合治療效果。為了擴(kuò)大藥物濃度梯度范圍,Zhang等[25]設(shè)計(jì)了一種非對(duì)稱流體通道結(jié)構(gòu)的濃度梯度生成器,用于生成具有對(duì)數(shù)級(jí)濃度混合比的藥物組合。3D打印技術(shù)由于能夠制造結(jié)構(gòu)復(fù)雜且相互連接的微流體通道,因而被用來(lái)加工用于溶液混合的微流控芯片[30-33]。Chen等[32]利用3D打印得到了具有三維立體螺旋結(jié)構(gòu)的濃度梯度生成器(見(jiàn)圖1d),并測(cè)試了4種藥物的36種濃度組合對(duì)肺癌細(xì)胞(A549)的抑制作用。

圖 3 基于灌注流模式的器官芯片系統(tǒng)Fig. 3 Organ-on-a-chip systems based on perfusion flow mode a. schematic diagram of the lung-on-a-chip system[42]; b. schematic diagram of the organ-on-a-chip system for studying tumor-induced angiogenesis[49]; c. schematic diagram of the organ-on-a-chip system integrating four types of organ cells[50].

基于微通道表面的二維(2D)細(xì)胞培養(yǎng)模式缺乏細(xì)胞生長(zhǎng)分化所需的多層次微環(huán)境,例如細(xì)胞和細(xì)胞之間以及細(xì)胞和基質(zhì)之間的相互作用,這可能會(huì)導(dǎo)致篩選得到的藥物在被應(yīng)用到臨床試驗(yàn)時(shí),治療效果產(chǎn)生較大偏差[34]。3D細(xì)胞培養(yǎng)模式因?yàn)榭梢蕴峁└咏咏w內(nèi)條件的微環(huán)境[35-37],而吸引了越來(lái)越多研究人員的關(guān)注[20,38-41]。如圖2a所示，Patra等[38]通過(guò)對(duì)聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片進(jìn)行預(yù)處理,使細(xì)胞不能貼壁生長(zhǎng),從而在腔室中形成細(xì)胞球并進(jìn)行藥物刺激。該研究組研究了順鉑(cisplatin)、白藜蘆醇(resveratrol)和替拉扎明(tirapazamine)3種藥物對(duì)不同大小的HepG2細(xì)胞球的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,細(xì)胞球的大小和細(xì)胞的培養(yǎng)模式(2D和3D)對(duì)藥物刺激結(jié)果均有明顯的影響。Toh等[39]報(bào)道了一種基于3D肝細(xì)胞培養(yǎng)的微流控芯片系統(tǒng)(見(jiàn)圖2b)。通過(guò)在芯片的通道中央加工兩排并列的微柱陣列來(lái)固定肝細(xì)胞,維持肝細(xì)胞的3D形態(tài)和代謝功能,之后由兩側(cè)平行通道引入不同的藥物刺激肝細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞的高通量藥物毒性測(cè)試。Mulholland等[40]發(fā)展了一種微流控平臺(tái),該平臺(tái)直接利用腫瘤活檢中獲得的富含癌細(xì)胞的多細(xì)胞球體進(jìn)行藥物篩選,能夠提高篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。Pandya等[20]將電化學(xué)傳感器集成到微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)中,通過(guò)叉指微電極實(shí)時(shí)檢測(cè)3D凝膠基質(zhì)中植入的癌細(xì)胞對(duì)不同藥物的敏感性(見(jiàn)圖2c)。這些數(shù)據(jù)可以潛在地預(yù)測(cè)患者對(duì)于不同化療方法的反應(yīng),從而選擇出最佳治療手段,改善癌癥治療效果

