許志英，王佰翠，馬曉蘭，賈子苗，葉興國，林志珊，胡漢橋

基于小麥SNP芯片對(duì)簇毛麥6V#2和6V#4染色體及其與小麥6A、6D染色體的多態(tài)性分析

許志英1,2，王佰翠2，馬曉蘭2，賈子苗2，葉興國2，林志珊2，胡漢橋1

1廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東湛江 524088；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081

【】利用大數(shù)據(jù)比較2條不同的簇毛麥6V（#2和#4）染色體及其與小麥6A、6D染色體間DNA水平上的差異，為小麥-簇毛麥靶向易位的精準(zhǔn)設(shè)計(jì)育種提供依據(jù)。以6V#4（6D）異代換系RW15為父本和6V#2（6A）異代換系南87-88為母本進(jìn)行雜交，獲得F2分離群體，利用6V#4S/6V#2S/6AS/6DS/6VL特異分子標(biāo)記檢測F2植株，篩選新類型的代換系，并用分子標(biāo)記結(jié)合基因組原位雜交（genomichybridization，GISH）對(duì)新類型代換系進(jìn)行確認(rèn)，再利用小麥55K芯片中的6A、6D探針，對(duì)新代換系及其雙親南87-88和RW15進(jìn)行分析；結(jié)合660K芯片6A、6D探針對(duì)2份簇毛麥的SNP分析結(jié)果，篩選6V特異SNP。GISH分析表明，19EL124和19EL134的體細(xì)胞染色體數(shù)2n=42，分別攜帶2條完整的外源染色體；分子標(biāo)記鑒定結(jié)果表明，19EL124含有6V#4S/6DS特異標(biāo)記帶，缺失了6V#2S/6AS特異帶，而19EL134含有6V#2S/6AS特異標(biāo)記帶，缺失了6V#4S/6DS特異帶；19EL124和19EL134都含有6VL的特異帶，證明19EL124為6V#4（6A）異代換系，19EL134為6V#2（6D）異代換系。55K芯片檢測結(jié)果表明，異代換系中關(guān)鍵染色體探針的檢測效率顯著低于其他染色體，且對(duì)同類型異代換不同系的檢測效率也有所不同。1 177個(gè)6A探針中，63.21%不能對(duì)6A代換系南87-88分型，68.90%不能對(duì)6A異代換系19EL124分型，22.51%檢測到6V#2和6V#4間的多態(tài)性，其中88個(gè)只能檢測到6V#4染色體，而155個(gè)只能檢測到6V#2染色體；479個(gè)6D探針中，49.48%不能對(duì)6D異代換系RW15分型，53.44%不能對(duì)6D代換系19EL134分型，16.70%檢測到6V#2和6V#4間的多態(tài)性，其中23個(gè)只能檢測到6V#2染色體，42個(gè)只能檢測到6V#4染色體。整合55K和660K芯片的共有探針，分別從395個(gè)6A、231個(gè)6D探針篩選獲得簇毛麥6V特異的SNP標(biāo)記22個(gè)和15個(gè)，其中3個(gè)可在6V#2和6V#4染色體間顯示多態(tài)性。小麥染色體的缺失與外源染色體的替換，使相應(yīng)染色體探針的檢測效率大幅降低，NA分型比例極大增加，且多數(shù)NA分型在2條不同的外源染色體間顯示多態(tài)；相同探針對(duì)2條外源染色體的檢測效率不同，小麥6A探針可以更好地檢測6V#2，而小麥6D探針可更好檢測6V#4；在簇毛麥與異代換系6V染色體的一致性分型中，篩選獲得簇毛麥6V特異的SNP標(biāo)記37個(gè)。

