趙珂，鄭林，杜美霞，龍俊宏，何永睿，陳善春，鄒修平

柑橘SAR及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因在黃龍病菌侵染中的響應(yīng)特征

趙珂，鄭林，杜美霞，龍俊宏，何永睿，陳善春，鄒修平

西南大學(xué)/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所/國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心/國(guó)家柑桔品種改良中心，重慶 400712

柑橘系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）在柑橘抗黃龍?。℉uanglongbing，HLB）過(guò)程中起著重要作用。水楊酸（SA）和水楊酸甲酯（MeSA）信號(hào)互換是激活植物SAR的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，但其在抗HLB危害中的作用依然不清楚?！尽恳愿涕貶LB不同耐病品種為材料，研究柑橘SAR及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵酶基因（salicylic acid binding protein 2）在HLB 病原菌‘Liberibacter asiaticus’（CLas）侵染中的響應(yīng)特征，了解柑橘SAR及響應(yīng)CLas侵染的作用。從SAR Marker基因、、表達(dá)、活性氧H2O2水平和淀粉含量變化等方面分析CLas侵染、外施SA和MeSA調(diào)控柑橘SAR的特征。進(jìn)一步，基于易感HLB錦橙（）和耐HLB酸柚（）感染CLas轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較分析，篩選和克隆響應(yīng)CLas侵染的差異表達(dá)基因；生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)差異基因的生物學(xué)功能；qRT-PCR分析差異表達(dá)基因在錦橙、酸柚和耐HLB馬蜂柑（）中響應(yīng)CLas感染的表達(dá)變化；以錦橙葉片為試材分析差異表達(dá)基因響應(yīng)外源SA和MeSA誘導(dǎo)的表達(dá)特征。SAR Marker基因響應(yīng)CLas表達(dá)分析表明，、和均正向響應(yīng)CLas侵染上調(diào)表達(dá)，和在酸柚和馬蜂柑中表達(dá)水平高于錦橙，特別是葉肉中兩個(gè)基因的表達(dá)水平均顯著高于錦橙；相反，在葉脈中上調(diào)表達(dá)水平明顯高于葉肉，且在錦橙葉脈中表達(dá)水平顯著高于酸柚和馬蜂柑葉脈中。離體模擬SA和MeSA調(diào)控柑橘SAR反應(yīng)顯示，與SA處理相比，MeSA處理明顯誘導(dǎo)、和上調(diào)表達(dá)，同時(shí)非處理部位基因（特別是）表達(dá)水平也明顯上調(diào)。H2O2檢測(cè)結(jié)果表明，外源MeSA誘導(dǎo)非處理部位H2O2積累顯著強(qiáng)于SA。同時(shí)，通過(guò)對(duì)外施MeSA、SA的感病葉片進(jìn)行連續(xù)5周的淀粉含量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MeSA能明顯減少感病葉片中淀粉的積累。進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析表明，4個(gè)SAR關(guān)鍵調(diào)控基因、、、顯著響應(yīng)CLas侵染而差異表達(dá)，且編碼蛋白質(zhì)均含水解活性必需的保守結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR結(jié)果表明，、在耐病品種酸柚和馬蜂柑中受CLas誘導(dǎo)高水平表達(dá)且在葉脈中的表達(dá)水平高于葉肉；和表達(dá)水平變化不明顯。激素誘導(dǎo)結(jié)果顯示，主要響應(yīng)MeSA的誘導(dǎo)表達(dá)，MeSA顯著誘導(dǎo)高水平表達(dá)（＞10倍），且顯著下調(diào)和的表達(dá)（下調(diào)至0 h表達(dá)量的15%—55%）。耐病品種酸柚和馬蜂柑SAR響應(yīng)CLas的反應(yīng)明顯強(qiáng)于易感病品種錦橙，且MeSA在介導(dǎo)柑橘SAR抗病反應(yīng)中起正向調(diào)控作用。SA與MeSA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵酶基因和在柑橘SAR響應(yīng)CLas侵染中起著重要作用，其高水平表達(dá)與柑橘HLB抗性緊密相關(guān)；而且、、在調(diào)控SAR應(yīng)答柑橘CLas侵染中可能起著關(guān)鍵的協(xié)同作用。

柑橘黃龍?。豁g皮部桿菌亞洲種；系統(tǒng)獲得性抗性；水楊酸；水楊酸甲酯；；基因表達(dá)