隨著微流控技術(shù)的不斷發(fā)展,多種能夠用于模擬人體不同器官及組織間相互作用的器官芯片(organ-on-a-chip)系統(tǒng)已經(jīng)被報(bào)道,包括肺芯片[42-44]、腎芯片[45,46]、腦芯片[47]和腸-肝-腫瘤芯片[48]等。這些器官芯片系統(tǒng)大部分是基于灌注流模式構(gòu)建。Huh等[42,43]構(gòu)建了一種具有一定仿生功能的肺芯片(見(jiàn)圖3a)。該芯片中,在上下兩個(gè)PDMS通道之間加工有PDMS多孔膜,PDMS多孔膜上下兩側(cè)分別接種肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,肺泡上皮細(xì)胞暴露在空氣中模擬肺泡的空隙,培養(yǎng)基從下方通道注入模擬毛細(xì)血管,通過(guò)循環(huán)施加真空帶動(dòng)膜的往復(fù)運(yùn)動(dòng)模擬肺的呼吸。該研究組將白細(xì)胞介素-2(interleukin-2)添加到培養(yǎng)基中,再現(xiàn)了其導(dǎo)致肺水腫的藥物毒性,并觀察到血管生成素-1(angiopoietin-1)以及一種新的香草酸受體4的離子通道抑制劑(GSK2193874)能抑制其藥物毒性。Liu等[49]設(shè)計(jì)了一種微通道芯片用于模擬腫瘤誘導(dǎo)的血管生成(見(jiàn)圖3b)。芯片包含6個(gè)獨(dú)立的血管生成單元,每個(gè)單元由一個(gè)開(kāi)放式的細(xì)胞培養(yǎng)腔室和腔室兩側(cè)的血管生成通道組成。通過(guò)觀察內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)下的遷移和血管生成過(guò)程,研究了不同的抗血管生成試劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用。Oleaga等[50]構(gòu)建了一種包含心臟、肌肉、神經(jīng)元和肝臟細(xì)胞的多器官芯片(見(jiàn)圖3c)。通過(guò)重力驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)基在不同細(xì)胞腔室之間循環(huán)流動(dòng),實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)和藥物刺激過(guò)程。在芯片上測(cè)試了5種藥物的細(xì)胞毒性,得到的結(jié)果與已被公布的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)毒性結(jié)果基本一致。

圖 4 基于液滴模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)Fig. 4 Cell-based microfluidic screening systems based on droplet mode a. workflow of the droplet-based drug screening platform[54]; b. schematic diagram of the microwell array for randomly pairing droplets[55]; c. schematic diagram of the microchannel chamber for trapping droplets[56].

2 基于液滴模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)

自2001年Quake研究組[51]提出液滴微流控的概念以來(lái),液滴微流控技術(shù)得到了長(zhǎng)足發(fā)展,在高通量藥物篩選領(lǐng)域也得到了廣泛應(yīng)用?；谝旱文Ｊ降奈⒘骺叵到y(tǒng)利用互不相溶的兩相形成pL至nL級(jí)包裹細(xì)胞的液滴,在液滴中完成細(xì)胞的培養(yǎng)和對(duì)細(xì)胞的藥物刺激等操作[52]。這類系統(tǒng)可以在短時(shí)間內(nèi)形成大量細(xì)胞液滴,提高實(shí)驗(yàn)的通量,并可有效降低試劑的消耗量,但液滴反應(yīng)器的使用同時(shí)也對(duì)液滴內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的更新和細(xì)胞代謝物的清理提出了挑戰(zhàn)。

Clausell-Tormos等[53]首次建立了可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)的液滴微流控系統(tǒng),以添加了表面活性劑的氟油(FC40)為連續(xù)相(continuous phase),細(xì)胞懸浮液為分散相(dispersed phase),生成了FC40包裹的細(xì)胞液滴。FC40具有良好的生物兼容性和透氣性,因此能夠使得細(xì)胞在液滴中正常生長(zhǎng)。該研究組分別以白血病T細(xì)胞(jurkat)和腎細(xì)胞(HEK293T)作為懸液細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的代表,證明了即使在液滴體積僅為660 pL的條件下,3 d后細(xì)胞的存活率仍能達(dá)到80%。

圖 5 基于3D細(xì)胞培養(yǎng)的液滴模式微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)Fig. 5 Droplet mode microfluidic systems based on 3D cell culture a. schematic diagram of the microfluidic flow-focusing device for generating mixed hydrogel droplets[57]; b. formation of coculture tumor spheroid with stromal fibroblast cells[58]; c. illustration of cell culture and drug testing process in the sidewall-attached droplet array: Fig. c1. cell seeding; Fig. c2. formation of cell spheroid in a droplet; Fig. c3. addition of the drug; Fig. c4. addition of fluorescence dye to stain the cell spheroid[62].