小麥；簇毛麥；異代換系；小麥SNP芯片；多態(tài)性

0 引言

【研究意義】簇毛麥（，2n= 14，VV）是小麥的二倍體近緣種屬，耐寒、耐旱，抗全蝕病、眼斑病、黃花葉病、白粉病等多種小麥病害，且籽粒蛋白質(zhì)含量高，是小麥品種改良的重要種質(zhì)資源[1-3]。由于簇毛麥與小麥染色體之間不能自由交換，給育種帶來了極大的困難。基于大數(shù)據(jù)，從DNA水平上分析不同簇毛麥的同源染色體及其與小麥部分同源染色體間的多態(tài)性，為靶向易位設(shè)計(jì)育種提供理論依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】據(jù)報(bào)道，已收集超過300份的簇毛麥種質(zhì)資源，一些不同來源的簇毛麥染色體導(dǎo)入小麥基因組中已育成各種異附加系、代換系和易位系[4-6]，其中，簇毛麥6V#2和6V#4染色體對(duì)白粉菌表現(xiàn)明顯的抗性，具有良好的應(yīng)用潛力，因此得到了較為深入的研究。在過去的研究中，基于表型和部分基因序列的比較均表明6V#2和6V#4染色體存在差異。如攜帶不同來源6V染色體的代換系和易位系對(duì)小麥癭螨及其傳播的病毒的抗性表現(xiàn)不同[7]；基于表達(dá)序列的引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增片段的比較，表明6V#2和6V#4上某些基因序列存在差異，并開發(fā)了可用于區(qū)分6V#2和6V#4的特異PCR標(biāo)記，其中，劉暢等[8]開發(fā)的P461-5a在6V#2和6V#4間存在擴(kuò)增片段長度的多態(tài)性，而P259-1只能檢測6V#4；Li等[9]基于轉(zhuǎn)錄組測序序列開發(fā)了25個(gè)6V特異性標(biāo)記，3個(gè)在6V#2和6V#4間存在多態(tài)性；BIE等[10]開發(fā)了可同時(shí)鑒定6AS/6DS/6V#2S/6V#4S的多態(tài)性標(biāo)記MBH1；陳竟男等[11]利用238對(duì)EST-SSR引物對(duì)小麥中國春與簇毛麥Dv#4和簇毛麥Dv#2的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，47對(duì)在簇毛麥#2和簇毛麥#4之間存在多態(tài)性。最近，MA等[12]觀察到在非易位的完整染色體狀態(tài)下，小麥背景中的簇毛麥6V#2和6V#4染色體中期I不配對(duì)的頻率達(dá)20.24%，且在配對(duì)的二價(jià)體中，形成環(huán)狀二價(jià)體的頻率低于棒狀二價(jià)體，說明染色體6V#2和6V#4在染色體水平上也存在較大差異。但在整條染色體的DNA水平上的差異目前尚缺乏相關(guān)的信息，難以確定簇毛麥6V#2和6V#4染色體之間及其與小麥部分同源染色體之間的多態(tài)性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）分析檢測技術(shù)的迅猛發(fā)展，基于Illumina技術(shù)平臺(tái)的9K和90K高通量SNP芯片以及最新開發(fā)的660K、55K和820K芯片已被應(yīng)用于目標(biāo)基因定位、高密度遺傳圖譜構(gòu)建和群體結(jié)構(gòu)分類等小麥諸多研究領(lǐng)域[13-15]。Raz等[16]利用90K iSelect SNP對(duì)硬粒小麥和野生二粒小麥雜交構(gòu)建的140個(gè)重組自交系（recombinant inbred lines，RILs）進(jìn)行全基因組掃描，構(gòu)建了全長為2 110 cM，包含14 088個(gè)SNP位點(diǎn)的遺傳連鎖圖譜，其中，相鄰標(biāo)記之間的平均距離為0.92 cM。Stuart等[17]對(duì)384HT系列硬粒小麥群體進(jìn)行研究，構(gòu)建了包含1 345個(gè)SNP標(biāo)記的復(fù)合遺傳圖譜。Zhou等[18]利用660K芯片對(duì)2個(gè)異花授粉的二倍體冰草Z1842和Z2098種間雜交產(chǎn)生的F1代以及35個(gè)小麥-冰草附加系/代換系進(jìn)行基因分型，利用分布在跨839.7 cM 7個(gè)連鎖群中的913個(gè)SNP標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，確定了P基因組和小麥基因組之間的同源關(guān)系。曹延杰等[19]利用Illumina 90k iSelect SNP標(biāo)記技術(shù)對(duì)96個(gè)小麥品種進(jìn)行全基因組掃描，表明不同品種間親緣關(guān)系較近，在育種中迫切需要引入新的種質(zhì)資源以拓寬遺傳背景。目前，利用高通量SNP芯片在DNA水平上對(duì)不同來源簇毛麥6V染色體間及其與小麥6A、6D染色體間的多態(tài)性分析鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】不同來源的簇毛麥同源染色體需要在相同代換類型的條件下，才可能利用共同的小麥探針對(duì)其進(jìn)行相互比較，因此，本研究通過分子標(biāo)記和基因組原位雜交技術(shù)，對(duì)2個(gè)不同的異代換系南87-88和RW15雜交的F2群體篩選出的6V#4（6A）異代換系19EL124和6V#2（6D）異代換系19EL134在F3代進(jìn)行確認(rèn)，進(jìn)一步利用小麥55K芯片中的6A、6D探針對(duì)異代換系與相同代換類型的雙親分別進(jìn)行多態(tài)性分析，同時(shí)整合660K芯片上第6同源群探針對(duì)2份簇毛麥的分析結(jié)果，篩選6V染色體特異的標(biāo)記，擬為靶向易位的精準(zhǔn)設(shè)計(jì)育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

源于英國劍橋的簇毛麥Dv#2、6V#2（6A）異代換系南87-88（2n=42=21II）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陳佩度教授惠贈(zèng)。引自俄羅斯的簇毛麥No.1026、6V#4（6D）異代換系RW15（2n=42=21II）、6V#4S·6DL易位系Pm97033和6V#2S·6AL易位系10SR3109以及普通小麥品種宛7107均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所陳孝研究員提供。19EL124和19EL134來自雜交組合南87-88×RW15 F3的2個(gè)株系，系譜號(hào)分別為18GL101-2-5和18GL101-2-29。

1.2 樣本DNA的提取

用植物材料新鮮葉片提取gDNA，方法參照DNA提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）提供的步驟進(jìn)行，并最終稀釋成100 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系見表1，反應(yīng)條件為95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外成像系統(tǒng)下掃描拍照。所用分子標(biāo)記相關(guān)信息列于表2。

1.4 原位雜交

GISH參照WEI等[21]描述的方法，以簇毛麥gDNA作為探針，高溫煮沸打斷的中國春gDNA作為封阻，用地高辛試劑盒標(biāo)記探針（Roche，德國），熒光素異硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）地高辛試劑盒（Roche，德國）檢測雜交信號(hào)，在熒光顯微鏡40×下（BX51，OLYMPUS，日本）觀察拍照。