0 引言

【研究意義】黃龍?。℉uanglongbing，HLB）是世界柑橘生產(chǎn)上最具毀滅性的病害[1]，目前已危害50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的柑橘產(chǎn)業(yè)[2]。HLB在我國(guó)大部分柑橘產(chǎn)區(qū)發(fā)生，嚴(yán)重制約了我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)的生存與健康發(fā)展[3]。在我國(guó)分布的黃龍病菌為韌皮部桿菌屬亞洲種（‘Liberibacter asiaticus’，CLas）。迄今，柑橘HLB病原尚無(wú)法人工分離培養(yǎng)，這嚴(yán)重阻礙了病原菌與寄主互作機(jī)制的研究，致使柑橘HLB防控技術(shù)和抗病育種研究進(jìn)展十分緩慢。前期研究表明，植物系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）韌皮部長(zhǎng)距離傳輸信號(hào)水楊酸甲酯（methyl salicylate，MeSA）在介導(dǎo)柑橘HLB耐性中起重要作用[4]，因此，以易感HLB錦橙、耐HLB酸柚、馬蜂柑葉片為材料，探究柑橘SAR及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵酶基因在CLas侵染中的響應(yīng)特征，可為柑橘抗病育種提供新思路和新基因資源?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】SAR是一種植物抵御病原菌侵染的主動(dòng)防御機(jī)制，具有廣譜抗病性[4]。植物受到病原菌侵染時(shí)，水楊酸（salicylic acid，SA）的合成激活下游防御基因的表達(dá)，從而引發(fā)局部獲得性抗性（local acquired resistance，LAR），再通過(guò)長(zhǎng)距離信號(hào)傳導(dǎo)，引發(fā)植株的SAR[5]。近年來(lái)，從病原和寄主兩方面入手廣泛研究了柑橘應(yīng)答黃龍病菌侵染的分子基礎(chǔ)[6-12]，發(fā)現(xiàn)黃龍病菌通過(guò)抑制寄主SAR來(lái)促進(jìn)柑橘感病；SAR介導(dǎo)的基礎(chǔ)抗性與柑橘品種HLB耐性緊密相關(guān)。在甜橙中超量表達(dá)擬南芥SA信號(hào)途徑關(guān)鍵基因，激活寄主SAR反應(yīng)，顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)HLB的抗性[13]。SA在SAR反應(yīng)中起著核心作用，當(dāng)病原菌入侵時(shí)，侵染部位合成的SA通過(guò)SA信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活非侵染部位SAR，其中MeSA是SA信號(hào)通過(guò)韌皮部長(zhǎng)距離傳遞的關(guān)鍵信使，在激活SAR反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用[14]。研究表明，MeSA無(wú)任何生物學(xué)功能，必須在非侵染部位轉(zhuǎn)換為SA才能有效激活SAR反應(yīng)[15-17]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，柑橘SA信號(hào)途徑可能通過(guò)MeSA信使正向調(diào)控寄主響應(yīng)黃龍病菌侵染[18]，但其關(guān)鍵基因和響應(yīng)的確切機(jī)制有待解析。水楊酸甲酯酶SABP2是MeSA向SA轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，是SA激活SAR所必需的[19]。SABP2為水解酶超家族的一員，其活性位點(diǎn)為第81位的絲氨酸（Ser-81）、第238位的組氨酸（His-238）、第210位的天冬氨酸（Asp-210），這3個(gè)核心保守氨基酸形成催化三聯(lián)體，使得SABP2具有MeSA酯酶活性和SA的高親和性；同時(shí)第13位的丙氨酸（Ala-13）若突變，對(duì)SABP2的SA高親和力具有較大影響[20-21]。在楊樹(shù)中超量表達(dá)能夠顯著提高植株對(duì)潰瘍病的抗性[22]；沉默后，煙草即喪失了對(duì)煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）的局部和系統(tǒng)性抗性[23]。SAR的發(fā)生伴隨著系統(tǒng)性SA含量的增加和病程相關(guān)（pathogenesis-related，PR）蛋白基因的表達(dá)[24]。PR蛋白能同時(shí)在植物受侵染的和未發(fā)生侵染部位積累，進(jìn)而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生超敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR）并導(dǎo)致局部細(xì)胞死亡，限制病原物擴(kuò)散，從而使植物產(chǎn)生SAR[25]。同時(shí)，研究表明活性氧（reactive oxygen species，ROS）在SAR建成中起著重要作用[26]。SA的積累會(huì)抑制過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）的活性，從而導(dǎo)致過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）的積累，誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前鮮有MeSA在柑橘與黃龍病菌互作中的功能報(bào)道，未見(jiàn)關(guān)鍵基因在柑橘中調(diào)控MeSA應(yīng)答病原菌侵染的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】解析柑橘不同抗/耐品種SAR應(yīng)答CLas的特征，在此基礎(chǔ)上，篩選和克隆響應(yīng)CLas侵染的關(guān)鍵基因，解析其響應(yīng)的表達(dá)特征，為深入研究柑橘M(fèi)eSA信號(hào)途徑響應(yīng)CLas侵染提供候選基因。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年3月至2020年1月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所國(guó)家柑桔品種改良中心完成。

1.1 材料

柑橘易感病品種錦橙（）及耐病品種酸柚（）、馬蜂柑（）均取自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所改良中心溫室，CLas材料取自廣西感病果園。大腸桿菌（）感受態(tài)細(xì)胞DH5、T克隆載體pGEM-T Easy、DNaseI（RNase-free）和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；植物總RNA提取試劑盒和植物DNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒購(gòu)自NovoProtein公司；H2O2含量試劑盒購(gòu)自上海優(yōu)選生物公司；淀粉含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京金克隆公司；SA、MeSA均為實(shí)驗(yàn)室配制，配制濃度分別為10 μmol·L-1、0.1 mmol·L-1[27]。

1.2 CLas侵染

嫁接傳毒參照Z(yǔ)ou等[28]的方法進(jìn)行。對(duì)成熟度一致的一年生健康錦橙、酸柚、馬蜂柑嫁接病原材料，3個(gè)月后提取葉脈DNA。利用引物進(jìn)行CLas常規(guī)PCR檢測(cè)（表1）。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的植株用于下一步研究。

1.3 柑橘DNA和RNA的提取

用植物DNA快速提取試劑盒提取感病錦橙葉脈DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以獲得純度高、完整性好且無(wú)RNA污染的DNA，微量分光光度計(jì)檢測(cè)各樣品DNA濃度，并稀釋至50 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用植物總RNA快速提取試劑盒提取錦橙葉片RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以獲得純度高、完整性好且未降解的RNA，微量分光光度計(jì)檢測(cè)各樣品RNA濃度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4 柑橘SABP2的篩選與克隆