除了產(chǎn)生大小均一的液滴,能夠?qū)σ旱芜M(jìn)行精準(zhǔn)操控是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分析的必要條件。Brouzes等[54]構(gòu)建了一種集成化的液滴微流控系統(tǒng),用于高通量單細(xì)胞藥物篩選(見(jiàn)圖4a)。首先利用光學(xué)編碼技術(shù)對(duì)不同的藥物液滴進(jìn)行標(biāo)記,形成化合物庫(kù),再在電場(chǎng)的作用下將藥物液滴和單細(xì)胞液滴順序融合、收集,孵育24 h后將其重新注入微流控芯片中,并將其與含有細(xì)胞活性分析試劑的液滴再次融合,對(duì)藥物刺激結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)分析。Kulesa等[55]同樣利用電場(chǎng)融合液滴的方法設(shè)計(jì)了一套適用于組合藥物篩選的微流控芯片系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中,細(xì)胞懸浮液、不同的藥物溶液和特異性熒光染料被預(yù)先混合并乳化為液滴,這種熒光染料能夠分別在不同的激發(fā)光下實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的識(shí)別和細(xì)胞活性的檢測(cè)。之后將得到的液滴注入PDMS微坑芯片中,由于微坑的獨(dú)特結(jié)構(gòu),每個(gè)微坑能夠同時(shí)捕獲兩個(gè)液滴,兩個(gè)隨機(jī)被捕獲的液滴在電場(chǎng)作用下融合,進(jìn)行藥物對(duì)細(xì)胞的刺激實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖4b)。利用該系統(tǒng)評(píng)估了4 000多種藥物與10種抗生素對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)的聯(lián)合作用,成功發(fā)現(xiàn)了多種之前未被報(bào)道的協(xié)同組合。Wong等[56]設(shè)計(jì)了一種PDMS通道芯片,用于形成細(xì)胞液滴進(jìn)行藥物篩選(見(jiàn)圖4c)。每個(gè)單通道包含48個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)腔室,當(dāng)細(xì)胞樣品從通道入口流入時(shí),由于腔室(well)之后通道(restriction)的限制壓力,流體只能進(jìn)入腔室區(qū)域和旁路通道(bypass);隨后再通入油相,由于腔室之前通道(neck)的限制壓力,油相無(wú)法進(jìn)入腔室,從而截?cái)嗔黧w,即可依次在腔室中形成細(xì)胞液滴。在該系統(tǒng)中,一個(gè)通道中平均截留80 000個(gè)細(xì)胞,用以篩選5種藥物作用條件,對(duì)于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞均可適用,可實(shí)現(xiàn)在腫瘤切除24 h內(nèi),快速、低成本地篩查原發(fā)性腫瘤癌細(xì)胞。