1.5 芯片分析

取4份異代換系（RW15、南87-88、19EL124、19EL134）和2份簇毛麥（CMM和No.1026）的葉片提取DNA，委托中玉金標(biāo)記（北京）生物技術(shù)股份有限公司分別進(jìn)行55K和660K芯片分析：設(shè)閾值DQC≥0.82，異代換系CR≥94，簇毛麥CR≥60，用Affymetrix（Thermo Fisher）AxiomAnalysisSuite軟件的apt- genotype-axiom、ps-metrics和ps-classification模塊進(jìn)行基因分型分析，對(duì)標(biāo)記類型為otv的標(biāo)記進(jìn)行otv- caller分析后，得到樣品原始的數(shù)字型基因型；利用軟件的apt-format-result模塊得到原始的基因型數(shù)據(jù)。本次分析所用的參考基因組為：IWGSC_RefSeq_v1.0（https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/Assemblies）。

表1 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系

表2 PCR分子標(biāo)記引物序列信息

2 結(jié)果

2.1 19EL124和19EL134的細(xì)胞學(xué)鑒定

以簇毛麥gDNA為探針，對(duì)2個(gè)親本及衍生的19EL124、19EL134的根尖體細(xì)胞進(jìn)行GISH鑒定（圖1），發(fā)現(xiàn)探針的雜交信號(hào)顯示清晰，親本RW15、南87-88及19EL124、19EL134均為帶有2條外源染色體，體細(xì)胞的染色體數(shù)目2n=42的正常整倍體。

2.2 19EL124和19EL134的分子標(biāo)記鑒定

以2個(gè)親本和宛7107、Pm97033、10SR3109為對(duì)照，用11個(gè)特異分子標(biāo)記，包括5個(gè)外源染色體短臂6V#4S特異標(biāo)記6VS-06、6VS-09、6VS-10、6VS-18和P259-1，3個(gè)6V#2S/6#4S共顯性標(biāo)記6VS-12、6VS-15和P461-5a，1個(gè)6V#2S/6#4S/6AS/6DS共顯性標(biāo)記MBH1，1個(gè)外源染色體長臂標(biāo)記6V-1以及1個(gè)小麥6AS/6DS共顯性標(biāo)記N-P5對(duì)新篩選的材料19EL124和19EL134進(jìn)行PCR檢測（圖2），19EL124與RW15有6V#4染色體特異帶而缺失6V#2染色體特異帶，19EL134和南87-88有6V#2染色體特異帶而缺失6V#4染色體特異帶；19EL124和南87-88有6D染色體特異帶而缺失6A染色體特異帶；19EL134和RW15有6A染色體特異帶而缺失6D染色體特異帶。綜上所述，RW15為6V#4（6D）異代換系；南87-88為6V#2（6A）異代換系；19EL124為6V#4（6A）代換系；19EL134為6V#2（6D）代換系。

2.3 6A、6D探針對(duì)雙親南87-88和RW15基因分型的差異

1 177個(gè)高質(zhì)量的6A探針用于檢測分析。如圖3A-a所示，探針的物理位置為1.74—617.99 Mb，涵蓋小麥6A染色體約616.25 Mb的物理區(qū)域，探針平均相距約523.58 kb；1 010個(gè)探針在南87-88和RW15間顯示不同的分型結(jié)果，占6A總探針85.81%。其中包括堿基差異（圖3A-b）及位點(diǎn)缺失差異（圖3A-c和圖3A-d），位點(diǎn)缺失差異是指特定探針對(duì)一方不能進(jìn)行基因分型（not available，NA），而對(duì)另一方可以分型（如6V#4NA6V#2+表示探針不能對(duì)6V#4分型而可對(duì)6V#2分型）。從圖3A-c和圖3A-d可知，較多的6A探針可在含有6A染色體的6V#4（6D）異代換系RW15中正常分型，而相應(yīng)的探針大多對(duì)不含6A染色體的6V#2（6A）異代換系南87-88不能分型。

紅色表示用碘化丙啶（PI）復(fù)染的小麥染色體，箭頭所示黃綠色表示外源染色體。a—d：RW15、南87-88、19EL124和19EL134，2n=42

M：DL2000 marker；1—7：19EL124、19EL134、RW15、南87-88、宛7107、Pm97033和10SR3109

A：6A探針；B：6D探針。a：總探針數(shù)及其在染色體上的分布；b：堿基替換型SNP；c：缺失型SNP（RW15-）；d：缺失型SNP（南87-88-）

479個(gè)高質(zhì)量的6D探針用于檢測分析。如圖3B-a所示，探針物理位置從62.87 kb—473.10 Mb，涵蓋小麥6D染色體約473.03 Mb的物理區(qū)域，探針平均相距約每987.55 kb；其中372個(gè)探針（77.66%）在南87-88和RW15的分型不同。二者的分型差異主要分為堿基替換的差異（圖3B-b）以及NA的差異（圖3B-c和圖3B-d），從圖3B-b和圖3B-c可知，在南87-88中較少出現(xiàn)分型失敗，而6V#4（6D）異代換系RW15，缺失6D染色體，大量6D探針不能在RW15分型。

上述結(jié)果表明，NA可能是替換小麥6A或6D的外源染色體分型的特征，為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，調(diào)查了55K芯片所有探針中NA分型的探針在基因組各染色體的占比（表3和圖4）。結(jié)果表明，在異代換系南87-88和19EL124中，6A的NA分型探針的占比最高，分別為63.21%和68.90%；在異代換系RW15和19EL134中，6D的NA分型探針的占比最高，分別為49.48%和53.44%。與6A、6D探針相比較，其余染色體探針在南87-88、RW15、19EL124和19EL134檢測到的NA數(shù)量較少，占比極低，平均為0.94%。這些結(jié)果與驗(yàn)證的南87-88和19EL124為6A代換系、RW15和19EL134為6D代換系的結(jié)果一致。值得注意的是，盡管19EL124為6A代換系，含有6D染色體，但6D探針檢測到其上的NA占比達(dá)6.89%，高于其他小麥染色體的平均值。