以本實(shí)驗(yàn)前期構(gòu)建的CLas感染錦橙和酸柚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選差異表達(dá)基因，并從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)甜橙基因組數(shù)據(jù)庫(kù)CAP（http://citrus.hzau. edu.cn/cgi-bin/orange/search）[29]中調(diào)取差異基因的編碼序列（CDS）和氨基酸序列，然后以煙草、擬南芥、馬鈴薯等SABP2氨基酸序列為參考，比對(duì)篩選。根據(jù)CDS序列設(shè)計(jì)引物（表1），以感染CLas錦橙葉脈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因編碼序列。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3 min，94℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸3 min，4℃保存；PCR產(chǎn)物連接pGEM-T easy載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

表1 普通PCR引物序列

1.5 活性氧H2O2含量測(cè)定

采成熟度一致的一年生野生型錦橙葉片，經(jīng)自來(lái)水沖洗干凈后，用70%的無(wú)水乙醇滅菌3—5 s，再用無(wú)菌水沖洗，用滅菌濾紙吸干表面水分，將離體葉片浸泡在濃度為10 μmol·L-1的SA溶液、無(wú)菌水、0.1 mmol·L-1的MeSA溶液中，處理端與非處理端于0、6、12、24 h取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取3片葉，分別加入1 mL丙酮，研磨成勻漿后備用。利用H2O2含量測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.6 淀粉含量測(cè)定

采經(jīng)檢測(cè)已帶有HLB毒源的錦橙葉片，經(jīng)自來(lái)水沖洗干凈后，用70%的無(wú)水乙醇滅菌3—5 s，再用無(wú)菌水沖洗，用滅菌濾紙吸干表面水分，離體葉片分別噴施無(wú)菌水、10 μmol·L-1的SA、0.1 mmol·L-1的MeSA，每周噴施一次。每周無(wú)菌水、SA、MeSA處理各取3片葉，利用淀粉含量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行感病后葉片的淀粉含量測(cè)定。

1.7 激素處理

采成熟度一致的一年生野生型錦橙葉片經(jīng)自來(lái)水沖洗干凈后，用70%的無(wú)水乙醇滅菌3—5 s，再用無(wú)菌水沖洗，用滅菌濾紙吸干表面水分，離體葉片的葉尖處分別浸泡在濃度為10 μmol·L-1的SA溶液、無(wú)菌水、0.1 mmol·L-1的MeSA溶液中，處理端與非處理端于0、6、12、24 h取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取3片葉，一部分液氮速凍備用，一部分加入1 mL丙酮，研磨成勻漿后備用。

采相同成熟度的一年生野生型錦橙葉片，經(jīng)自來(lái)水、無(wú)菌水分別清洗后，用滅菌濾紙吸干表面水分。用打孔器將葉片打成直徑為7 mm的葉圓片，分別浸泡在無(wú)菌水、濃度為10 μmol·L-1的SA、0.1 mmol·L-1的MeSA溶液中，于 0、12、24、36、48 h取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取15片葉圓片，液氮速凍，提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 基因表達(dá)的qRT-PCR分析

利用ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR。利用NCBI中Primer Blast在線設(shè)計(jì)定量引物（表2）。并以甜橙為內(nèi)參基因，PCR反應(yīng)體系12 μL：6 μL 2×SYBRGreen熒光染料、4.4 μL H2O、0.3 μL 10 mmol·L-1引物、1 μL cDNA；反應(yīng)程序：95℃ 5 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。外源MeSA誘導(dǎo)SAR相關(guān)基因表達(dá)、CLas侵染誘導(dǎo)的基因表達(dá)以及激素誘導(dǎo)的基因表達(dá)分析均為每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次平行樣重復(fù)。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算（ΔCt=Ct-Ct）。Excel處理數(shù)據(jù)，SPSS 2.0進(jìn)行差異顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

表2 qRT-PCR所用引物序列

2 結(jié)果

2.1 柑橘SAR響應(yīng)CLas侵染特征分析

為了探討不同耐病品種SAR響應(yīng)CLas侵染的反應(yīng)特征，分析了SAR Marker基因、和在錦橙、酸柚、馬蜂柑中受CLas侵染的表達(dá)特征。qRT-PCR結(jié)果顯示，在錦橙中受CLas侵染誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)；、在酸柚和馬蜂柑中受CLas侵染誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，3個(gè)基因均明顯響應(yīng)CLas侵染誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。在易感病錦橙中表達(dá)水平顯著高于耐病品種酸柚和馬蜂柑，且3個(gè)品種中在葉脈中表達(dá)水平顯著高于其葉肉。相反，在耐病品種酸柚和馬蜂柑中表達(dá)水平顯著高于易感病錦橙，而且其表達(dá)水平在3個(gè)品種葉肉中均顯著高于其葉脈。在酸柚和馬蜂柑中特別是葉肉組織中表達(dá)水平顯著高于錦橙（圖1）。結(jié)果顯示耐病酸柚和馬蜂柑中SAR響應(yīng)CLas侵染明顯強(qiáng)于易感病錦橙。

2.2 外施MeSA對(duì)錦橙SAR反應(yīng)的影響

為研究外源MeSA對(duì)柑橘SAR的影響，以水和SA為對(duì)照，分析了外源MeSA誘導(dǎo)錦橙SAR相關(guān)基因表達(dá)和活性氧H2O2積累情況。與SA處理相比，在處理端，MeSA處理均上調(diào)、和的表達(dá)；在非處理端，受MeSA處理表達(dá)水平變化不明顯，但上調(diào)表達(dá)，特別是表達(dá)水平顯著上調(diào)。該結(jié)果表明外源MeSA能激活系統(tǒng)部位SAR反應(yīng)（圖2）。