為了更好地模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞,目前已經(jīng)發(fā)展了多種基于3D細(xì)胞培養(yǎng)的液滴微流控系統(tǒng)[57-61]。Wang等[57]將HeLa細(xì)胞包裹在由藻酸鹽和基質(zhì)膠混合得到的水凝膠液滴中,形成細(xì)胞球(見(jiàn)圖5a),之后使用長(zhǎng)春新堿(vincristine)對(duì)細(xì)胞球進(jìn)行刺激。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相比于傳統(tǒng)單層培養(yǎng)的細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞球具有更明顯的耐藥性。Sun等[58]開(kāi)發(fā)了一種生成具有核-殼結(jié)構(gòu)的藻酸鹽微粒的方法,之后將乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和成纖維細(xì)胞(human mammary fibroblasts)分別封裝在藻酸鹽微粒的核與殼中,建立3D共培養(yǎng)的腫瘤模型,模擬體內(nèi)微小的腫瘤組織(見(jiàn)圖5b)。利用該共培養(yǎng)腫瘤球體測(cè)定了姜黃素和紫杉醇(paclitaxel)兩種抗癌藥物的細(xì)胞毒性,顯示出與常規(guī)孔板方法結(jié)果相似的腫瘤球耐藥性。該方法可快速形成大小一致但組成不同的各種腫瘤球體,應(yīng)用于大規(guī)模抗腫瘤藥物的篩選,同時(shí)也為細(xì)胞的共培養(yǎng)模式提供了新思路。作者所在研究組[62]發(fā)展了一種在PDMS基片的側(cè)壁上形成細(xì)胞球的方法,通過(guò)序控液滴陣列(SODA)技術(shù)控制毛細(xì)管探針在基片側(cè)壁依次形成細(xì)胞懸液的懸滴,并穩(wěn)定地附著在側(cè)壁上,最終培養(yǎng)形成了HepG2細(xì)胞球,并完成了阿霉素對(duì)細(xì)胞球的刺激實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖5c)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不僅可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的3D培養(yǎng),還使得懸滴的上方和下方均處于開(kāi)放的狀態(tài),可以方便地完成后續(xù)的藥物加入、細(xì)胞染色以及細(xì)胞觀察等操作。

圖 6 基于微陣列模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)Fig. 6 Cell-based microfluidic screening systems based on microarray mode a. schematic diagram of the DataChip platform for testing of compound toxicity[63]; b. schematic diagram of the cell-seeded microwell and chemical-laden post aligned and sandwiched together[68]; c. schematic diagram of the liver-immune coculture array chip[71]; d. formation of the cell droplet array based on superhydrophilic-superhydrophobic micropattern[75]; e. illustration of the drug combination screening based on sequential operation droplet array (SODA) system[77].

3 基于微陣列模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)

基于微陣列模式的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)是指在能夠適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的載體上,通過(guò)一定的手段生成細(xì)胞液滴陣列,并對(duì)細(xì)胞液滴陣列進(jìn)行操控和分析。這類系統(tǒng)能夠通過(guò)擴(kuò)大液滴陣列的規(guī)模在單次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)篩選大量不同的樣品,而且容易實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞液滴陣列的整體操控以提高篩選效率[63-65],但同時(shí)這些操作的實(shí)現(xiàn)也依賴于高精度且配套的液體操控設(shè)備。

Lee等[63]構(gòu)建了一種名為水凝膠液滴陣列(DataChip)的微陣列芯片系統(tǒng)(見(jiàn)圖6a),并應(yīng)用于高通量藥物篩選實(shí)驗(yàn)中。首先利用凝膠打印機(jī)在經(jīng)過(guò)處理的玻璃表面生成含有乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的水凝膠液滴陣列進(jìn)行孵育培養(yǎng),然后將預(yù)先制備的藥物凝膠陣列(MetaChip)貼合于細(xì)胞凝膠陣列上完成藥物刺激實(shí)驗(yàn)。該系統(tǒng)最多可集成1 080個(gè)不同條件的液滴陣列,藥篩結(jié)果與傳統(tǒng)的基于96孔板的方法所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近,但藥物消耗量可以降低約2 000倍。之后該研究組還提出了通過(guò)在微柱陣列芯片的微柱上形成水凝膠細(xì)胞液滴用于藥物篩選的方法[66,67]。