表3 探針在異代換系間檢測到的NA數(shù)量

圖4 28 020個(gè)物理定位的小麥55K探針檢測到的NA在4個(gè)異代換系染色體的占比

2.4 6A、6D探針對(duì)同類型異代換系分型的比較

將6A、6D探針對(duì)19EL124和19EL134與相同代換類型的雙親分型進(jìn)行比較。19EL124與母本南87-88同屬于6A異代換類型，1 177個(gè)6A探針中，有265個(gè)顯示2個(gè)系間分型不同，占6A總探針22.51%。同時(shí)，6A異代換系都含有6D染色體，479個(gè)6D探針中，有72個(gè)在2個(gè)系間表現(xiàn)分型差異，占6D總探針15.03%，表明二者間的6D染色體具有一定的差異。19EL134與父本RW15同屬于6D異代換類型，479個(gè)6D探針中，共80個(gè)探針顯示2個(gè)系間分型不同，占6D總探針16.70%。同時(shí)，6D異代換系都含有6A染色體，1 177個(gè)6A探針檢測到二者間SNP 54個(gè)，占6A總探針的4.56%，說明二者間的6A染色體高度相似。

2.5 6A和6D探針對(duì)6V#2和6V#4的SNP分析

在1 177個(gè)6A探針中，有22.51%顯示6V#2（南87-88）和6V#4（19EL124）間分型的差異（圖5A-a）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其中，僅有22個(gè)（8.3%）堿基替換型差異（圖5A-b），其余是NA的差異，如19EL124與南87-88比較，顯示6V#4NA6V#2+的分型差異有155個(gè)（圖5A-c），而6V#4+6V#2NA的分型差異有88個(gè)（圖5A-d）。這表明了2條外源染色體相比，6A探針可以更多地檢測6V#2。在479個(gè)6D探針中，有80個(gè)（15.03%）探針顯示19EL134和RW15間分型的不同（圖5B-a），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，15個(gè)（18.75%）為堿基替換型的差異（圖5B-b），其余為缺失型差異（圖5B-c和圖5B-d），其中6V#2NA6V#4+和6V#2+6V#4NA的多態(tài)性探針各有42和23個(gè)。與6A探針相比，6D探針可以更多地檢測6V#4。

2.6 660K芯片小麥第6同源群染色體探針對(duì)2份簇毛麥的SNP分析及6V特異標(biāo)記的篩選

用小麥660K芯片第6群染色體的探針分析2份簇毛麥CMM（含有6V#2染色體）和No.1026（含有6V#4染色體）間的SNP（表4），結(jié)果表明，4 796個(gè)6A探針中，1 710個(gè)顯示CMM和No.1026間的分型差異，占6A總探針的35.65%，其中NA分型多態(tài)性探針在6A差異分型中占48.07%，CMM和No.1026各占24.21%和23.86%。14 352個(gè)6B探針中，5 626個(gè)顯示二者間的分型差異，占6B總探針的39.20%，其中NA分型多態(tài)性探針占6B差異分型探針的46.02%，CMM和No.1026各占24.46%和21.56%。3 051個(gè)6D探針中，1 206個(gè)顯示二者間的分型差異，占6D總探針的39.53%，其中NA多態(tài)性探針占6D差異分型探針的39.88%，CMM和No.1026各占20.48%和19.40%?？梢姡?A、6D的NA分型差異探針的比例在2份簇毛麥間是比較接近的。

將用于2份簇毛麥和4份異代換系分析的6A、6D探針進(jìn)行整合，2份芯片中共享的6A探針有395個(gè)，其中65個(gè)探針在CMM和南87-88中顯示一致的分型，61個(gè)在No.1026和19EL124中顯示一致分型，二者共享的探針25個(gè)，占6A總共享探針的6.33%。這些探針在2條外源染色體間有3個(gè)探針顯示SNP，均為NA多態(tài)性，其中CMM有1個(gè)，No.1026有2個(gè)。與2份6D異代換系的6A染色體分型相比，這25個(gè)探針有22個(gè)顯示SNP，占25個(gè)總共享探針的88%。2份芯片中共享的6D探針有231個(gè)，其中CMM和19EL134分型相同的探針有40個(gè)，No.1026和RW15間相同分型的探針數(shù)41個(gè)，二者共享的探針15個(gè)，占6D 231個(gè)總共享探針的6.49%。這些探針在2條外源染色體的分型完全一致，沒有多態(tài)性。但與2份6A異代換系相比，所有分型都不相同，顯示出100%的差異。

A：6A探針檢測6V（6A）異代換系19EL124與南87-88的分型差異，a：總差異探針的分布；b：堿基替換型差異探針的分布；c：缺失型（19EL124-）差異探針的分布；d：缺失型（南87-88-）差異探針的分布。B：6D探針檢測6D異代換系19EL134與RW15，a：總差異探針的分布；b：堿基替換型差異探針的分布；c：缺失型（19EL134-）差異探針的分布；d：缺失型（RW15-）差異探針的分布