MeSA、SA和水處理均誘導(dǎo)H2O2增加。在處理端，SA處理6 h時(shí)H2O2含量顯著低于水對(duì)照，但其他時(shí)間點(diǎn)MeSA、SA誘導(dǎo)的H2O2積累與水對(duì)照無(wú)明顯差異。在非處理端，MeSA處理6、12、24 h時(shí)，H2O2含量均顯著高于水對(duì)照，SA僅在6 h時(shí)誘導(dǎo)H2O2積累顯著高于水對(duì)照，其余時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯差異（圖3）。結(jié)果顯示，外源MeSA誘導(dǎo)非處理端H2O2積累強(qiáng)于SA，外施MeSA能顯著促進(jìn)柑橘SAR反應(yīng)。

JC：錦橙Jincheng；SP：酸柚Sour pomelo；MFG：馬蜂柑Kaffir lime。柱上不同大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別表示基因在葉脈和葉肉的表達(dá)量在不同品種之間差異顯著（P＜0.05）Different capital and lowercase letters on the bars indicate that gene expression levels in vein and mesophyll are significantly different among different varieties (P＜0.05)。圖6同The same as Fig. 6

2.3 外施MeSA、SA對(duì)感病葉片中淀粉積累的影響

柑橘感染CLas后淀粉含量是其癥狀程度的一個(gè)重要生理指標(biāo)。因此，進(jìn)一步分析了外施MeSA對(duì)感病錦橙葉片中淀粉含量的影響。如圖4所示，5周后，與水處理相比，MeSA、SA處理均使錦橙感病葉片中淀粉含量顯著下降，表明外施MeSA抑制了感病葉片中淀粉的積累。

2.4 CsSABP2的克隆與生物信息學(xué)分析

為了深入了解MeSA應(yīng)答柑橘HLB侵染機(jī)制，比較分析了易感病錦橙和耐病酸柚感染CLas轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（未發(fā)表），篩選到6個(gè)功能注釋為的差異表達(dá)基因（表3）。和在兩個(gè)品種中均上調(diào)表達(dá)；在酸柚中上調(diào)表達(dá)，而在錦橙中下調(diào)表達(dá)；在錦橙中上調(diào)表達(dá)，而在酸柚中下調(diào)表達(dá)；和僅在錦橙中差異上調(diào)表達(dá)，酸柚中無(wú)變化。

處理端和非處理端分別指同一葉片中激素處理部位和非處理部位，圖3同。相對(duì)表達(dá)量以水對(duì)照進(jìn)行計(jì)算。柱上不同大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別表示基因表達(dá)量在MeSA、SA處理下差異顯著（P＜0.05）The treatment site and non-treatment site refer to hormone treated and non-treated sites in the same isolated leaf, the same as Fig. 3. The relative expression is calculated by using water as a control. Different capital and lowercase letters on the bars indicate that the gene expression levels are significantly different under MeSA and SA treatment (P＜0.05)

與煙草SABP2（NtSABP2）的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CsSABP2-1、CsSABP2-2、CsSABP2-3、CsSABP2-4蛋白均含有保守的酶活性催化三聯(lián)體核心氨基酸殘基Ser-81、His-238和Asp-210，而CsSABP2-6第81位Ser缺失突變。催化三聯(lián)體的第三個(gè)成員Asp-210位于二級(jí)結(jié)構(gòu)連接鏈5和螺旋E中[20]，CsSABP2-5的二級(jí)結(jié)構(gòu)連接鏈5中有3個(gè)氨基酸缺失突變，預(yù)示CsSABP2-1、CsSABP2-2、CsSABP2-3、CsSABP2-4具有SABP2蛋白酶活性的功能（圖5）。CsSABP2-3、CsSABP2-4第13位氨基酸分別突變?yōu)榻z氨酸、異亮氨酸。

克隆測(cè)序分析顯示，錦橙的cds序列長(zhǎng)分別為804、792、819、828 bp，編碼268、264、273、276個(gè)氨基酸。需指出的是，含有12個(gè)結(jié)合SA的氨基酸殘基，含有10個(gè)，含有9個(gè)，含有2個(gè)（圖5），暗示4個(gè)基因可能具有不同的SA結(jié)合能力。

“*”表示與水對(duì)照的差異顯著性（P＜0.05） “*” indicates significant difference with water control (P＜0.05)

A：水處理Water treatment；B：MeSA處理MeSA treatment；C：SA處理SA treatment。CK均表示健康錦橙葉片CK refers to healthy Jincheng leaves。柱上不同大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別表示淀粉含量在同一處理不同周之間差異顯著（P＜0.05）Different capital and lowercase letters on the bars indicate that starch content is significantly different of different weeks in the same treatment (P＜0.05)

紅色代表相同氨基酸，黑色代表不同氨基酸，黃色代表催化三聯(lián)體，綠色代表SA關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)，藍(lán)色菱形表示結(jié)合SA的殘基，綠色和藍(lán)色箭頭標(biāo)識(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)元素Red represents the same amino acid, black represents different amino acids, yellow represents catalytic triplets, green represents SA key binding sites, blue diamond indicates SA-binding residues, green and blue arrows identify the secondary structural elements