微坑陣列因?yàn)橐子诩庸?、通量?在形成細(xì)胞液滴陣列上應(yīng)用非常廣泛[68-70]。Wu等[68]利用聚乙二醇(PEG)微坑陣列芯片和PDMS微柱陣列芯片構(gòu)建了一種夾心結(jié)構(gòu)的微流控細(xì)胞篩選系統(tǒng)(見(jiàn)圖6b)。先通過(guò)點(diǎn)樣儀將不同的藥物沉積在PDMS微柱陣列上,之后插入接種了細(xì)胞的PEG微坑中,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的藥物刺激。盡管該微坑/微柱陣列芯片僅為普通載玻片大小,但單次可完成2 100個(gè)測(cè)定。利用該系統(tǒng)測(cè)試了320種天然化合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的化學(xué)毒性,還進(jìn)行了P-糖蛋白(P-glycoprotein)與天然化合物的組合檢測(cè),成功篩選出能夠增強(qiáng)對(duì)MCF-7細(xì)胞抑制作用的組合。Li等[64]設(shè)計(jì)了類似的微坑/微柱結(jié)構(gòu)裝置。直接以1 536孔板提供微坑,制備互補(bǔ)的PDMS微柱,并將其連接到1 536孔板的板蓋上,加藥時(shí)翻轉(zhuǎn)板蓋對(duì)準(zhǔn)孔板使微柱插入孔中。通過(guò)熒光檢測(cè)藥物與乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)的相互作用,獲得了抑制MDA-MB-231細(xì)胞活性的先導(dǎo)單一藥物以及具有協(xié)同作用的藥物組合。Chong等[71]設(shè)計(jì)了一種由同心細(xì)胞腔室單元組成的微坑陣列芯片,用于細(xì)胞的共培養(yǎng)(見(jiàn)圖6c)。每個(gè)同心細(xì)胞腔室單元由中心腔室和環(huán)形腔室組成。肝細(xì)胞球體(HepaRG)和U937免疫細(xì)胞分別被接種在中心腔室和環(huán)形腔室中,經(jīng)過(guò)肝代謝后的活性代謝物通過(guò)腔室之間的微通道擴(kuò)散至鄰近的免疫腔室中。通過(guò)檢測(cè)免疫細(xì)胞的活化程度,測(cè)試了3種藥物的致敏性,表明了與傳統(tǒng)細(xì)胞遷移腔室(Transwell)培養(yǎng)方式相比,該芯片可以更好地區(qū)分皮膚過(guò)敏的致敏藥物和非致敏藥物。

利用表面張力來(lái)形成細(xì)胞液滴陣列也是常用的一種方法。通常會(huì)選擇對(duì)芯片表面進(jìn)行選擇性修飾[72-75],改變芯片表面特定區(qū)域的親疏水性質(zhì),使得細(xì)胞懸液被截留在特定區(qū)域,從而形成細(xì)胞液滴陣列。Popova等[75,76]開(kāi)發(fā)了一種形成超疏水-超親水微圖案的方法。利用超疏水和超親水區(qū)域的潤(rùn)濕性差別,自發(fā)地形成細(xì)胞液滴陣列(見(jiàn)圖6d)。通過(guò)在這些獨(dú)立的液滴中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),再加入不同的藥物試劑,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的高通量分析。Zhang等[65]制備了一種由PDMS微坑陣列和超疏水聚合物層組成的超疏水微坑陣列芯片。除了能用來(lái)接種細(xì)胞液滴,還可以快速實(shí)現(xiàn)整個(gè)液滴陣列的培養(yǎng)基更換,因此該系統(tǒng)兼容于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。