表4 660K芯片6A、6D探針對(duì)簇毛麥CMM和No.1026的檢測

2.7 6A和6D探針對(duì)雙親與衍生系中6A與6D染色體的SNP分析

RW15和19EL134都含有6A染色體，6A的探針檢測到二者堿基替換型SNP有17個(gè)，顯示NA多態(tài)性的探針各有18和19個(gè)，各占總探針的1.44%、1.53%和1.61%。南87-88和19EL124中都含有6D染色體，6D探針檢測到二者堿基替換型SNP有38個(gè)，顯示NA多態(tài)性的探針各有7和27個(gè)（圖5A-d），各占總探針的7.93%、1.46%和5.64%。可見，6D染色體在子代與親代間的差異比較明顯。

3 討論

3.1 GISH及染色體特異標(biāo)記鑒定的必要性

GISH是以外源物種的基因組DNA為探針的DNA分子雜交技術(shù)，是鑒定外源染色體最為直觀有效的方法，可鑒定各種附加系、代換系及易位系等材料中的外源染色體狀況。GISH已成功應(yīng)用于鑒定小麥遺傳背景中的簇毛麥、大麥、新麥草、大賴草、黑麥、擬斯卑爾山羊草等外源染色體[22-25]。在2份異代換系的雜種后代分離群體中，筆者曾篩選到缺失6VS標(biāo)記、僅含6VL的材料，說明在小麥-外源異染色體系的雜交過程中，一些外源染色體可能通過著絲粒的錯(cuò)分裂與小麥染色體產(chǎn)生臂間的易位或端體。由于GISH只能檢測到外源染色體，但不能確定具體的外源染色體的身份，在篩選異代換系早期，主要利用了6VS特異的分子標(biāo)記跟蹤6V染色體，本研究利用6V長短臂的分子標(biāo)記及原位雜交相結(jié)合的方法追蹤外源染色體，同時(shí)通過細(xì)胞學(xué)觀察體細(xì)胞染色體數(shù)目，并利用相應(yīng)的6AS、6DS特異分子標(biāo)記確認(rèn)缺失的小麥染色體以鑒定篩選目標(biāo)材料，確保用于芯片分析的材料是準(zhǔn)確的染色體異代換系。

3.2 大量6A和6D探針對(duì)外源染色體分型的失敗，反映了小麥與近緣種部分同源染色體在DNA水平上存在較大差異

本研究利用小麥55K芯片6A和6D上的探針進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)小麥與外源部分同源染色體間極高的差異。6A探針檢測出雙親間的差異實(shí)際上是南87-88中6V#2染色體與RW15中的6A染色體間的多態(tài)性。6D探針檢測出的差異實(shí)際上是南87-88中的6D染色體與RW15中的6V#4染色體間的多態(tài)性，而無論6A或6D探針，絕大多數(shù)的差異屬于小麥染色體可明確分型而外源染色體無法分型的缺失型多態(tài)性。此外，從與660K芯片整合的數(shù)據(jù)中，篩選到40個(gè)簇毛麥與代換系中6V染色體分型一致的6A和6D探針，其中有37個(gè)（92.5%）顯示6V與小麥6A或6D間的SNP，這些結(jié)果表明了小麥染色體和外源部分同源染色體間在DNA水平上存在較大差異，反映了二者具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。NA多態(tài)性探針在整條染色體上較為均勻地分布（圖5）也與整條染色體替換的事實(shí)相符合。這些結(jié)果與Bai等[26]利用660K芯片對(duì)小麥華山新麥草2Ns/2D異代換系H139檢測表明其2D上染色體丟失標(biāo)記率顯著高于對(duì)照7182的結(jié)果極為相似。最近LAUREN等[27]基于35K SNP芯片對(duì)17個(gè)中國春-長穗偃麥草附加系進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)1 594個(gè)標(biāo)記在小麥和長穗偃麥草之間顯示出多態(tài)性。通過Flapjack?分析刪除了497個(gè)錯(cuò)誤標(biāo)記，并移除834個(gè)單分離或分離不一致的標(biāo)記后僅篩選到263個(gè)用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的SNP標(biāo)記。

3.3 同類異代換系間外源同源染色體的NA多態(tài)性，反映了2條不同來源的6V染色體在DNA水平上存在差異

Qi等[28]和Liu等[29]曾報(bào)道，利用6V#3異附加系與小麥6D單體雜交，希望通過雙單體誘導(dǎo)6V#3與6D染色體間發(fā)生羅伯遜易位，但在其后代中選擇到的易位全部發(fā)生在6V#3與6A之間，尚未發(fā)現(xiàn)發(fā)生在預(yù)期的靶標(biāo)染色體之間的例子，作者推測可能與所涉及易位的染色體著絲粒間的親緣關(guān)系或與遺傳背景相關(guān)。在迄今報(bào)道所獲得的易位系中，也只存在6V#2S·6AL和6V#4S·6DL 2種類型，雖然最近通過2對(duì)不同易位系雜交已在其后代中獲得2個(gè)外源染色體臂的重組子[30]。本研究中，2對(duì)不同的外源同源染色體分別取代了相同的小麥染色體，因此，應(yīng)用小麥芯片靶標(biāo)染色體上的探針嘗試對(duì)不同來源的外源染色體進(jìn)行多態(tài)性分析。我們注意到，缺失小麥6A或6D染色體的異代換系，不能被相應(yīng)的小麥SNP芯片上的6A或6D染色體的大多數(shù)探針?biāo)中停琋A比例顯著增加是4份異代換系的共同特征（表3和圖3），2份6A異代換系用6A探針檢測時(shí)有22.51%的探針顯示分型的多態(tài)性，其中91.70%的多態(tài)性分型由NA的差異構(gòu)成；2份6D異代換系用6D探針檢測時(shí)有16.70%的探針顯示分型的多態(tài)性，其中81.25%的多態(tài)性分型由NA的差異構(gòu)成，NA的多態(tài)性表明不同外源染色體DNA水平上存在較大的差異。對(duì)于6A異代換系，與6V#4染色體相比，6A染色體探針可以更多地檢測6V#2染色體；反之，對(duì)于6D異代換系，與6V#2染色體相比，6D染色體探針則可以更多地檢測6V#4染色體。相比之下，660K芯片6A和6D探針對(duì)2份不同簇毛麥的基因分型結(jié)果，NA多態(tài)性的比例較低，占6A和6D染色體總多態(tài)性探針的48.07%和39.88%，說明不同遺傳背景對(duì)基因分型存在影響。