2.5 CsSABP2在不同耐病品種中響應(yīng)CLas侵染的表達(dá)分析

以各品種感病前葉片為對(duì)照，分析了不同品種感病后未顯癥與顯癥葉片不同組織（葉脈、葉肉）中的基因表達(dá)量。無(wú)論顯癥和未顯癥葉片，耐病品種酸柚和馬蜂柑中和表達(dá)量均顯著高于易感病品種錦橙。未顯癥葉片中，在3個(gè)品種葉脈中的表達(dá)量均高于葉肉；顯癥葉片中，在酸柚和馬蜂柑的葉脈中表達(dá)水平高于葉肉，錦橙中無(wú)明顯差異。對(duì)于，3個(gè)品種葉脈中基因表達(dá)水平均高于葉肉。在錦橙中表達(dá)水平高于酸柚和馬蜂柑，其中，錦橙顯癥葉片中，在葉肉中表達(dá)量為酸柚的15.5倍。也受CLas侵染誘導(dǎo)表達(dá)，但與品種間耐病性無(wú)明顯相關(guān)性（圖6）。結(jié)果表明，相較于易感品種錦橙，在耐病品種酸柚、馬蜂柑中受CLas誘導(dǎo)高水平表達(dá)。

2.6 CsSABP2響應(yīng)SA和MeSA誘導(dǎo)的表達(dá)分析

外施SA誘導(dǎo)4個(gè)基因的表達(dá)變化不明顯。響應(yīng)速度最快，在12 h即達(dá)到最高表達(dá)量，但24、36、48與0 h相比無(wú)明顯差異；其次是，在24 h達(dá)到最高表達(dá)量，同樣，在24、36、48 h與0 h相比無(wú)明顯差異；而和在48 h才到達(dá)峰值（圖7）。

圖6 CsSABP2在不同品種中響應(yīng)CLas感染的表達(dá)

表3 CsSABP2家族在錦橙和酸柚中應(yīng)答CLas侵染的轉(zhuǎn)錄組比較分析

SP：酸柚Sour pomelo；JC：錦橙Jincheng

MeSA處理后，和顯著下調(diào)表達(dá)。而表達(dá)量急劇上升，與0 h相比，在24 h時(shí)上升至36.2倍。響應(yīng)MeSA誘導(dǎo)變化趨勢(shì)不明顯。結(jié)果表明，、、在MeSA信號(hào)調(diào)控中起關(guān)鍵作用（圖8）。

柱上不同字母表示在P＜0.05水平下差異顯著。圖8同Different letters on the bars indicate significant difference at P＜0.05 level. The same as Fig. 8

圖8 MeSA誘導(dǎo)CsSABP2的表達(dá)分析

3 討論

由于CLas專性寄生在柑橘韌皮部，因此，本研究以葉脈和葉肉組織作為CLas侵染過(guò)程中SAR反應(yīng)的侵染部位和非侵染部位，研究SAR響應(yīng)CLas侵染的特征。

Zou等[18]發(fā)現(xiàn)與已感病錦橙相比，耐病酸柚表現(xiàn)出明顯的延遲和較緩和的癥狀，對(duì)CLas生長(zhǎng)的耐受性高于錦橙；而Shokrollah等[30]發(fā)現(xiàn)馬蜂柑對(duì)HLB的耐性也明顯強(qiáng)于甜橙類。筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MeSA介導(dǎo)的SAR反應(yīng)可能在柑橘品種耐性中起正調(diào)控作用[4,18]，但在其他品種中是否有相似機(jī)制，依然不清楚。因此，本研究較詳細(xì)地分析了錦橙、酸柚、馬蜂柑3個(gè)品種SAR響應(yīng)CLas侵染的特征。結(jié)果顯示，耐病酸柚和馬蜂柑中SAR響應(yīng)CLas侵染明顯強(qiáng)于易感病錦橙。這進(jìn)一步暗示，增強(qiáng)SAR抗性反應(yīng)可能是增強(qiáng)柑橘對(duì)HLB耐性的一條有效途徑[18]。SAR Marker基因和在酸柚和馬蜂柑侵染部位葉肉中上調(diào)表達(dá)水平顯著高于葉脈，且顯著高于錦橙；但是在錦橙侵染部位葉脈中高水平表達(dá)，且顯著高于酸柚和馬蜂柑葉脈，而在葉肉中低水平表達(dá)。這種表達(dá)差異強(qiáng)烈暗示在CLas引起的錦橙LAR中起主要作用，而和在CLas引起的酸柚和馬蜂柑SAR中起主要作用。MeSA與柑橘對(duì)HLB的耐受性相關(guān)[18]，本研究中，通過(guò)外施MeSA發(fā)現(xiàn)，MeSA顯著上調(diào)處理端與非處理端SAR Marker基因的表達(dá)；MeSA誘導(dǎo)非處理端H2O2的積累顯著強(qiáng)于SA；MeSA抑制了感病葉片中淀粉的積累。進(jìn)一步表明，MeSA介導(dǎo)的SAR在調(diào)控柑橘HLB抗性中起著重要作用。