作者所在研究組[77]也將SODA技術(shù)應(yīng)用于構(gòu)建細(xì)胞液滴陣列中,發(fā)展了一種基于細(xì)胞液滴微陣列的藥物篩選系統(tǒng)。得益于SODA技術(shù)對(duì)液體的靈活操控能力(包括液體的量取、吸取、轉(zhuǎn)移、注射、混合等),該系統(tǒng)在一塊PDMS芯片上完成了藥物篩選過(guò)程所需要的全部操作步驟,包括細(xì)胞接種、第一個(gè)藥物刺激、第二個(gè)藥物刺激、細(xì)胞熒光標(biāo)記等。采用每24 h更換一次細(xì)胞液滴培養(yǎng)基的方法,在覆蓋了氟油(FC40)的500 nL液滴中完成了長(zhǎng)達(dá)11 d的細(xì)胞培養(yǎng)。該系統(tǒng)被應(yīng)用于3種抗癌藥物黃酮哌啶醇(flavopiridol)、紫杉醇和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)對(duì)A549細(xì)胞的藥物聯(lián)用組合篩選中(見(jiàn)圖6e),得到了產(chǎn)生最佳抑制效率的藥物組合。

4 總結(jié)與展望

高通量藥物篩選是現(xiàn)階段藥物開(kāi)發(fā)的主要途徑。微流控技術(shù)的出現(xiàn)使生化反應(yīng)可以在微加工的通道、腔室或nL級(jí)甚至是pL級(jí)的液滴中進(jìn)行,這在很大程度上改變了傳統(tǒng)高通量篩選系統(tǒng)的工作模式,引起了人們的廣泛關(guān)注,使得基于微流控技術(shù)的細(xì)胞篩選系統(tǒng)得到了快速發(fā)展,展現(xiàn)出突出的研究潛力和應(yīng)用價(jià)值。

盡管微流控技術(shù)在試劑消耗、篩選通量、細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境控制等方面與常規(guī)方法相比已經(jīng)展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì),但仍然有很大的發(fā)展空間。目前文獻(xiàn)報(bào)道的大部分微流控細(xì)胞水平高通量藥物篩選系統(tǒng)仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段,尚未達(dá)到商品化和通用化的程度。多數(shù)系統(tǒng)還難以在超微量和高通量水平下,完成從細(xì)胞陣列的形成、培養(yǎng)到加藥和檢測(cè)等全過(guò)程操作的自動(dòng)化。如何自動(dòng)實(shí)現(xiàn)有限細(xì)胞的精準(zhǔn)量取與分配,如何精準(zhǔn)地控制批量微反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)條件,如何自動(dòng)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模具有不同組成和濃度藥物的加入和刺激,以及如何自動(dòng)實(shí)現(xiàn)篩選結(jié)果的快速高通量檢測(cè)等,是下一步在實(shí)現(xiàn)微流控細(xì)胞水平高通量藥物篩選系統(tǒng)實(shí)用化中應(yīng)該重點(diǎn)解決的問(wèn)題。此外,目前的微流控系統(tǒng)構(gòu)建的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境與實(shí)際體內(nèi)細(xì)胞的微環(huán)境還有較大差距。為了能夠提高藥物篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性,目前研究者們已經(jīng)不局限于傳統(tǒng)獨(dú)立細(xì)胞的培養(yǎng)模型,而是通過(guò)構(gòu)建各種不同結(jié)構(gòu)的器官芯片來(lái)進(jìn)一步模擬人體組織和器官的功能,包括實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的共培養(yǎng)、血液的流動(dòng)以及物質(zhì)的傳輸?shù)?以此來(lái)提供一個(gè)更加接近人體真實(shí)生理和病理?xiàng)l件的研究模型,這也將是今后該領(lǐng)域的重點(diǎn)發(fā)展方向之一。

總之,微流控藥物篩選系統(tǒng)發(fā)展的最終目的是為了減少藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的需求,甚至是部分替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn),以促進(jìn)更大規(guī)模、更高通量,同時(shí)更安全、更有效的藥物開(kāi)發(fā)。雖然這還有很長(zhǎng)的道路要走,但隨著微流控技術(shù)的快速發(fā)展,微流控細(xì)胞水平的高通量藥物篩選系統(tǒng)一定會(huì)得到進(jìn)一步完善,實(shí)現(xiàn)更為強(qiáng)大和復(fù)雜的功能,成為推進(jìn)全自動(dòng)藥物開(kāi)發(fā)的重要力量。