異源六倍體小麥基因組含有3個(gè)基因序列和排序十分近似的亞基因組，存在大量高度相似的同源基因或序列，雖然SNP芯片的探針在設(shè)計(jì)上是染色體特異的和唯一的，但染色體的缺失和異源染色體的替換可能增加了基因分型的復(fù)雜性。本研究由于2組芯片共有且在異代換系和相應(yīng)簇毛麥間分型一致的6A、6D探針數(shù)只有40個(gè)，僅獲得37個(gè)6V染色體特異標(biāo)記，有3個(gè)標(biāo)記可區(qū)分2條外源同源染色體。

3.4 19EL124/19EL134與雙親6A/6D染色體的SNP

6D異代換系19EL134與RW15中，6A染色體間SNP占總探針的4.59%，而6D探針檢測2個(gè)6A異代換系19EL124和南87-88的SNP所占比例達(dá)15.03%。因?yàn)楦副綬W15缺失6D染色體，19EL124的6D染色體理論上來源于母本南87-88，但檢測結(jié)果顯示，南87-88和19EL124中的6D間存在較大的差異，以此聯(lián)想到，在南87-88和RW15的雜種F1減數(shù)分裂中期I，沒有觀察到6A和6D 2個(gè)預(yù)期的單價(jià)體，而是觀察到一個(gè)單價(jià)體和1個(gè)小麥染色體構(gòu)成的三價(jià)體，鑒于其F2代6D的出現(xiàn)頻率高于6A，因而推測6D染色體參與了三價(jià)體的形成[12]。本研究芯片分析的結(jié)果似乎進(jìn)一步支持了這一推斷，由于雜種中6D參與了三價(jià)體的形成，意味著6D染色體發(fā)生了交換和重組，因此，后代的6D染色體與親本的6D染色體間存在明顯的差異。

4 結(jié)論

小麥芯片上的探針對(duì)近緣種簇毛麥部分同源染色體的檢測效率比小麥顯著降低，揭示出2個(gè)屬間具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系；相同染色體探針對(duì)不同的簇毛麥同源染色體的檢測效率不同，6A探針可以更好地檢測6V#2，而6D探針可更好地檢測6V#4；通過簇毛麥與異代換系6V染色體分型的關(guān)聯(lián)分析，篩選獲得6V染色體特異的SNP標(biāo)記37個(gè)。

[1] GREADZIELEWSKA A. The genuspart 2.-a wild species used in wheat improvement. Euphytica, 2006, 152(3): 441-454.

[2] MINELLI S, CECCARELLI M, MARIANI M, DE P C, CIONINI P G. Cytogenetics of×hybrids and derived lines. Cytogenetic and Genome Research, 2005, 109(1/3): 385-392.

[3] ZHANG Q P, LI Q, WANG X Y, WANG H Y, LANG S P, WANG Y N, WANG S L, CHEN P D, LIU D J. Development and characterization of atranslocation line T4VS·4DL conferring resistance to wheat spindle streak mosaic virus. Euphytica, 2005, 145(3): 317-320.

[4] ZHANG R Q, FAN Y L, KONG L N, WANG Z J, WU J Z, XING L P, CAO A Z, FENG Y G., an adult-plant powdery mildew resistance gene introgressed fromchromosome arm 2VL into wheat. Theoretical and Applied Genetics, 2018, 131(12): 2613-1620.

[5] DE P C, VACCINO P, CIONINI P G, PASQQUINI M, BIZZARRI M, QUALSET C O. Wild crop relatives: genomic and breeding resources: cereals. Heidelberg: Springer, 2011: 185-292.

[6] Zhang R Q, Zhang M Y, Wang X E, Chen P D. Introduction of chromosome segment carrying the seed storage protein genes from chromosome 1V ofshowed positive effect on bread-making quality of common wheat. Theoretical and Applied Genetics, 2014, 127(3): 523-533.

[7] LI H J, CONNER R L, CHEN Q, JIA X, LI H, GRAF R J, LAROCHE A, KUZYK A D. Different reactions to the wheat curl mite and Wheat streak mosaic virus in various wheat6V and 6VS lines. Plant Disease, 2002, 86(4): 423-428.

[8] 劉暢, 李仕金, 王珂, 葉興國, 林志珊. 簇毛麥6VS特異轉(zhuǎn)錄序列P21461及P33259的獲得及其分子標(biāo)記在鑒定小麥-簇毛麥抗白粉病育種材料中的應(yīng)用. 作物學(xué)報(bào), 2017, 43(7): 983-992.

LIU C, LI S J, WANG K, YE X G, LIN Z S. Developing of specific transcription sequences P21461 and P33259 on6VS and application of molecular markers in identifying wheat-breeding materials with powdery mildew resistance. Acta Agronomica Sinica, 2017, 43(7): 983-992. (in Chinese)

[9] LI S J, WANG J, WANG K Y, CHEN J N, WANG K, DU L P, NI Z F, LIN Z S, YE X G. Development of PCR markers specific togenome based on transcriptome data and their application in breeding#4 alien chromosome lines. BMC Genomics, 2019, 20: 289.