是MeSA信號(hào)介導(dǎo)SAR應(yīng)答病原菌侵染的關(guān)鍵酶基因。本研究通過(guò)分析錦橙和酸柚感染CLas轉(zhuǎn)錄組篩選出6個(gè)差異表達(dá)基因，生物信息學(xué)分析表明、、和具有功能。SABP2是可溶性蛋白，與SA的親和力很高，所以即使是在距離被侵染部位較遠(yuǎn)的組織中，當(dāng)SA的濃度在0.5—9.0 μmol·L-1時(shí)，也可以產(chǎn)生有效的結(jié)合[31]。本研究顯示，含有12個(gè)結(jié)合SA的氨基酸殘基，含有10個(gè)，含有9個(gè)，含有2個(gè)。重要的是，和的SA高親和結(jié)合位點(diǎn)Ala-13分別突變?yōu)镾er-13、Ile-13。同時(shí)在SA處理的基因表達(dá)分析中，發(fā)現(xiàn)在12 h就迅速響應(yīng)SA，表達(dá)量達(dá)到最高；其次是，在24 h達(dá)到最高表達(dá)量；而和在48 h才到達(dá)峰值。上述結(jié)果表明，這4個(gè)基因具有不同的SA結(jié)合能力，結(jié)合SA的能力較強(qiáng)，結(jié)合SA的能力較差。SA是脂酶活性的抑制劑，SA與的結(jié)合抑制MeSA向SA的轉(zhuǎn)化[20]，因此，的脂酶活性可能是最弱的，而的脂酶活性可能是最強(qiáng)的。4個(gè)基因的SA結(jié)合能力和脂酶活性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

非侵染部位MeSA積累和向SA的轉(zhuǎn)化是激活SAR的關(guān)鍵。催化MeSA轉(zhuǎn)化為 SA，這對(duì)誘導(dǎo)煙草 SAR是必不可少的[19,32]。在外施激素處理錦橙葉片中，主要響應(yīng)MeSA的誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)，4個(gè)基因在MeSA誘導(dǎo)條件下，呈現(xiàn)不同的表達(dá)譜，特別是和與呈現(xiàn)完全相反的誘導(dǎo)表達(dá)趨勢(shì)。MeSA顯著抑制、的表達(dá)，但明顯激活了的表達(dá)。相似的，CLas感染顯著上調(diào)錦橙特別是葉肉中的表達(dá)，而明顯抑制、表達(dá)。在耐病品種酸柚和馬蜂柑中，CLas抑制的表達(dá)，但顯著激活、的表達(dá)。這些結(jié)果表明，與柑橘感病性相關(guān)，而、與柑橘耐病性相關(guān)，而且三者在應(yīng)答病原菌侵染中可能存在協(xié)調(diào)調(diào)控MeSA信號(hào)傳導(dǎo)作用。這種協(xié)調(diào)關(guān)系不僅反映在轉(zhuǎn)錄水平上，也可能與三者蛋白質(zhì)活性有關(guān)，具有SA高親和、低脂酶活性，具有SA低親和、高脂酶活性，而介于兩者之間。

這種SA親和性和脂酶活性的差異可能在、、協(xié)調(diào)調(diào)控柑橘M(fèi)eSA信號(hào)響應(yīng)CLas侵染中起著關(guān)鍵作用。另外，有研究表明，可能以形成二聚體執(zhí)行功能[20]，因此、、也有可能相互間形成異二聚體協(xié)調(diào)調(diào)控柑橘應(yīng)答CLas。下一步可通過(guò)柑橘轉(zhuǎn)基因等技術(shù)深入解析、、調(diào)控柑橘HLB抗性的功能及其協(xié)調(diào)關(guān)系。

4 結(jié)論

MeSA在介導(dǎo)柑橘SAR抗病反應(yīng)中起正向調(diào)控作用。SA與MeSA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵酶基因和表達(dá)水平與柑橘HLB耐性緊密相關(guān)，而表達(dá)水平與柑橘HLB感病性緊密相關(guān)。、、在調(diào)控SA與MeSA信號(hào)轉(zhuǎn)換中可能起著關(guān)鍵的協(xié)同作用。

[1] ADKAR-PURUSHOTHAMA C R, QUAGLINO F, CASATI P, RAMANAYAKA J G, BIANCO P A. Genetic diversity among ‘Liberibacter asiaticus’ isolates based on single nucleotide polymorphisms in 16S rRNA and ribosomal protein genes. Annals of Microbiology, 2009, 59(4): 681-688.

[2] GOTTAWALD T R. Current epidemiological understanding of citrus huanglongbing. Annual Review of Phytopathology, 2010, 48: 119-139.

[3] 林積秀. 柑橘黃龍病的防治進(jìn)展. 東南園藝, 2018, 6(5): 45-52.

LIN J X. progress on control of citrus Huanglongbing. Southeast horticulture, 2018, 6(5): 45-52. (in Chinese)

[4] 白曉晶, 許蘭珍, 賈瑞瑞, 周鵬飛, 陳敏, 何永睿, 彭愛(ài)紅, 雷天剛, 李強(qiáng), 姚利曉, 陳善春, 鄒修平. 柑橘黃龍病相關(guān)水楊酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與表達(dá)分析. 園藝學(xué)報(bào), 2017, 44(12): 2265-2274.

BAI X J, XU L Z, JIA R R, ZHOU P F, CHEN M, HE Y R, PENG A H, LEI T G, LI Q, YAO L X, CHEN S C, ZOU X P. Cloning and expression analysis of HLB-associated salicylic acid carboxyl methyltransferase gene

[5] MALAMY J, CARR J P, KLESSIG D F, RASKIN I. Salicylic acid: a likely endogenous signal in the resistance response of tobacco to viral infection. Science, 1990, 250(4983): 1002-1004.

[6] DA Gra?a J V, DOUHAN G W, HALBERT S E, KEREMANE M L, LEE R F, VIDALAKIS G, ZHAO H W. Huanglongbing: An overview of a complex pathosystem ravaging the world’s citrus. Journal of Integrative Plant Biology, 2016, 58(4): 373-387.