[10] BIE T D, ZHAO R H, ZHU S Y, CHEN S L, CEN B Q, GAO D R, JIANG Z N, CHEN T T, WANG L, WU R L, HE H G. Development and characterization of marker MBH1 simultaneously tagging genesandconferring resistance to powdery mildew in wheat. Molecular Breeding, 2015, 35(10): 189.

[11] 陳竟男, 馬曉蘭, 王振, 李仕金, 謝皓, 葉興國, 林志珊. 基于簇毛麥No.1026轉(zhuǎn)錄組的SSR序列分析及其PCR標(biāo)記開發(fā). 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 52(1): 6-15.

CHEN J N, MA X L, WANG Z, LI S J, XIE H, YE X G, LIN Z S. ssr sequences and development of pcr markers based on transcriptome ofNo.1026. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(1): 6-15. (in Chinese)

[12] MA X L, XU Z Y, WANG J, CHEN H Q, YE X G, LIN Z S. Pairing and exchanging betweenchromosomes 6V#2 and 6V#4 in the hybrids of two different wheat alien substitution lines. International Journal of Molecular Sciences, 2019, 20(23): 6063.

[13] COLIN R, CAVANAGH, CHAO S M, WANG S C, HUANG B E. Genome-wide comparative diversity uncovers multiple targets of selection for improvement in hexaploid wheat landraces and cultivars.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110(20): 8057-8062.

[14] WANG S C, WONG D B, KERRIE F. Characterization of polyploid wheat genomic diversity using the high-density 90,000 SNP array. Plant Biotechnology Journal, 2014, 12(6): 1-10.

[15] SRBHI G, STELLA H E, YANG C Y, DUNCAN S, STEPHEN A, AMANDA B, PAUL A W, KING L P, KING J L. Detection ofintrogressions in wheat and development of a panel of interspecific introgression lines. Frontiers in Plant Science, 2018, 9: 1565.

[16] RAZ A, MORAN N, TAMAR E, HANAN S. Ultra-dense genetic map of durum wheat×wild emmer wheat developed using the 90K iSelect SNP genotyping assay. Molecular Breeding, 2014, 34(4): 1549-1562.

[17] STUART J, LUCAS, AYTEN S, SELAMI Y. High-throughput SNP genotyping of modern and wild emmer wheat for yield and root morphology using a combined association and linkage analysis. Functional and Integrative Genomics, 2017, 17(6): 667-685.

[18] ZHOU S G, ZHANG J P, CHE Y G, LIU W H, LU Y Q, YSNG X M, LI X Q, JIA J Z, LIU X, LI L H. Construction ofgenetic linkage maps using a wheat 660K SNP array reveals a homoeologous relationship with the wheat genome. Plant Biotechnology Journal, 2018, 16(3): 818-827.

[19] 曹廷杰, 謝菁忠, 吳秋紅, 陳永興, 王振忠, 趙虹, 王西成, 詹克慧, 徐如強(qiáng), 王際睿, 羅明成, 劉志勇. 河南省近年審定小麥品種基于系譜和SNP標(biāo)記的遺傳多樣性分析. 作物學(xué)報(bào), 2015, 41(2): 197-206.

CAO T J, XIE J Z, WU Q H, CHEN Y X, WANG Z Z, ZHAO H, WANG X C, ZHAN K H, XU R Q, WANG J R, LUO M C, LIU Z Y. Genetic diversity of registered wheat varieties in henan province based on pedigree and single-nucleotide polymorphism. Acta Agronomica Sinica, 2015, 41(2): 197-206. (in Chinese)

[20] Li S J, Lin Z S, Liu C, Wang K, Du L P, Ye X G. Development and comparative genomic mapping of6V#4S- specific PCR markers using transcriptome data., 2017, 130(10): 2057-2068.

[21] WEI W H, QIN R, SONG Y C, NING S B, GUO L Q, GU M G. Genomic in situ hybridization analysis for identification of introgressed segments in alloplasmic lines from×.Hereditas, 2003, 138(1): 21-26.

[22] 陳佩度, 周波, 齊莉莉, 劉大鈞. 用分子原位雜交(GISH)鑒定小麥-簇毛麥雙倍體、附加系、代換系和易位系. 遺傳學(xué)報(bào), 1995, 22(5): 380-386.

CHEN P D, ZHOU B, QI L L, LIU D J. Identification of wheat-amphiploid, addition, substitution and translocation lines by in situ hybridization using biotin-labelled genomic DNA as a probe. Acta Genetica Sinica, 1995, 22(5): 380-386. (in Chinese)

[23] MUKAI Y, GILL B S. Detection of barley chromatin added to wheat by genomic in situ hybridization. Genome, 1991, 34(3): 448-452.

[24] FRIEBE B, JIANG J, GILL B S, DYCK P L. Radiation-induced nonhomoeologous wheat-intermedium chromosomal translocations conferring resistance to leaf rust. Theoretical and Applied Genetics, 1993, 86(2/3): 141-149.

[25] 趙萬春. 普通小麥-簇毛麥整臂互補(bǔ)易位系T1DS·1AL和T1DL·1VS的創(chuàng)制、鑒定和性狀評(píng)估[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2010.

ZHAO W C. Development, identification and characterization of two newconpensation robersonian translocation lines T1DS·1AL and T1DL·1VS[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2010. (in Chinese)

[26] BAI S S, YUAN F P, ZHANG H B, ZHANG Z Y, ZHAO J X, YANG Q H, WU J, CHEN X H. Characterization of theKeng 2Ns/2D substitution line H139: A novel germplasm with enhanced resistance to wheat take-all. Frontiers in Plant Science, 2020, 11: 233.

[27] LAUREN B, SURBHI G, YANG C Y, STELLA H E, DUNCAN S, STEPHEN A, AMANDA J, ALEXANDRA M, PRZEWIESLIK A, PAUL A, KING L P, KING J L. Exploiting the genome ofto expand the gene pool of hexaploid wheat. Theoretical and Applied Genetics, 2020, 133(7): 2213-2226.

[28] Qi L L, PUMPHRAY M O, FRIEBE B, ZHANG P, QIAN C, BOWDEN R L, ROUSE M N, JIN Y, GILL B S. A novel Robertsonian translocation event leads to transfer of a stem rust resistance gene () effective against race Ug99 frominto bread wheat. Theoretical and Applied Genetics, 2011, 123(1): 159-167.

[29] LIU C, QI L L, LIU W X, ZHAO W C, JAMIE W, BERND F, BIKRAM S G. Development of a set of compensating-robertsonian translocation lines. Genome, 2011, 54(10): 836-844.

[30] ZHANG R H, LIU B L, JIANG Z N, CHEN T T, WANG L, JI Y Y, HU Z B, HE H G, BIE T D. Comparative analysis of genetic effects of wheat-translocations T6V#2S·6AL and T6V#4S·6DL. Frontiers in Plant Science, 2019, 138: 503-512.

Polymorphism Analysis Among Chromosomes of6V#2 and 6V#4 and Wheat 6A and 6D based on wheat SNP Chip

XU ZhiYing1,2, WANG BaiCui2, MA XiaoLan2, JIA ZiMiao2, YE XingGuo2, LIN ZhiShan2, HU HanQiao1

1College of Coastal Agricultural Sciences, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, Guangdong;2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081

【】 The polymorphism among the chromosomes of6V#2 and 6V#4 and their wheat homeologous 6A and 6D in the DNA level was compared in this study based on big data to provide a theoretical basis for precision designing breeding of wheat-targeted chromosome translocation.【】A 6V#4(6D) alien disomic substitution line RW15 was crossed with a 6V#2(6A) alien disomic substitution line Nan 87-88, and their F2plants were detected using 6V#4S/6V#2S/6AS/6DS/6VL specific molecular markers, and the new types of substitution lines were confirmed in F3employing the above-mentioned markers again as well as genomichybridization (GISH) technique. Subsequently, polymorphism among the targeted chromosomes in the new types of the substitution lines and their parents Nan 87-88 and RW15 were detected by the probes of 6A and 6D-specific in the wheat 55K chip, and combined with the results of SNP analysis of two accessions ofwith 6A and 6D probes in 660k chip to screen 6V specific SNPs. 【】 GISH analysis showed that 19EL124 and 19EL134 had 42 chromosomes including two complete foreign chromosomes in the somatic cells of root tips. Identification using molecular markers showed that 19EL124 had 6V#4S/6DS and missed 6V#2S/6AS specifically amplified bands, while 19EL134 displayed 6V#2S/6AS distinctive bands and lacked 6V#4S-specific bands; both 19EL124 and 19EL134 contained 6VL specific amplified bands, which confirmed that 19EL124 is a 6V#4(6A) disomic substitution line, and 19EL134 is a 6V#2(6D) disomic substitution line. The results of 55k chip showed that the detected efficiency of the key chromosome probes in the alien substitution lines was significantly lower than that of other chromosome probes, and the detected efficiency of different lines in the same type of substitution was also different. Among the 1 177 probes of 6A, the 6A substitution line Nan87-88 and 19EL124 could not be genotyped by 63.21% and 68.90% of the probes, respectively. And the polymorphism between 6V#2 and 6V#4 was detected by 22.51% of the probes. Among the 479 probes of 6D, 49.48% of the probes could not identify the 6D substitution line RW15, and 53.44% could not genotype the 6D substitution line 19EL134. the polymorphism between 6V#2 and 6V#4 was indicated by 16.70% of the 6D probes, there were 23 and 42 probes that could only detect 6V#2 and 6V#4 chromosome, respectively. Twenty-two and fifteen 6V specific SNPs were screened from 395 6A and 231 6D probes through integrating the same genotypes detected by probes which were shared by 55k and 660k chips in this study, and three of them showed polymorphism between 6V#2 and 6V#4 chromosomes. 【】 The detection efficiency of the wheat chromosome probes was greatly reduced when the target wheat chromosome was replaced by the alien chromosome, and the proportion of NA genotyping was greatly increased, and most of the NA genotypes showed polymorphism between the two different alien chromosomes in the same type of substitution. the detection efficiency of probe for two alien chromosomes in the same type of alien substitution lines was different, wheat 6A probe could detect 6V#2 better, and wheat 6D probe could detect 6V#4 better. thirty-seven SNP markers of 6V specific were obtained base on the association analysis of 6V genotyping betweenand the alien substitution lines.

wheat;; alien disomic substitution; wheat SNP chip; polymorphism

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.08.001

2020-08-24；

2020-10-28

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0102002）

許志英，E-mail：13414916566@163.com。通信作者胡漢橋，E-mail：huhanqiao@sina.com。通信作者林志珊，E-mail：linzhishan@caas.cn

（責(zé)任編輯 李莉）