[7] WANG N, PIERSON E A, SETUBAL J C, XU J, LEVY J G, ZHANG Y Z, LI J Y, RANGEL L T, MARTINS J. TheLiberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual review of phytopathology, 2017, 55: 451-482.

[8] ALBRECHT U, BOWMAN K D. Transcriptional response of susceptible and tolerant citrus to infection withLiberibacter asiaticus. Plant science, 2012, 185/186: 118-130.

[9] WANG Y, ZHOU L, YU X, STOVER E, LUO F, DUAN Y. Transcriptome profiling of Huanglongbing (HLB) tolerant and susceptible citrus plants reveals the role of basal resistance in HLB tolerance. Frontiers in plant science, 2016, 7: 933.

[10] MARTINELLI F, REAGAN R L, URATSU S L, PHU M L, ALBRECHT U, ZHAO W, DAVID C E, BOWMAN K D, Dandekar A M. Gene regulatory networks elucidating huanglongbing disease mechanisms. PloS one, 2013, 8(9): e74256.

[11] CLARK K, FRANCO J Y, SCHWIZER S, PANG Z Q, HAWARA E, LIEBAND T W H, PAGLIACCIA D, ZENG L P, GURUNG F B, WANG P C,. An effector from the Huanglongbing-associated pathogen targets citrus proteases. Nature communications, 2018, 9: 1718.

[12] LI J Y, PANG Z Q, TRIVEDI P, ZHOU X F, YING X B, JIA H G, WANG N A. ‘Liberibacter asiaticus’ encodes a functional salicylic acid (SA) hydroxylase that degrades SA to suppress plant defenses. Molecular plant-microbe interactions, 2017, 30(8): 620-630.

[13] DUTT M, BARTHE G, IREY M, GROSSER J. Transgenic citrus expressing angene exhibit enhanced resistance against Huanglongbing (HLB; citrus greening).PloS one, 2015, 10(9): e0137134.

[14] ZUBIETA C, ROSS J R, KOSCHESKI P, YANG Y, PICHERSKY E, NOEL J P. Structural basis for substrate recognition in the salicylic acid carboxyl methyltransferase family. ThePlant Cell, 2003, 15(8): 1704-1716.

[15] KOO Y J, KIM M A, KIM E H, SONG J T, JUNG C, MOON J K, KIM J H, SEO H S, SONG S I, KIM J K, LEE J S, CHEONG J J, CHOI Y D. Overexpression of salicylic acid carboxyl methyltransferase reduces salicylic acid-mediated pathogen resistance in. Plant Molecular Biology, 2007, 64(1/2): 1-15.

[16] Vlot A C, Liu P P, Cameron R K, Park S W, Yang Y, Kumar D, Zhou F, Padukkavidana T, Gustafsson C, Pichersky E, Klessig D F. Identification of likely orthologs of tobacco salicylic acid-binding protein 2 and their role in systemic acquired resistance in. The Plant Journal, 2008, 56(3): 445-456.

[17] MANOSALVA P M, PARK S W, FOROUHAR F,Tong L, Fry W E, Klessig D F.() is required for systemic acquired resistance in potato. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2010, 23(9): 1151-1163.

[18] ZOU X P, BAI X J, WEN Q L, XIE Z, WU L, PENG A H, HE Y R, XU L Z, CHEN S C. Comparative analysis of tolerant and susceptible citrus reveals the role of methyl salicylate signaling in the response to Huanglongbing. Journal of Plant Growth Regulation, 2019, 38(4): 1516-1528.

[19] SESKAR M, Shulaev V, Raskin I. Endogenous methyl salicylate in pathogen-inoculated tobacco plants. Plant Physiology, 1998, 116(1): 387-392.

[20] FOROUHAR F, YANG Y, KUMAR D, CHEN Y, FRIDMAN E, PARK S W, CHIANG Y, ACTON T B, MONTELIONE G T, PICHERSKY E, KLESSIG D F, TONG L. Structural and biochemical studies identify tobacco SABP2 as a methyl salicylate esterase and implicate it in plant innate immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(5): 1773-1778.

[21] PARK S W, KAIMOYO E, KUMAR D, MOSHER S, KLESSIG D F. Methyl salicylate is a critical mobile signal for plant systemic acquired resistance. Science, 2007, 318(5847): 113-116.

[22] 董慧霞.和基因在楊樹(shù)與潰瘍病菌()互作中的功能分析[D]. 北京: 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院, 2017.

DONG H X. gene function analysis ofandin poplar interactions with[D]. Beijing: Chinese Academy of Forestry, 2017. (in Chinese)

[23] KUMAR D, KLESSIG D F. High-affinity salicylic acid-binding protein 2 is required for plant innate immunity and has salicylic acid-stimulated lipase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003, 100(26): 16101-16106.

[24] 程世亞, 袁澍, 席德慧, 林宏輝. 植物系統(tǒng)獲得性抗性的分子機(jī)理. 生命的化學(xué), 2008, 28(3): 256-259.

CHENG S Y, YUAN S, XI D H, LIN H H. Molecular mechanism of systemic acquired resistance in plant. Chemistry of life, 2008, 28(3): 256-259. (in Chinese)

[25] 佟志鵬, 安夢(mèng)楠, 丁鋮松, 孫慧穎, 梁月. 植物病程相關(guān)蛋白PR-NP24研究進(jìn)展. 分子植物育種, 2019, 17(11): 3542-3548.

TONG Z P, AN M N, DING C S, SUN H Y, LIANG Y. Progress on plant pathogenesis-related protein PR-NP24. Molecular plant breeding, 2019, 17(11): 3542-3548. (in Chinese)

[26] Shine M B, Xiao X Q, Kachroo P, Kachroo A. Signaling mechanisms underlying systemic acquired resistance to microbial pathogens.Plant Science, 2019, 279: 81-86.

[27] 白曉晶.基因在水楊酸信號(hào)響應(yīng)柑橘黃龍病侵染中的功能研究[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2018.

BAI X J. Function of

[28] ZOU X, JIANG X, XU L, LEI T, PENG A, HE Y, YAO L, CHEN S. Transgenic citrus expressing synthesizedB genes in the phloem exhibits decreased susceptibility to Huanglongbing. Plant Molecular Biology, 2017, 93: 341-353.

[29] XU Q, CHEN L L, RUAN X, Chen D, Zhu A, Chen C, Bertrand D, Jiao W B, Hao B H, Lyon M P,. The draft genome of sweet orange (). Nature Genetics, 2013, 45(1): 59-66.

[30] SHOKROLLAH H, ABDULLAH T L, SIJAM K, ABDULLAH S N A, ABDULLAH N A P. Differential reaction of citrus species in Malysia to Huanglongbing (HLB) disease using grafting method. American Journal of Agricultural and Biological Sciences, 2009, 4(1): 32-38.

[31] 賈亞軍, 王曉婷, 許娜, 郭娜, 邢邯. 大豆水楊酸結(jié)合蛋白基因的克隆及功能分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(18): 3580-3588.

JIA Y J, WANG X T, XU N, GUO N, XING H. Cloning and function analysis of salicylic acid binding protein genefrom soybean. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(18): 3580-3588. (in Chinese)

[32] SHULAEV V, SILVERMAN P, RASKIN I. Airborne signalling by methyl salicylate in plant pathogen resistance. Nature, 1997, 385(6618): 718-721.

Response characteristics of plant SAR and its signaling geneto Huanglongbing infection in Citrus

ZHAO Ke, ZHENG Lin, DU MeiXia, LONG JunHong, HE YongRui, CHEN ShanChun, ZOU XiuPing

Citrus Research Institute, Southwest University/Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Citrus Engineering Research Center/National Center for Citrus Varieties Improvement, Chongqing 400712

【】Plant systemic acquired resistance (SAR) plays an important role in citrus against Huanglongbing (HLB).The signal exchange between salicylic acid (SA) and methyl salicylate (MeSA) is a key signaling for activating SAR,but its roles in HLB is still unclear.【】In order to understand regulation mechanisms of citrus SAR in HLB, response characteristics of SAR and its key enzyme gene(salicylic acid binding protein 2) in ‘Liberibacter asiaticus’ (CLas) infection were compared among citrus varieties with different HLB disease-tolerance.【】The response characteristics of citrus SAR in CLas, SA, and MeSA inoculation were determined based on the expression of SAR Marker gene,,, levels of reactive oxygen species (H2O2) and starch. Furthermore, according to comparative transcriptome data between HLB-susceptible variety Jincheng orange (JC,) and HLB-tolerant variety Sour pomelo (SP,), the differentially expressed genes ofs were screened and cloned.the biological function of selected genes was predicted by bioinformatics analysis.qRT-PCR was further used to analyze expression profiles ofs induced by Clas infection in JC, SP and other HLB-tolerant variety Kaffir lime (KL,) and induced by exogenous SA and MeSA in JC variety.【】qRT-PCR analysis showed that,andwere up-regulated in response to CLas infection, and the expression level ofandHormone treatment showed that MeSA treatment obviously induced up-regulated expressions of,andExogenous MeSA induced H2O2accumulation in non-treated sites, which was stronger than that of SA treatment. MeSA significantly reduced the accumulation of starch in Clas-infected leaves during five weeks of hormone treatment.Transcriptome data and bioinformatics analysis showed that,,, andhad significantly different expressions in response to CLas infection, and their encoded proteins contained conserved domains necessary forhydrolysis activity. qRT-PCR showedandwere significantly up-regulated by CLasin the HLB-resistant varieties SP and KL, and the expression level in vein was higher than that in mesophyll. The expression levels ofanddid not change significantly.Hormone induction experiments show thatwas mainly induced by MeSA, and MeSA significantly up-regulatedexpression (>10 times), but significantly down-regulated expressions ofand(down to 15%-55% of the expression at 0 h).【】The SAR response to CLas infection in the HLB-tolerant varieties Sour pomelo and Kaffir lime is significantly stronger than that in HLB-susceptible variety Jincheng orange, and MeSA plays a positive role in regulating citrus SAR against HLB. Its key enzyme genesandplay an important role in SA and MeSA signal transduction responding to CLas infection, and their high-level expressions are closely related to citrus HLB tolerance; and,,may play a key synergistic role in the signal conversion between SA and MeSA responding to CLas infection.

citrus Huanglongbing; ‘Liberibacter asiaticus’ (CLas); systemic acquired resistance (SAR); salicylic acid (SA);methyl salicylate (MeSA);; gene expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.08.006

2020-06-19；

2020-07-24

國(guó)家自然科學(xué)基金（31972393）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0201500）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-26）、廣西創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展專項(xiàng)（桂科AA18118046-6）

趙珂，E-mail：15223141445@163.com。通信作者陳善春，E-mail：chenshanchun@cric.cn。通信作者鄒修平，E-mail：zouxiuping@cric.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）